倪安順 王永春 楊 丹 孫學(xué)書(shū) 葉建仁

(1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037； 2.杭州益森鍵生物科技有限公司 杭州 311100)

松樹(shù)萎蔫病又稱松材線蟲(chóng)病，是由松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一種系統(tǒng)侵染性病害，能短時(shí)間造成松屬(Pinus)樹(shù)種大量萎蔫死亡。該病害起源于北美，目前主要分布在加拿大、墨西哥、美國(guó)、中國(guó)、日本、韓國(guó)、葡萄牙和西班牙等(王曦茁等， 2018)，亞洲是受松材線蟲(chóng)病影響最嚴(yán)重的地區(qū)。我國(guó)于1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)病(孫永春， 1982)，目前已擴(kuò)散至全國(guó)19個(gè)省、731個(gè)縣級(jí)行政區(qū)，發(fā)生面積已超過(guò)180萬(wàn)hm2，探尋有效的防病措施已經(jīng)迫在眉睫。

松材線蟲(chóng)病的防控途徑目前主要有檢疫、監(jiān)測(cè)、疫木除治、媒介昆蟲(chóng)防治、樹(shù)干注射預(yù)防等(葉建仁， 2019)，其中樹(shù)干注射預(yù)防因簡(jiǎn)便高效，有持效性等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用面積愈來(lái)愈大，已經(jīng)成為當(dāng)前防治松材線蟲(chóng)病的重要手段之一。樹(shù)干注射的有效性主要依賴于化學(xué)藥劑在樹(shù)木木質(zhì)部的移動(dòng)(Navarroetal.， 1992)，化學(xué)藥劑在樹(shù)體內(nèi)的運(yùn)輸依靠水的流動(dòng)，化合物的水溶性對(duì)其防治效果尤為重要(Takaietal.， 2001)。目前，用于樹(shù)干注射預(yù)防的化學(xué)藥劑主要是甲維鹽和阿維菌素，在21 ℃時(shí)的水溶性只有10μg·L-1(Cabreraetal.， 2013)，水溶性差可能是制約它們?cè)跇?shù)體內(nèi)發(fā)揮作用的一個(gè)重要因素，長(zhǎng)期使用甲維鹽和阿維菌素也容易使松材線蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性 (Zhaoetal.， 2006)。因此，亟需尋找新的、更加有效的殺線劑應(yīng)用于松材線蟲(chóng)病的預(yù)防實(shí)踐。

氟吡菌酰胺(Fluopyram)是吡啶類殺菌劑，通過(guò)抑制琥珀酸脫氫酶的電子轉(zhuǎn)移而抑制線粒體呼吸，具有廣譜性和內(nèi)吸性，可防治真菌病原菌引起的菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)、白粉病(Erysiphegraminis)和霜霉病(Peronosporaaestivalis)等(Labourdetteetal.， 2010)。近年來(lái)，拜耳作物科學(xué)公司發(fā)現(xiàn)氟吡菌酰胺還具有優(yōu)良的殺線蟲(chóng)活性，并在2015年登記該藥劑在殺線蟲(chóng)方面的應(yīng)用(楊子輝等， 2017)。研究發(fā)現(xiàn)，氟吡菌酰胺對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyneincognita)、小麥孢囊線蟲(chóng)(Heteroderaavenae)、腎型腎狀線蟲(chóng)(Rotylenchulusreniformis)具有良好的殺線效果(遲元?jiǎng)P等， 2019； Faskeetal.， 2015)，但是該藥劑對(duì)于松材線蟲(chóng)的作用效果研究報(bào)道卻極少。此外，氟吡菌酰胺在20℃時(shí)的水溶性為16 mg·L-1(楊子輝等， 2017)，遠(yuǎn)高于甲維鹽和阿維菌素(10μg·L-1)，更易被樹(shù)體吸收運(yùn)輸，有望成為一種良好的樹(shù)干注射預(yù)防松材線蟲(chóng)新藥劑。

不同藥劑復(fù)配使用是延緩線蟲(chóng)抗藥性和提高藥效的一個(gè)重要途徑。本研究通過(guò)對(duì)比2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺復(fù)配藥劑與5%氟吡菌酰胺、5%阿維菌素單獨(dú)施用對(duì)于松材線蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖的影響，來(lái)探究2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺作為一種新型復(fù)配殺線劑在防治松材線蟲(chóng)病方面的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蟲(chóng)源： 試驗(yàn)線蟲(chóng)為南京林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室保存的松材線蟲(chóng)強(qiáng)毒力蟲(chóng)株AMA3蟲(chóng)株。

供試藥劑： 5%氟吡菌酰胺(自配)，5%阿維菌素(自配)，2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺(自配)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)室內(nèi)毒力測(cè)定 采用浸蟲(chóng)法探究3種藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)的室內(nèi)毒殺效果。用貝爾曼漏斗法收集培養(yǎng)在灰葡萄孢菌上的松材線蟲(chóng)，3 500 r·min-1離心3min，沉淀經(jīng)無(wú)菌水沖洗3次，配制成約為2 500條·mL-1線蟲(chóng)液。用無(wú)菌水將3種供試藥劑分別稀釋為5個(gè)質(zhì)量濃度梯度，每個(gè)質(zhì)量濃度為1個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照。將藥劑與蟲(chóng)液體積比1∶9混合加入1.5 mL離心管中，將所有離心管置于 25℃恒溫培養(yǎng)箱中，24 h 后在顯微鏡下觀察并計(jì)算松材線蟲(chóng)的存活與死亡數(shù)。將藥劑浸泡24 h的松材線蟲(chóng)用無(wú)菌水沖洗3次，后置于無(wú)菌水中在25℃恒溫培養(yǎng)箱靜置24 h，觀察線蟲(chóng)復(fù)蘇情況。

對(duì)照死亡率(%)=對(duì)照死亡數(shù)/對(duì)照供試蟲(chóng)數(shù)×100；

校正死亡率(%)=(處理死亡率-對(duì)照死亡率)/

(1-對(duì)照組死亡率)×100。

由于線蟲(chóng)存在假死現(xiàn)象，可對(duì)呈僵直、“C”形或“J”形的線蟲(chóng)用昆蟲(chóng)針?lè)磸?fù)刺激，若仍僵直不動(dòng)，則可判定死亡(龍鼎新等， 2006)。

1.2.2 種群繁殖量的測(cè)定 將灰葡萄孢培養(yǎng) 5～7 天后，采用噴霧法用顯色噴霧器均勻噴施0.5 mL質(zhì)量濃度為亞致死濃度LC20的藥劑，對(duì)照組加噴無(wú)菌水。每皿接入約400條松材線蟲(chóng)，置于 25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待對(duì)照培養(yǎng)皿中的灰葡萄孢被吃完后即全部停止培養(yǎng)，采用貝爾曼漏斗法分離各皿中的松材線蟲(chóng)，將蟲(chóng)液定容至一定體積，搖勻后吸取 100μL 置于載玻片上，微微加熱至線蟲(chóng)死亡，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)數(shù)量，計(jì)算不同處理中各個(gè)重復(fù)的線蟲(chóng)總數(shù)。每種處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。因氟吡菌酰胺是殺菌劑，再設(shè)一不接松材線蟲(chóng)的對(duì)照組，加噴復(fù)配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺，觀察對(duì)灰葡萄孢抑菌效果。

1.2.3 松材線蟲(chóng)卵的收集與測(cè)定 將培養(yǎng)在灰葡萄孢上的松材線蟲(chóng)用貝爾曼漏斗法漏2 h，收集到15 mL離心管內(nèi)，3 500 r·min-1離心3min，去上清。用無(wú)菌水清洗2～3遍，加無(wú)菌水配制成一定濃度的線蟲(chóng)懸浮液。取適量松材線蟲(chóng)懸浮液于3cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放到 25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～12 h，產(chǎn)生大量的松材線蟲(chóng)卵粒并黏附在培養(yǎng)皿底部，將懸浮液連同松材線蟲(chóng)一起輕輕倒掉，用無(wú)菌水沖洗 3～4 次，即可收集獲得松材線蟲(chóng)卵粒。將培養(yǎng)得到的松材線蟲(chóng)卵置于1.0、1.5、2、2.5和3.0 mg·L-15個(gè)不同質(zhì)量濃度藥劑中，分別于24 h和48 h 后，用顯微鏡觀察并記錄卵的孵化情況，每個(gè)處理3次重復(fù)。

孵化率=(松材線蟲(chóng)幼蟲(chóng)數(shù)/

松材線蟲(chóng)幼蟲(chóng)與卵總數(shù))×100。

1.2.4 卵形態(tài)觀察 藥劑處理24 h后，在光學(xué)顯微鏡下，用移液槍將藥劑浸漬下的松材線蟲(chóng)卵挑出放置在載玻片上，滴水潤(rùn)濕后加上蓋玻片，利用蔡司熒光顯微鏡觀察挑出的松材線蟲(chóng)卵形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 溫度梯度試驗(yàn) 將復(fù)配藥劑用無(wú)菌水稀釋為1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg·L-15個(gè)質(zhì)量濃度，置于溫度梯度培養(yǎng)箱中，在15、20、25、30、35℃條件下，24 h 后在顯微鏡下觀察并計(jì)算松材線蟲(chóng)的存活與死亡數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，檢測(cè)其顯著差異性。用 Abbott 公式校正處理組死亡率。用 DPS 軟件和機(jī)率值分析法對(duì)藥劑進(jìn)行毒力回歸分析，計(jì)算LC20值、LC50值及其95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)毒力效果

不同藥劑在不同質(zhì)量濃度下對(duì)松材線蟲(chóng)的致死力見(jiàn)表1。3種藥劑中，復(fù)配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺的室內(nèi)殺線效果最好，LC50值為2.020 8 mg·L-1，LC20值僅在0.447 9 mg·L-1; 其次是5%氟吡菌酰胺，LC50和LC20值分別是21.607 1和8.558 2 mg·L-1; 5%阿維菌素的殺線效果明顯較前2個(gè)藥劑弱，LC50和LC20濃度值分別達(dá)到51.153 6 和12.031 8 mg·L-1。

松材線蟲(chóng)藥劑處理24 h后在無(wú)菌水中復(fù)蘇24 h結(jié)果見(jiàn)表2。2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺、5%阿維菌素、5%氟吡菌酰胺的LC50值分別為2.152 2、55.705 5和22.763 2 mg·L-1，與藥劑處理24 h結(jié)果相近(表2)。

表1 不同藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)毒力分析(24 h)

表2 松材線蟲(chóng)復(fù)蘇24 h后LC50變化(48 h)

2.2 不同藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)繁殖取食影響

在藥劑處理6天后，對(duì)照組1中各培養(yǎng)皿中的灰葡萄孢均已被松材線蟲(chóng)取食完，但藥劑處理組中還可看到灰葡萄孢(圖 1)，且單加噴復(fù)配藥劑未對(duì)灰葡萄孢產(chǎn)生影響(對(duì)照組2)。其中，5%氟吡菌酰胺處理組和復(fù)配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺處理組無(wú)明顯差異(P=0.31)，其余各組間的種群數(shù)量差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)(圖2)。復(fù)配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺對(duì)松材線蟲(chóng)種群數(shù)量的抑制作用最明顯，其次是5%氟吡菌酰胺，抑制效果相對(duì)最差的是5%阿維菌素，3種藥劑處理后的每皿松材線蟲(chóng)種群數(shù)量分別為 (1 425±250)、(1 675±377) 和 (10925±504)條，而對(duì)照組線蟲(chóng)數(shù)量均大于每皿20000條。

本試驗(yàn)測(cè)定松材線蟲(chóng)種群繁殖速率(pf/pi)，結(jié)果顯示，對(duì)照處理組具有較高繁殖速率(50.75)，5%阿維菌素處理組具有中等繁殖速率(27.31)，5%氟吡菌酰胺處理組和復(fù)配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺處理組繁殖速率較低，分別為4.19和3.56(圖2)。

圖1 不同藥劑處理6天后培養(yǎng)皿內(nèi)灰葡萄孢被松材線蟲(chóng)取食面積

圖2 不同藥劑亞致死濃度LC20處理對(duì)松材線蟲(chóng)種群繁殖量和繁殖速率影響

2.3 不同藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)卵孵化率影響

不同藥劑在處理24 h和48 h后對(duì)松材線蟲(chóng)卵孵化率的影響見(jiàn)圖3。在24 h時(shí)，松材線蟲(chóng)在2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺0.5、1、1.5、2、2.5和3 mg·L-1共5個(gè)質(zhì)量濃度的孵化率分別是73.37%、62.23%、42.19%、34.55%、20.32%；5%阿維菌素5個(gè)質(zhì)量濃度處理時(shí)孵化率分別為83.22%、51.87%、39.62%、27.44%、21.36%； 在5%氟吡菌酰胺5個(gè)質(zhì)量濃度處理時(shí)孵化率分別為52.58%、45.00%、36.42%、28.25%、22.89%，均遠(yuǎn)低于對(duì)照組93.88%。48 h時(shí)，卵孵化率均上升，且質(zhì)量濃度越低，上升越明顯。在質(zhì)量濃度1 mg·L-1時(shí)，對(duì)松材線蟲(chóng)卵孵化抑制效果5%氟吡菌酰胺>2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺>5%阿維菌素； 在質(zhì)量濃度3 mg·L-1時(shí)，對(duì)松材線蟲(chóng)卵孵化抑制效果為2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺>5%阿維菌素>5%氟吡菌酰胺。

在不同藥劑10 mg·L-1處理24 h后卵的形態(tài)變化見(jiàn)圖4，對(duì)照組松材線蟲(chóng)卵基本已孵化為二齡幼蟲(chóng)，藥劑處理組卵孵化率均較低。在10 mg·L-1時(shí)，復(fù)配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺處理組松材線蟲(chóng)卵內(nèi)形成多個(gè)液泡與空洞，卵死亡，其他2種藥劑處理組卵雖未孵化，但卵內(nèi)未形成液泡，卵未死亡。

圖3 不同藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)卵孵化率的影響(24 h、48 h)

圖4 不同藥劑10 mg·L-1處理24 h后卵形態(tài)變化

2.4 不同溫度下2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺對(duì)松材線蟲(chóng)致死效果

不同溫度條件下復(fù)配藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)致死效果見(jiàn)圖5，在15、20、25、30、35℃條件下復(fù)配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺的LC50分別為3.644 7、2.959 5、2.020 8、1.850 8、1.744 1 mg·L-1。同一質(zhì)量濃度下，隨著溫度升高，松材線蟲(chóng)的死亡率增加。

圖5 不同溫度下2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺對(duì)松材線蟲(chóng)致死效果

3 討論

3.1 復(fù)配藥劑增效作用

阿維菌素為一種常用的松材線防治劑(談家金等， 2003； Sousaetal.， 2013)，它可以作為樹(shù)干注射劑來(lái)預(yù)防松材線蟲(chóng)，單次注射持效期可達(dá)2年(Lietal.， 2016)。氟吡菌酰胺作為一種新型殺線藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)作用效果的研究較少，在2020年首次報(bào)道其對(duì)松材線蟲(chóng)具有與阿維菌素類似的作用效果(Liuetal.， 2020)，筆者通過(guò)預(yù)試驗(yàn)也證實(shí)了氟吡菌酰胺具有良好的殺線效果。將不同藥劑復(fù)配通常會(huì)對(duì)殺線活性具有增效作用(覃貴勇等， 2018)，將阿維菌素與氟吡菌酰胺復(fù)配對(duì)松材線蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖影響還未有人研究，本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺具有良好的殺線效果，其殺線活性遠(yuǎn)高于氟吡菌酰胺和阿維菌素單一藥劑。

在室內(nèi)殺線蟲(chóng)試驗(yàn)中，3種藥劑殺線效果以2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺>5%氟吡菌酰胺>5%阿維菌素，其致死中濃度(LC50)分別為2.0208、21.6071、51.1536 mg·L-1，本試驗(yàn)測(cè)定出的各藥劑的致死濃度相較于前人的研究結(jié)果(Zhangetal.， 2017)略偏高，這可能與所用松材線蟲(chóng)蟲(chóng)株不同有關(guān)，本研究選用的試驗(yàn)蟲(chóng)株AMA3鑒定為1株強(qiáng)毒松材線蟲(chóng)蟲(chóng)株，該蟲(chóng)株與我國(guó)不同地區(qū)收集蟲(chóng)株相比，其繁殖力與致病力都更高(朱麗華等， 2017)，繁殖力強(qiáng)可能使得該蟲(chóng)株對(duì)藥劑的抗性更強(qiáng)，從而使得致死中濃度偏高。氟吡菌酰胺具有良好的殺線效果，這與前人研究一致(Liuetal.， 2020)。本試驗(yàn)表明，氟吡菌酰胺與阿維菌素的復(fù)配大大增強(qiáng)了殺線效果，具有良好的防治松材線蟲(chóng)病的應(yīng)用前景。

3.2 藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)繁殖產(chǎn)卵影響

在繁殖量試驗(yàn)中，僅在亞致死濃度LC20條件下，3種藥劑就均對(duì)松材線蟲(chóng)繁殖取食產(chǎn)生顯著影響，這證實(shí)了Bi等(2015)的研究成果，其中氟吡菌酰胺和復(fù)配藥劑抑制效果顯著，2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺在質(zhì)量濃度0.447 9 mg·L-1質(zhì)量下就嚴(yán)重抑制了松材線蟲(chóng)的繁殖，阿維菌素對(duì)松材線蟲(chóng)繁殖量抑制效果較差，這可能是因?yàn)榘⒕S菌素的長(zhǎng)期應(yīng)用使得松材線蟲(chóng)已產(chǎn)生抗藥性(Zhaoetal.， 2006； 周利娟等， 2011)的所致。

在松材線蟲(chóng)卵孵化率試驗(yàn)中，3種藥劑均能顯著抑制松材線蟲(chóng)卵的孵化，這與前人研究一致(Liuetal.， 2020； Qietal.， 2006)，3種藥劑整體對(duì)卵孵化抑制效果相近，在質(zhì)量濃度3 mg·L-1質(zhì)量下，24 h后2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺處理組卵孵化率僅為20.32%，說(shuō)明該復(fù)配藥劑在較低質(zhì)量濃度下對(duì)松材線蟲(chóng)卵孵化仍有良好的抑制效果。2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺處理后松材線蟲(chóng)卵內(nèi)形成液泡可能是因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度藥劑破壞了卵細(xì)胞的滲透屏障，卵細(xì)胞破裂死亡，Rajasekharan等(2017)研究發(fā)現(xiàn)5-碘吲哚醌處理松材線蟲(chóng)卵后也具有類似的作用。

3.3 溫度對(duì)松材線蟲(chóng)抗藥性影響

溫度對(duì)松材線蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖影響很大，松材線蟲(chóng)的生長(zhǎng)最適溫度為25℃，低于10℃則不能完成生長(zhǎng)發(fā)育，大于28℃時(shí)繁殖被明顯抑制，大于33℃時(shí)不能繁殖(季英超等， 2021)，在不同溫度下，藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)的毒殺效果不同，筆者通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺殺線效果增強(qiáng)，且在25℃之前，每增加5℃殺線活性提升更快，這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，松材線蟲(chóng)新陳代謝更旺盛，而低溫條件下松材線蟲(chóng)會(huì)進(jìn)入滯育狀態(tài)，脂肪相對(duì)積累率顯著上升(王博文等， 2017)，這使得松材線蟲(chóng)對(duì)與藥劑處理的敏感性下降，存活率上升。

綜上所述，該復(fù)配藥劑可能具有良好的防治松材線蟲(chóng)病的潛力，但2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺作為樹(shù)干注射處理防治松材線蟲(chóng)的實(shí)際應(yīng)用效果尚需進(jìn)一步研究，如需要田間接種試驗(yàn)觀察松樹(shù)存活情況、藥劑在樹(shù)體內(nèi)持效期等。

4 結(jié)論

對(duì)比3種不同殺線藥劑的室內(nèi)殺線效果、對(duì)松材線蟲(chóng)繁殖量和卵孵化率等抑制作用發(fā)現(xiàn)，2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺作為一種新型復(fù)配殺線藥劑，對(duì)松材線蟲(chóng)具有較強(qiáng)的抑制效果，溫度越高，殺線蟲(chóng)效果越好。