韓海霞，游 林，鐘志明，何夢(mèng)夢(mèng)，王 娜，李 爽

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司，新疆和田 848000）

0 引言

【研究意義】肉蓯蓉為列當(dāng)科植物肉蓯蓉（Cistanche deserticolaY. C. Ma）或管花肉蓯蓉（C.tubulosaWight）的干燥帶鱗葉肉質(zhì)莖，我國(guó)主要分布于內(nèi)蒙古、新疆塔里木盆地，俗稱大蕓，其味甘、咸、性溫[1-2]。其主要有效成分為苯乙醇苷類、多糖、總黃酮等[3-4]。肉蓯蓉浸膏制備過程要經(jīng)歷原材料干燥、提取、濃縮、浸膏蒸制等環(huán)節(jié)，研究肉蓯蓉浸膏制備過程的原材料干燥溫度、提取溫度、濃縮濃縮、浸膏蒸制溫度，對(duì)苯乙醇苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷的影響，對(duì)提高肉蓯蓉產(chǎn)品中有效成分含量具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】苯乙醇苷是以β-葡萄糖為基本母核，與α-羥基苯乙基連接形成糖苷鍵或與苯丙烯酸連接形成酯鍵的一類化合物。有很多養(yǎng)生健體的中藥類食材，多數(shù)歸因于其中的苯乙醇苷[5]。苯乙醇苷類化合物如松果菊苷、毛蕊花糖苷也是肉蓯蓉中最主要的活性成分，也是肉蓯蓉中研究報(bào)道最多的一類化合物，目前已被證實(shí)是肉蓯蓉藥用作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[6-7]。在酸、堿、熱、光、金屬離子、生物酶等影響因素存在時(shí)，分子結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生降解或異構(gòu)化，而失效。肉蓯蓉所含的苯乙醇苷類成分易于被其植物體內(nèi)所含的生物酶水解，而降低其含量[8]，有研究報(bào)道了肉蓯蓉切片或加工過程的條件優(yōu)化，盡可能地保護(hù)苯乙醇苷[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前的研究多集中于干燥溫度、提取溫度對(duì)肉蓯蓉有效成分提取率的影響，幾乎沒有肉蓯蓉提取液濃縮溫度、濃縮液蒸制浸膏的溫度對(duì)其中苯乙醇苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷的量的研究文獻(xiàn)，且對(duì)干燥溫度、提取溫度說法不一。需研究肉蓯蓉制備過程中，不同溫度對(duì)苯乙醇苷成分的影響及其抗氧化活性分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量為測(cè)定指標(biāo)，研究肉蓯蓉浸膏制備過程中原材料干燥、提取、濃縮、浸膏蒸制溫度對(duì)其含量的影響，分析各生產(chǎn)環(huán)節(jié)適宜的溫度，為肉蓯蓉生產(chǎn)加工過程中溫度的監(jiān)測(cè)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

管花肉蓯蓉采自新疆和田地區(qū)洛浦縣，由和田帝辰藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；松果菊苷對(duì)照品（批號(hào)：82854-37-3）、毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)：61276-17-3），成都麥德生科技有限公司；甲醇（色譜醇，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）

Agilent-1260 液相色譜儀，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上?；|試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；AL204-IC電子分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；T6新世紀(jì)紫外分可見光光度計(jì)，海門市其林貝爾儀器制造有限公司

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取適量松果菊苷和毛蕊花糖苷對(duì)照品，分別置于10mL容量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 苯乙醇苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)并對(duì)其稍作修改[10]：精密吸取松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，用50%甲醇配成0.004、0.008、0.012、0.016、0.02 mg/mL的系列對(duì)照品溶液，依照紫外-可見分光光度法，分別在330 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制苯乙醇苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 松果菊苷和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：TC-C18 柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇-水溶液（35∶65，v∶v）等度洗脫，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm，進(jìn)樣量為10μL，柱溫30℃。

1.2.3.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取松果菊苷和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為10、20、40、80、160、320μg/mL 混合對(duì)照品溶液，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制松果菊苷和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 不同條件下苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷的測(cè)定

1.2.4.1 肉蓯蓉不同干燥溫度

肉蓯蓉切片，分別在曬干、陰干、40、60、80、100℃下于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥5 h，粉粹備用。稱取肉蓯蓉粉末1.0 g，置于圓底燒瓶中，加入10 mL 50%乙醇（料液比為1∶10），60℃水浴，回流提取40 min，抽濾，濾渣重復(fù)回流提取3 次，合并3次濾液，用50%乙醇定容至50 mL，從中移取二份提取液各200μL，1份置于20 mL 容量瓶，以50%乙醇定容至刻度，搖勻，測(cè)定肉蓯蓉中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量。

1.2.4.2 不同提取溫度

稱取肉蓯蓉粉末5 份，分別在常溫、40、60、70、80℃下，測(cè)定肉蓯蓉中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量。

1.2.4.3 不同濃縮溫度

取肉蓯蓉粉末3.0 g，在80℃下按“1.2.4.1”方法提取，將提取液定容至150 mL，分成5 份，每份30 mL，分別在35、40、50、60 和70℃下濃縮至相同體積，測(cè)定各濃縮液中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷濃度。

1.2.4.4 浸膏的不同蒸制溫度

精密量取等量肉蓯蓉濃縮液5份，分別在40、55、70、85、98℃水浴溫度下，蒸制得到等量浸膏，測(cè)定各浸膏中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量。

1.2.5 肉蓯蓉浸膏體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 肉蓯蓉供試液制備

取肉蓯蓉浸膏和VC適量，以水為溶劑，分別將其制備成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的肉蓯蓉供試品溶液和VC對(duì)照溶液。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考段景峰[11]方法，取肉蓯蓉提取液2 mL，加入0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL，混勻，室溫下靜置30 min，于517 nm處測(cè)吸光度，以VC溶液為陽(yáng)性對(duì)照藥，同法測(cè)其吸光度。

式中，A1：肉蓯蓉提取液+DPPH乙醇溶液；

A2：樣品肉蓯蓉提取液液+無水乙醇；

A0：DPPH+75%乙醇溶液。

1.2.5.3 ABTS自由基清除能力測(cè)定參考段景峰[11]方法，取肉蓯蓉提取液0.8 mL，與3.2 mL ABTS溶液混勻，避光、室溫條件下靜置6 min 后，于734 nm 處測(cè)混合溶液的吸光度，以VC 溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，同法測(cè)其吸光度，按公式（2）計(jì)算ABTS自由基清除率。

式中，A1：肉蓯蓉提取液+ABTS溶液混合液；A2：肉蓯蓉提取液+蒸餾水；

A0：蒸餾水+ABTS溶液混合液。

1.2.5.4 羥基自由基清除能力測(cè)定參考段景峰[11]的方法，取肉蓯蓉提取液1 mL與雙氧水混合，再將1mL 9 mmol/L 水楊酸鈉和1 mL 1.5 mmol/L 硫酸亞鐵分別加入其中，混勻，37℃下振蕩反應(yīng)30 min，于按照紫外-可見光分光光度法，在510 nm處測(cè)定吸光度。

式中，A1：肉蓯蓉提取液+硫酸亞鐵+雙氧水；

A2：肉蓯蓉提取液+硫酸亞鐵+蒸餾水；

A0：蒸餾水+硫酸亞鐵+雙氧水。

1.2.5.5 還原能力測(cè)定

參考段景峰[11]方法，試管中依次加入肉蓯蓉提取液和1%鐵氰化鉀溶液各1 mL，用PBS 溶液（pH6.6）補(bǔ)足至4mL，混勻，50℃水浴20 min，再加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，離心（3 000 r/min，10 min），取2 mL 上清液，加入0.4 mL1%六水合氯化鐵，再加2 mL 蒸餾水補(bǔ)足至6mL，混勻，反應(yīng)10 min，于700 nm處測(cè)定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果均采用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差描述，應(yīng)用采用SPSS-20.0 軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin-2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)肉蓯蓉浸膏制備過程中有效成分的影響

2.1.1 松果菊苷和毛蕊花糖苷色譜

研究表明，松果菊苷和毛蕊花糖苷對(duì)照品的保留時(shí)間分別為5.378和10.675 min，肉蓯蓉供試液中松果菊苷和毛蕊花糖苷的保留時(shí)間分別為5.353 和10.607 min。在該色譜條件下，松果菊苷和毛蕊花糖苷均能達(dá)到穩(wěn)定基線分離，且峰形良好，適用于供試液中松果菊苷和毛蕊花糖苷的檢測(cè)。圖1

圖1 松果菊苷和毛蕊花糖苷HPLC色譜Fig.1 HPLC chromatogram of echinacoside and verbascoside.

2.1.2 苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

研究表明，苯乙醇苷回歸方程為：Y=24.608X+0.0396，R2=0.999 3，其在0.004-0.02 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；松果菊苷和毛蕊花糖苷的回歸方程分別為Y=44.505X+221.1，R2=0.999、Y=19.483X-9.383 1，R2=0.999 2，在10 ～320 μg/mL二者線性關(guān)系良好。

2.1.3 不同干燥溫度對(duì)肉蓯蓉有效成分的影響

研究表明，曬干、陰干、烘箱40℃恒溫干燥5h，測(cè)得苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷量較低，當(dāng)60℃烘干肉蓯蓉，測(cè)得苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷量最高，干燥溫度為80℃，100℃時(shí)，有效成分測(cè)得量降低，肉蓯蓉干燥溫度選擇60℃烘箱干燥。圖2

圖2 不同干燥溫度下肉蓯蓉中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量變化（n=3，m=x±SD）Fig.2 Effects of different drying temperatures on the content of phenylethanoid glycosides,echinacoside and verbascoside（n=3，m=x±SD）

2.1.4 不同提取溫度對(duì)肉蓯蓉有效成分的影響

研究表明，提取溫度升高，苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量也逐漸增加，提取溫度為80℃時(shí)，3種成分含量最高，肉蓯蓉提取溫度選擇80℃下，用50%乙醇回流提取。圖3

圖3 不同提取溫度下肉蓯蓉中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量變化（n=3，m=x±SD）Fig.3 Effects of different extraction temperatures on the content of phenylethanoid glycosides,echinacoside and verbascoside（n=3，m=x±SD）

2.1.5 不同濃縮溫度對(duì)肉蓯蓉濃縮液中有效成分的影響

研究表明，濃縮溫度35℃時(shí)，30 mL肉蓯蓉提取液濃縮至15 mL 需要7 h，當(dāng)濃縮溫度升高，提取液濃縮至相同體積所需時(shí)間明顯縮短；濃縮溫度為60℃時(shí)，肉蓯蓉提取液濃縮至等體積時(shí)僅需0.7 h，且有效成分在濃縮液中的濃度也最高。肉蓯蓉提取液濃縮溫度選擇60℃。表1

表1 不同濃縮溫度下肉蓯蓉濃縮液中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷濃度變化（n=3，m=x±SD）Table 1 Effects of different concentrated temperatures on the content of phenylethanoid glycosides，echinacoside and verbascoside.（n=3，m=x±SD）

2.1.6 不同蒸制溫度對(duì)肉蓯蓉浸膏中有效成分的影響

研究表明，蒸制溫度40℃時(shí)，肉蓯蓉濃縮液蒸至浸膏為0.4 g 時(shí)，蒸制時(shí)間需要12 h，當(dāng)蒸制溫度升高，所需蒸制時(shí)間明顯縮短，濃縮溫度85℃時(shí)，肉蓯蓉濃縮液蒸至相同量的浸膏僅需1.2 h，明顯提高效率，且有效成分在浸膏中的含量也最高。肉蓯蓉濃縮液蒸制浸膏溫度選擇85℃。表2

表2 不同蒸制溫度下肉蓯蓉浸膏中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量變化（n=3，m=x±SD）Table 2 Effects of different steaming temperature on the content of phenylethanoid glycosides，echinacoside and verbascoside.（n=3，m=x±SD）

2.2 肉蓯蓉浸膏體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

研究表明，當(dāng)濃度在0.1 ～0.5 mg/mL，肉蓯蓉浸膏溶液對(duì)DPPH 自由基率呈持續(xù)上升，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL 時(shí)清除率達(dá)到最高，為95%。與相同濃度范圍的VC清除DPPH自由基能力相當(dāng)，肉蓯蓉浸膏對(duì)DPPH清除率的IC50為0.017 mg/mL，VC為0.018 mg/mL。經(jīng)過對(duì)肉蓯蓉浸膏制備過程中各環(huán)節(jié)溫度進(jìn)行控制，不僅可提高苯乙醇苷類成分的含量，而且使其對(duì)DPPH 自由基的清除能力增強(qiáng)。圖4

圖4 不同濃度肉蓯蓉浸膏下DPPH自由基清除率變化Fig.4 Scavenging rate of DPPH radical by C.deserticola extractum

2.2.2 對(duì)ABTS自由基的清除能力

研究表明，當(dāng)濃度在0.1 ～0.5 mg/mL，肉蓯蓉浸膏溶液對(duì)ABTS 自由基清除率呈持續(xù)上升，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL 時(shí)清除率達(dá)到最高，為92%。肉蓯蓉浸膏對(duì)ABTS 清除率的IC50為0.023 mg/mL，VC為0.003 mg/mL。圖5。

圖5 不同濃度肉蓯蓉浸膏下ABTS自由基的清除率變化Fig.5 Scavenging rate of ABTS free radicals by C.deserticola extractum

2.2.3 對(duì)羥基自由基的清除能力

研究表明，當(dāng)濃度在0.1 ～0.5 mg/mL，肉蓯蓉浸膏溶液對(duì)羥基自由基清除能力逐漸上升，在0.1 ～0.3 mg/mL 呈明顯的劑量依賴性，當(dāng)0.5 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到最高72%，其IC50為0.248 mg/mL，VC為0.14 mg/mL。圖6

圖6 不同濃度肉蓯蓉浸膏下羥基自由基的清除率變化Fig.6 Scavenging rate of hydroxyl radical by C.deserticola extractum

2.2.4 肉蓯蓉浸膏還原能力測(cè)定

研究表明，在0.1 ～0.5 mg/mL，隨著濃度的增加，肉蓯蓉浸膏還原能力隨之增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的量-效關(guān)系，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL 時(shí)其總還原能力達(dá)到最高，但略低于VC還原力。圖7

圖7 不同濃度肉蓯蓉浸膏下肉蓯蓉還原能力變化Fig.7 Extractum reduction capacity of C.deserticola

3 討論

肉蓯蓉含水量、含糖量高，采用自然干燥，所需時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3 ～4個(gè)月，致使苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷等有效成分在干燥過程中被酶降解，影響肉蓯蓉的品質(zhì)和藥用價(jià)值[12-18]。目前的研究報(bào)道中，肉蓯蓉采后干燥的方式有微波干燥[19]、冷凍干燥[20]、90～100℃烘干或日光曝曬快速干燥[9]、自然晾干和40℃烘干[21]、60 ～80℃烘干[8]，研究發(fā)現(xiàn)，烘干60℃時(shí)，苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量最高。對(duì)于肉蓯蓉采后干燥方式的不同結(jié)論，可能是由于肉蓯蓉產(chǎn)地、采收期、自然氣候等因素的不同有關(guān)。

在80 ～90℃提取肉蓯蓉時(shí)浸膏得率、松果菊苷及毛蕊花糖苷含量均較高[10，22-23]，研究表明，對(duì)產(chǎn)自新疆和田的管花肉蓯蓉在80℃浸提，其中苯乙醇苷、松果菊苷及毛蕊花糖苷得率最高。劉洋等[24]采用響應(yīng)面法進(jìn)行單因素篩選結(jié)果顯示，最佳提取溫度為48℃，是否與肉蓯蓉產(chǎn)地的不同造成次生代謝產(chǎn)物的積累量差異有關(guān)，原因有待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)室通常采用水浴98℃將植物提取液蒸制成浸膏，用于活性成分的分離鑒定、藥效研究等[25]，但是高溫蒸制是否造成苯乙醇苷類的損失目前無相關(guān)研究。將提取液濃縮后，再經(jīng)冷凍干燥、或真空干燥技術(shù)制得固體粉末[9，26]，但是，這些現(xiàn)代干燥技術(shù)耗時(shí)、耗能、且需要特定的干燥儀器，價(jià)格高，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。研究采用水浴蒸制肉蓯蓉浸膏發(fā)現(xiàn)，85℃水浴蒸制肉蓯蓉浸膏，與98℃水浴蒸制相比，耗時(shí)短、且盡可能降低了浸膏中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷的損失。

經(jīng)過篩選干燥溫度、提取溫度、濃縮溫度、浸膏蒸制溫度后制得的肉蓯蓉浸膏，其抗氧化活性與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相比，DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、羥基自由基清除能力更高，優(yōu)選適宜的制備條件，所得的肉蓯蓉浸膏也具有更好的抗氧化活性。

4 結(jié)論

肉蓯蓉在干燥、提取、濃縮、水浴蒸制浸膏過程中，不同溫度對(duì)苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷有較大影響，肉蓯蓉干燥溫度為60℃，提取溫度為80℃，濃縮溫度為60℃，蒸制浸膏溫度為85℃時(shí)為宜。肉蓯蓉浸膏對(duì)DPPH 自由基、ABTS自由基、羥基自由基都具有清除能力，對(duì)鐵離子具有較強(qiáng)的還原能力，肉蓯蓉浸膏具有較強(qiáng)的抗氧化活性。