余柳燕 雷 娜 解宇環(huán) 郭沛鑫

云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500

急性酒精中毒是指機(jī)體短期內(nèi)攝入過量乙醇，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)先興奮后抑制的狀態(tài)[1]。在臨床接診中，急性酒精中毒的接診率高達(dá)67.08%，根據(jù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度將其分為興奮期、共濟(jì)失調(diào)期及昏迷期[2-3]。流行病學(xué)調(diào)查[4]結(jié)果顯示，酒精性昏迷已成為昏迷發(fā)生的三大主因之一。急性酒精性昏迷是酒精中毒的重度階段，如何快速有效地對昏迷患者進(jìn)行促醒治療并減輕并發(fā)癥，改善預(yù)后是臨床急診醫(yī)學(xué)關(guān)注的重點(diǎn)。

醒腦靜注射液是經(jīng)典方安宮牛黃丸基礎(chǔ)上縮減而來，由梔子、冰片、麝香、郁金四味藥組成，梔子性寒味苦，有清熱解毒之功，現(xiàn)代藥理研究[5]發(fā)現(xiàn)，梔子苷具有抗炎、解熱、利膽的作用 ；冰片引藥上行，主通竅散郁，可增強(qiáng)中樞的缺氧耐受力[6]；麝香芳香走竄，可開竅醒神，麝香酮可興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)，增強(qiáng)腦血流，保護(hù)神經(jīng)元[7]；郁金則行氣止痛，清心解郁，可降低血漿β-EP水平，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的器官損害[8]。臨床上常用醒腦靜注射液治療腦血管疾病、腦外傷、急性中毒、病毒感染引起的昏迷[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，單用醒腦靜在治療急性酒精中毒時，其發(fā)揮的療效和納洛酮相近，且臨床應(yīng)用安全，不良反應(yīng)少。與納洛酮聯(lián)合應(yīng)用治療急性酒精中毒的患者時，療效肯定，但作用機(jī)制不明確。

研究[11]發(fā)現(xiàn)，過量乙醇攝入會導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙與腦結(jié)構(gòu)損傷，乙醇對嚙齒類動物的影響主要是破壞空間記憶能力。另外，研究[12]證實了乙醇可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及神經(jīng)炎性反應(yīng)等途徑導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙。目前臨床治療急性酒精性昏迷，療效明確、使用頻率較高的是阿片受體拮抗類藥物。此外，常用中藥注射液有醒腦靜、清開靈等。基礎(chǔ)研究[13]發(fā)現(xiàn)，單用納洛酮時，對應(yīng)激狀態(tài)下亞急性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶損害有一定的改善作用；在臨床研究中，常用納洛酮聯(lián)合醒腦靜治療昏迷患者[14-15]，但聯(lián)合用藥與二藥單獨(dú)應(yīng)用的療效對比及對認(rèn)知功能改善有何異同，尚無相關(guān)實驗研究。該研究的缺乏極大地局限了聯(lián)合用藥的推廣和應(yīng)用。本研究擬采用腹腔注射乙醇溶液的方式建立急性酒精性昏迷大鼠模型，通過觀察醒腦靜與納洛酮單用和二者聯(lián)合用藥時各組大鼠昏迷評分變化，RCS評分可反映大鼠昏迷程度，RCS評分越低，大鼠昏迷程度越深。明確促醒的作用，并利用水迷宮觀察大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)及目標(biāo)象限停留所占百分比等記憶功能的變化，以此來評價二藥聯(lián)用時促醒作用的特點(diǎn)，可為臨床用藥提供實驗支持。

1 實驗材料

1.1 藥物 醒腦靜注射液(批號：2106042)，購于大理藥業(yè)股份有限公司；鹽酸納絡(luò)酮注射液(批號：2010015)，購于山東新華制藥股份有限公司。根據(jù)臨床人用劑量，按照人與大鼠體表面積折算法，分別將鹽酸納絡(luò)酮和醒腦靜注射液用生理鹽水配制為0.2 mg/mL與5.48 mg/mL濃度，置于4 ℃冰箱備用。

1.2 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購于北京斯貝福實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。于云南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)，溫度(22±2)℃，相對濕度為40%～55%，室內(nèi)光暗循環(huán)12 h，自由飲水，進(jìn)食。

1.3 試劑 無水乙醇(批號：20211001420)，購于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；生理鹽水(批號：210326 2B)，購于西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司。

1.4 儀器 DB001型Morris水迷宮，北京智鼠多寶股份有限公司生產(chǎn)；BCD-392MNE型4 ℃冰箱，由青島海爾股份有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模濃度摸索 取健康SD雄性大鼠24只，隨機(jī)分為32%、34%、52% 3個乙醇濃度組，每組8只動物，分別腹腔注射上述不同濃度乙醇，注射容積為16 mL/kg，觀察造模后大鼠的耐受性和昏迷程度，參照由格拉斯哥昏迷評分量表(glasgow coma scale， GCS)改良的大鼠昏迷評分量表(表1)進(jìn)行昏迷程度評分。評分內(nèi)容包括眼瞼刺激反應(yīng)、腦干反射、翻正反射、聽覺刺激以及胡須運(yùn)動等方面，評分為0～3分時判斷大鼠進(jìn)入昏迷狀態(tài);評分為10～13分時判斷大鼠為清醒狀態(tài)。選擇合適的乙醇濃度進(jìn)一步考察給藥容積。

表1 大鼠昏迷評分量表(RCS)

2.2 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模體積摸索 根據(jù)上述實驗中的結(jié)果確定的乙醇造模濃度，取健康SD雄性大鼠24只，分別用15 mL/kg、16 mL/kg、17.8 mL/kg乙醇溶液腹腔注射后，對翻正反射消失的大鼠同法參照表1大鼠昏迷評分量表(RCS)進(jìn)行昏迷程度評分。每只動物持續(xù)觀察300 min，每隔30 min進(jìn)行昏迷評分1次，記錄大鼠的昏迷時長及昏迷程度。

2.3 醒腦靜聯(lián)合納洛酮對急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用研究 取健康雄性SD大鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、醒腦靜注射液組(20 mL/kg)、鹽酸納絡(luò)酮注射液組(0.9 mL/kg)及醒腦靜聯(lián)合納洛酮注射液組(20 mL/kg+0.9 mL/kg)，每組6只，除空白對照組外，其余各組采用32%乙醇以17.8 mL/kg劑量腹腔注射，復(fù)制急性酒精中毒昏迷大鼠模型，造模后隨即于另一側(cè)腹腔注射給藥。在造模給藥后，采用RCS表(表1)對各組大鼠進(jìn)行昏迷評分。每隔30 min進(jìn)行一次評分，評分直到第5 h，動物基本蘇醒后，停止評分。

2.4 大鼠Morris 水迷宮實驗(MWM) 取健康雄性SD大鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行水迷宮實驗，水迷宮直徑1.6 m，高50 cm，水面沒過平臺(直徑20 cm)1 cm左右，水深30 cm，水溫(25±1)℃。大鼠造模前對大鼠進(jìn)行為期5 d的定位航向訓(xùn)練，將大鼠依次從四個象限放入水中，若90 S后還未找到平臺，便引導(dǎo)大鼠進(jìn)入平臺，停留10 S，若90 S內(nèi)找到平臺，則進(jìn)行下一只鼠的訓(xùn)練。訓(xùn)練第6天，動物同法分組、造模、給藥，在給藥后第12 h，進(jìn)行探查訓(xùn)練。撤去平臺，記錄大鼠進(jìn)入平臺的時間、進(jìn)入次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間所占百分比。實驗裝置如圖1所示。

圖1 Morris水迷宮圖

3 結(jié)果

3.1 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模濃度摸索 實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，34%與52%濃度乙醇給大鼠腹腔注射后均出現(xiàn)動物死亡，死亡率分別為12.5%和75%，32%乙醇腹腔注射，動物均出現(xiàn)翻正反射消失，但未見動物死亡。因此，本研究選擇32%濃度乙醇作為急性酒精性昏迷大鼠的乙醇造模濃度。實驗結(jié)果見表2。

表2 不同濃度乙醇對大鼠死亡率的影響>

3.2 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模體積摸索 實驗結(jié)果表明，采用32%的乙醇溶液，以17.8 mL/kg腹腔注射造模，大鼠昏迷評分最低，部分大鼠在造模3 h后翻正反射開始恢復(fù)，在造模后5 h，大鼠基本恢復(fù)清醒，較符合急性酒精昏迷的臨床表現(xiàn)。后續(xù)正式實驗選用該濃度和體積的乙醇溶液復(fù)制急性酒精中毒昏迷大鼠模型。結(jié)果見表3、圖2。

表3 不同給藥體積對大鼠昏迷評分及昏迷時長的影響

3.3 醒腦靜聯(lián)合納洛酮對急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用研究 實驗結(jié)果表明，32%乙醇造模后，0 h時各組大鼠RCS評分在2.5～3分之間，隨著時間推移，評分逐漸升高，造模4.5 h后，模型組大鼠RCS評分恢復(fù)至正常大鼠水平。

注:與15 mL/kg組比較，**P<0.01

與模型組比較，納洛酮組在造模1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h后評分明顯增高(P<0.05，P<0.01)，醒腦靜組在造模1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h后，評分明顯增高(P<0.05，P<0.01)，醒腦靜聯(lián)合納洛酮用藥組動物蘇醒較快，在造模給藥后0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h評分明顯增高(P<0.05，P<0.01)。與納洛酮組比較，聯(lián)合用藥組及單用醒腦靜組大鼠恢復(fù)清醒時間較納洛酮組提前了1 h(評分≥10)，聯(lián)合用藥組療效略優(yōu)于單用醒腦靜組。

實驗結(jié)果表明，醒腦靜與納絡(luò)酮聯(lián)合用藥，對急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用優(yōu)于醒腦靜和納絡(luò)酮單獨(dú)用藥。結(jié)果見表4。

3.4 大鼠Morris 水迷宮實驗(MWM) 實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)，穿越平臺次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，醒腦靜組、醒腦靜+納絡(luò)酮聯(lián)合用藥組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)，目標(biāo)象限停留百分比明顯增加(P<0.01)，醒腦靜組、納洛酮組、醒腦靜+納絡(luò)酮聯(lián)合用藥組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05，P<0.01)。與納洛酮相比較，聯(lián)合用藥組及醒腦靜組大鼠逃避潛伏期明顯減少(P<0.01)，目標(biāo)象限停留百分比明顯增加(P<0.01)，聯(lián)合用藥組穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.01)。實驗結(jié)果提示，醒腦靜聯(lián)合納洛酮用藥，對急性酒精性昏迷大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙改善明顯優(yōu)于醒腦靜和納絡(luò)酮單獨(dú)用藥。結(jié)果如圖3、圖4所示。

表4 醒腦靜聯(lián)合納洛酮對急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用研究

注:與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與納洛酮組比較，&&P<0.01。圖3 大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)及目標(biāo)象限停留所占百分比的影響圖

圖4 大鼠水迷宮軌跡圖

4 討論

現(xiàn)代藥理研究[16]發(fā)現(xiàn)，醒腦靜注射液可通過調(diào)節(jié)覺醒肽-腺苷神經(jīng)功能促進(jìn)酒精昏迷大鼠覺醒。納絡(luò)酮為阿片類受體拮抗藥，其促醒機(jī)制與藥物取代β-EP與嗎啡受體結(jié)合，解除其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制狀態(tài)有關(guān)[17]。臨床上常用醒腦靜聯(lián)合納洛酮治療急性酒精中毒導(dǎo)致的昏迷，療效肯定，但作用機(jī)制不明確。

本研究先運(yùn)用在格拉斯哥昏迷評分量表(GCS)基礎(chǔ)上改良得來的大鼠昏迷評分量表(RCS)對酒精中毒大鼠昏迷程度進(jìn)行評價，評分越低，表明大鼠昏迷程度越深，連續(xù)時間內(nèi)測評，可動態(tài)反映大鼠昏迷程度變化。經(jīng)過預(yù)實驗證實，32%的乙醇以17.8 mL/kg給大鼠腹腔注射，大鼠昏迷評分在0～3分內(nèi)，昏迷時長為(3±0.5)h，且無動物死亡，與臨床急性酒精中毒昏迷的臨床表現(xiàn)一致性較好，故選擇該劑量酒精可快速且安全的復(fù)制大鼠昏迷模型。

Morris水迷宮是作為嚙齒類動物空間學(xué)習(xí)與記憶的經(jīng)典行為學(xué)實驗方法，通過強(qiáng)迫實驗動物(如大鼠、小鼠)游泳，學(xué)習(xí)尋找目標(biāo)象限隱藏平臺，可測試實驗動物對空間位置及空間定位的學(xué)習(xí)及記憶能力，在學(xué)習(xí)記憶機(jī)制[18]、藥物開發(fā)及阿爾茨海默癥、血管性癡呆、帕金森及腦外傷等各類疾病模型[19～20]的評價中被廣泛應(yīng)用。該系統(tǒng)主要由定位航向?qū)嶒炁c空間探索實驗兩部分組成。其中逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)及目標(biāo)象限停留百分比等常作為評價其空間探索能力的指標(biāo)。本研究選用了Morris水迷宮中的空間探索行為學(xué)指標(biāo)評價醒腦靜聯(lián)合納洛酮對昏迷恢復(fù)后大鼠的記憶功能的改善作用。實驗結(jié)果表明，酒精中毒昏迷大鼠蘇醒后，逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)與目標(biāo)象限停留百分比減少，而聯(lián)合用藥對大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留所占百分比均優(yōu)于單用醒腦靜或納洛酮組，提示聯(lián)合用藥可改善急性乙醇導(dǎo)致的大鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降。

本實驗以32%乙醇17.8 mL/kg腹腔注射建立急性酒精中毒昏迷大鼠為研究對象，實驗結(jié)果表明，醒腦靜、納洛酮及二者聯(lián)合用藥均可提高大鼠昏迷評分，單用醒腦靜作用略優(yōu)于單用納洛酮，二者聯(lián)用時，昏迷評分最高，表明醒腦靜聯(lián)合納洛酮可明顯縮短大鼠昏迷時長，改善機(jī)體意識與運(yùn)動功能障礙，療效優(yōu)于單用醒腦靜和單用納絡(luò)酮；酒精中毒昏迷大鼠蘇醒后，逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)與目標(biāo)象限停留百分比減少，而聯(lián)合用藥對大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留所占百分比均優(yōu)于單用醒腦靜或納洛酮組，提示聯(lián)合用藥可改善急性乙醇導(dǎo)致的大鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降。

因此，醒腦靜、納洛酮、二者聯(lián)合用藥均可不同程度發(fā)揮促醒作用，其中聯(lián)合用藥促醒效果最佳，醒腦靜組在改善大鼠昏迷評分及記憶功能方面均優(yōu)于單用納洛酮，為進(jìn)一步明確單獨(dú)用藥與聯(lián)合用藥各自發(fā)揮促醒作用的機(jī)制，后續(xù)將進(jìn)一步開展藥物促醒作用的機(jī)制研究。