何富平， 李亨， 謝輝， 蔣順琬

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518033；2.深圳市中醫(yī)院，廣東深圳 518033）

急性軟組織損傷（acute soft tissue injury，ASTI）是指在外力的作用下而致的局部皮下軟組織產(chǎn)生的急性挫傷或撕裂傷。急性軟組織損傷包括肌肉、韌帶、筋膜、肌腱、滑膜、關(guān)節(jié)囊、周圍神經(jīng)和血管的急性損傷，臨床主要表現(xiàn)為疼痛、腫脹、青紫瘀斑、肢體功能障礙等癥狀，常發(fā)生于日常生活、體育運動、軍事訓(xùn)練等場景[1]。目前臨床治療急性軟組織損傷主要采用口服或局部使用非甾體類抗炎藥以緩解患者癥狀，但這類藥物對肝腎功能及胃腸道功能有一定的損害[2]。近年來的研究表明，與非甾體類抗炎藥相比，中藥外用治療急性軟組織損傷具有療效確切、不良反應(yīng)少、患者接受程度高、適應(yīng)人群廣等優(yōu)點[3]。但到目前為止，中藥外用治療急性軟組織損傷的用藥規(guī)律及作用機制尚未明確。本研究通過收集近30年中藥外用治療急性軟組織損傷的臨床文獻，運用古今醫(yī)案云平臺（Version 2.3.5）總結(jié)其用藥規(guī)律，篩選核心藥物，再運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析核心藥物治療急性軟組織損傷的潛在基因靶點及信號通路，以期為臨床治療急性軟組織損傷提供思路和參考。

1 資料與方法

1.1文獻資料的收集檢索策略采用“急性軟組織損傷”O(jiān)R“急性扭傷”O(jiān)R“急性筋傷”AND“中藥外用”O(jiān)R“中藥外敷”O(jiān)R“中藥外洗”O(jiān)R“中藥熏蒸”；檢索中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)（Wanfang Data）、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫（VIP）等數(shù)據(jù)庫中收錄的有關(guān)中藥外用治療急性軟組織損傷的臨床研究文獻。文獻檢索時間限定為1991年6月至2021年6月。

1.2文獻資料的篩選文獻資料符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所選文獻均為中藥外用治療急性軟組織損傷的臨床研究文獻，包括臨床療效觀察、臨床試驗研究、治療體會等；（2）明確診斷為急性軟組織損傷的患者，其性別、年齡、種族均不作限制；（3）有明確療效標(biāo)準(zhǔn)且總有效率達90%及以上的臨床研究；（4）以中藥外用為主，可結(jié)合其他治療方法（如針灸、推拿、功能鍛煉等）；（5）所納入的研究中，中藥外用有完整的藥物組成。

排除以下文獻資料：（1）采用其他非中藥外用為主要方法治療急性軟組織損傷的臨床研究文獻；（2）綜述、動物實驗、護理體會、會議記錄等文獻；（3）無具體用藥說明或用藥不完整的文獻；（4）對于使用同一處方的文獻，取發(fā)表時間在前的1篇；（5）治療總有效率低于90%的文獻。

1.3數(shù)據(jù)規(guī)范化處理根據(jù)《全國中草藥匯編》（第3版）[4]和全國高等中醫(yī)藥院校“十三五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》[5]對中藥名稱進行統(tǒng)一，如將“銀花藤”規(guī)范為“忍冬藤”。炮制后藥物功效有顯著差異者則分別錄入，如生地黃、熟地黃等。由研究員將規(guī)范化處理后的方藥信息錄入Excel 2019，建立急性軟組織損傷方藥數(shù)據(jù)庫。

1.4數(shù)據(jù)挖掘與分析將急性軟組織損傷方藥數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所研發(fā)的古今醫(yī)案云平臺（Version 2.3.5），對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并挖掘用藥規(guī)律，篩選核心藥物。數(shù)據(jù)挖掘方法包括用藥頻次分析、性味歸經(jīng)分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析、聚類分析等。

1.5核心藥物機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.5.1 靶點篩選 根據(jù)“1.4”項得到的分析結(jié)果，選擇中藥外用治療急性軟組織損傷最核心的藥物輸入BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，獲取其活性成分所對應(yīng)的靶點[6]。以“acute soft tissue injury”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫中獲取急性軟組織損傷相關(guān)靶點。利用Venny 2.1在線平臺獲取核心藥物-急性軟組織損傷共同靶點。

1.5.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析 利用String平臺[7]對核心藥物-急性軟組織損傷共同靶點進行PPI分析，并利用Cytoscape 3.7.2軟件篩選潛在作用靶點。

1.5.3 功能富集分析 將潛在作用靶點導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫[8]進行基因本體（gene oncology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1常用中藥頻次分析按照篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終納入478篇文獻，478首中藥處方，涉及中藥350味，用藥總頻次為4 753次。用藥頻次≥70次的高頻藥物共計16味，其頻次與頻率（頻次/4 753×100%）分布結(jié)果見表1。

表1 中藥外用治療急性軟組織損傷處方中用藥頻次≥70次的中藥Table 1 Herbs with the medication frequency being or over 70 times in the Chinese medicine prescriptions for external use in treating acute soft tissue injury

2.2藥物性味歸經(jīng)分析350味中藥的屬性中，四氣以溫性藥的使用頻次最高，達1 897次（占比39.91%），其次為寒性藥、平性藥等；五味以辛味藥的使用頻次最高，達2 758次（占比58.03%），其次為苦味藥、辛味藥等；歸經(jīng)以歸足厥陰肝經(jīng)的藥物使用頻次最高，達3 073次（占比64.65%），其次為歸足太陰脾經(jīng)、手少陰心經(jīng)、手太陰肺經(jīng)等。藥物的性味歸經(jīng)分析結(jié)果見圖1。

圖1 中藥外用治療急性軟組織損傷處方中藥物的性味歸經(jīng)分析雷達圖Figure 1 Radar map of the properties，flavors and meridian tropism of the herbs in the Chinese medicine prescriptions for external use in treating acute soft tissue injury

2.3關(guān)聯(lián)規(guī)則分析對中藥外用治療急性軟組織損傷的高頻藥物（頻次≥70次）進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)置支持度（體現(xiàn)藥物組合在所有處方中出現(xiàn)的頻次）≥10%，置信度（體現(xiàn)藥物組合之間的關(guān)聯(lián)性）≥70%[9]，共獲得13條核心關(guān)聯(lián)規(guī)則，結(jié)果見表2。所有藥物組合的提升度都大于1，說明這些藥物組合結(jié)果差異在統(tǒng)計學(xué)上均有意義[10]，且支持度與置信度均最高的藥物組合為乳香-沒藥，提示這一藥對是中藥外用治療急性軟組織損傷的核心藥物組合。

表2 中藥外用治療急性軟組織損傷核心藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則（支持度≥10%，置信度≥70%）Table 2 Association rule analysis of the core herbs in the Chinese medicine prescriptions for external use in treating acute soft tissue injury（support≥10%，confidence≥70%）

2.4聚類分析選用歐氏距離，利用最長距離法對中藥外用治療急性軟組織損傷的高頻藥物（頻次≥70次）進行系統(tǒng)聚類分析[11]，結(jié)果見圖2。以歐氏距離≥16為分界，可將高頻藥物分為3個有效聚類群。聚類1藥物包括梔子、大黃、黃柏；聚類2藥物包括乳香、沒藥、紅花、當(dāng)歸；聚類3藥物包括冰片、血竭、白芷、川烏、草烏、三七、延胡索、川芎、赤芍。

圖2 中藥外用治療急性軟組織損傷的高頻藥物聚類圖Figure 2 Clustering analysis of the high-frequency herbs in the Chinese medicine prescriptions for external use in treating acute soft tissue injury

2.6核心藥物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.6.1 核心藥物活性成分及靶點的篩選結(jié)果 通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲得核心藥物乳香-沒藥的活性成分及其所對應(yīng)的潛在作用靶點，其中乳香共計18個活性成分，對應(yīng)1 085個靶點；沒藥共計11個活性成分，對應(yīng)578個靶點。二者取并集再去重，最終共獲得28個活性成分、698個潛在作用靶點。通過GeneCards、OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫獲得急性軟組織損傷相關(guān)靶點共601個，利用Venny 2.1在線平臺篩選得到取核心藥物-急性軟組織損傷的共同靶點105個，繪制韋恩（Venn）圖，結(jié)果見圖3。

圖3 核心藥物-急性軟組織損傷（ASTI）共同靶點的韋恩（Venn）圖Figure 3 Venn diagram of the potential targets for the treatment of acute soft tissue injury by core drugs

將核心藥物篩選后得到的28個活性成分與預(yù)測的105個治療急性軟組織損傷共同靶點輸入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制核心藥物-活性成分-急性軟組織損傷的潛在靶點網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖4。在該網(wǎng)絡(luò)中，共有135個節(jié)點，327條邊。菱形節(jié)點表示藥物，橢圓形節(jié)點表示活性成分，矩形節(jié)點表示治療急性軟組織損傷潛在靶點，每條邊代表活性成分與靶點之間的作用關(guān)系。

圖4 核心藥物-活性成分-急性軟組織損傷的潛在靶點網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 Potential target network of core drugs-active ingredient for the treatment of acute soft tissue injury

2.6.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果 將乳香-沒藥治療急性軟組織損傷的105個潛在作用靶點導(dǎo)入String平臺，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖5。圖5結(jié)果顯示，該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)共有105個節(jié)點，1 325條邊。圖中節(jié)點顏色越深、對應(yīng)靶點度值越大，表明關(guān)鍵性越高。利用“CytoNCA”進行網(wǎng)絡(luò)分析其各節(jié)點度值，得到其度值中位數(shù)為20，取其二倍值，篩選出關(guān)鍵靶點23個，結(jié)果見表3。篩選結(jié)果提示，這23個靶點很可能是核心藥物乳香-沒藥發(fā)揮藥理作用的潛在關(guān)鍵靶點。

表3 核心藥對乳香-沒藥治療急性軟組織損傷的關(guān)鍵靶點信息Table 3 Key target information of the core herbal pair of Olibanum-Myrrha in the treatment of acute soft tissue injury

圖5 核心藥對乳香-沒藥治療急性軟組織損傷的靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 Protein-protein interaction network of the potential targets for the treatment of acute soft tissue injury by the core herbal pair of Olibanum-Myrrha

2.6.3 GO功能富集分析結(jié)果 利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對乳香-沒藥治療急性軟組織損傷的105個潛在作用靶點進行GO功能富集分析，共得到562條相關(guān)通路（P＜0.05）。其中生物過程（biological process，BP）通 路461條，細 胞 組 分（cellular component，CC）通路41條，分子功能（molecular function，MF）通路60條。以P值排序，分別選取排前20位的GO條目用于繪制GO二級分類圖，結(jié)果見圖6。BP通路主要富集在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)等；CC通路主要富集在細胞質(zhì)、質(zhì)膜、細胞外間隙、細胞外泌體等；MF通路主要富集在相同蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚體活性、酶結(jié)合等。

圖6 核心藥對乳香-沒藥治療急性軟組織損傷的潛在作用靶點的GO功能富集分析結(jié)果Figure 6 Gene oncology（GO）pathway enrichment analysis of the potential targets for the treatment of acute soft tissue injury by the core herbal pair of Olibanum-Myrrha

2.6.4 KEGG通路富集分析結(jié)果 應(yīng)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對乳香-沒藥治療急性軟組織損傷的105個潛在作用靶點進行KEGG富集分析，共得到83條相關(guān)通路（P＜0.05）。以P值排序，取其前20條通路，用R軟件繪制氣泡圖，結(jié)果見圖7?？v坐標(biāo)為KEGG通路名稱，橫坐標(biāo)為各通路所占基因比值，氣泡大小為各通路所包含的基因數(shù)目，氣泡越大，表明富集在該條KEGG通路上的基因越多。圖7結(jié)果顯示，乳香-沒藥治療急性軟組織損傷的主要通路有PI3K-Akt信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、核因子κB（NF-κB）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路等。結(jié)果提示，乳香-沒藥有效活性成分可能通過調(diào)控這些信號通路發(fā)揮對急性軟組織損傷的治療作用。

圖7 核心藥對乳香-沒藥治療急性軟組織損傷潛在靶點KEGG通路富集分析Figure 7 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway enrichment analysis of the potential targets for the treatment of acute soft tissue injury by the core herbal pair of Olibanum-Myrrha

3 討論

急性軟組織損傷屬于中醫(yī)學(xué)的“筋傷”范疇。人體受到損傷后，氣機不暢，則氣血運行受阻，滯于筋脈之中，發(fā)為腫痛。人體損傷后可致血凝脈中，血液運行受阻，不通則痛；瘀血阻塞脈絡(luò)可致血溢脈外，脈外之血聚集于局部組織則可見皮膚紅腫青紫。故中醫(yī)學(xué)認為，急性軟組織損傷的病因病機為氣血失和，氣滯血瘀，阻滯筋脈，筋脈不通則痛，最終發(fā)為本病。

本研究中的用藥頻數(shù)分析結(jié)果顯示，中藥外用治療急性軟組織損傷的常用藥物有大黃、紅花、乳香、沒藥、當(dāng)歸、黃柏、梔子、冰片、白芷、血竭、川烏、三七、川芎、草烏、赤芍、延胡索等。其中使用頻次排位居首的大黃，具有“止血不留瘀”的特點?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[12]結(jié)果表明，大黃中的蒽醌類、黃酮類活性物質(zhì)可抗血小板聚集，抑制血栓素α2的形成，從而升高血漿滲透壓，降低血液黏稠度，最終改善微循環(huán)和血液流變性。紅花具有活血通經(jīng)、散瘀止痛等功效，使用頻次排位居第二。吳泊等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，紅花中的紅花黃色素和紅花醌苷能有效縮短血栓長度，延長凝血酶時間及凝血酶原時間，提升纖溶活性，產(chǎn)生抗凝、抗血栓形成的作用。

從藥物性味歸經(jīng)來看，性溫、味辛苦、歸肝脾心經(jīng)的藥物最多。溫性藥可活絡(luò)通筋；辛味藥能散能行，行氣活血。清代錢秀昌的《傷科補要》曰：“跌打損傷之證，惡血留內(nèi)，則不分何經(jīng)，皆以肝為主。蓋肝主血也，敗血必歸于肝。其痛多在脅肋小腹者，皆肝經(jīng)之道路也”。故肝經(jīng)氣血通暢則其他經(jīng)絡(luò)也能瘀去新生，氣行絡(luò)通。中藥外用治療多選用性溫、味辛苦、歸肝脾心經(jīng)的藥物，這與急性軟組織損傷患者氣滯血瘀阻滯于筋脈之中，導(dǎo)致筋脈不通則痛的病機是相契合的。

關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果顯示，支持度最高、置信度最高的藥物組合都是乳香-沒藥。兩者味皆辛苦，皆歸心肝脾經(jīng)，臨床上常以藥對的形式相須為用，具有良好的行氣散瘀、活血止痛的效果。明代李時珍在《本草綱目》中記載：“乳香活血，沒藥散血，皆能止痛、消腫、生肌，故二藥每每相兼而用?！贝送猓迥┟駠跄甑膹堝a純在其《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》也曾記載：“乳香、沒藥，二藥并用，為宣通臟腑、流通經(jīng)絡(luò)之要藥，故凡心胃脅腹肢體關(guān)節(jié)諸疼痛皆能治之……外用為粉以敷瘡瘍，能解毒、消腫、生肌、止痛，雖然開通之品，不耗傷氣血，誠良藥也?！笔Y海峰等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，乳香與沒藥合用對抑制血小板聚集、抗凝血酶活性均能產(chǎn)生顯著效應(yīng)，呈現(xiàn)協(xié)同增效作用。

聚類分析結(jié)果顯示，取群集數(shù)16可得到3個有效聚類群。聚類1藥物（梔子、大黃、黃柏）中的大黃具有清熱瀉火、涼血解毒、止血、逐瘀通經(jīng)的功效，復(fù)元活血湯中就重用大黃以滌蕩留瘀敗血，引瘀血下行。大黃與梔子、黃柏二藥配伍使用可增強活血化瘀之效。聚類2藥物（乳香、沒藥、紅花、當(dāng)歸）以活血藥為主，其中當(dāng)歸既善補血，又能活血。清代醫(yī)家張山雷在《本草正義》中稱當(dāng)歸“誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也”。當(dāng)歸與活血藥物乳香、沒藥、紅花配伍，既能增強活血祛瘀、通絡(luò)止痛之功效，又能夠活血補血，化瘀而不傷正。聚類3藥物（冰片、血竭、白芷、川烏、草烏、三七、延胡索、川芎、赤芍）為活血藥、祛風(fēng)濕藥、清熱藥、解表藥的綜合應(yīng)用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[15]證實，白芷中的總香豆素和揮發(fā)油組合物具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用。川芎被譽為“血中之氣藥”，延胡索可活血、行氣、止痛，二者皆能活血化瘀，行氣導(dǎo)滯，適用于急性軟組織損傷的治療。

通過用藥頻數(shù)分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析、聚類分析，得到乳香-沒藥這一核心藥對，以此藥對為研究對象，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究其治療急性軟組織損傷的作用機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，乳香-沒藥治療急性軟組織損傷的關(guān)鍵靶點主要為白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）、IL-1β、腫瘤蛋白53（TP53）等，主要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、細胞增殖的正調(diào)控等生物過程。KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，乳香-沒藥治療急性軟組織損傷主要涉及PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、TNF信號通路等。PI3K-Akt信號通路在抑制細胞凋亡、促進細胞增殖、促進血管生成等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[16]。研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt信號通路在骨骼肌損傷時被激活，從而能抑制肌原纖維蛋白的降解和肌萎縮基因的表達，促進骨骼肌增殖和增加總肌管數(shù)量。MAPK信號通路與炎癥、細胞生長和分化相關(guān)，當(dāng)肌肉組織受到急性劇烈傷害時，可增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生從而上調(diào)MAPK信號家族中ERK1/2和p38-MAPK的磷酸化水平，最終導(dǎo)致肌肉等軟組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[19-20]。NF-κB信號通路被認為是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路。研究[21]發(fā)現(xiàn)，這一通路中的上游因子TAK1蛋白和下游因子P65蛋白能抑制炎癥反應(yīng)，改善局部軟組織炎癥。故乳香-沒藥治療急性軟組織損傷可能與調(diào)節(jié)細胞增殖、基因表達及炎癥反應(yīng)等相關(guān)。

綜上，本研究通過對文獻數(shù)據(jù)挖掘，依托古今醫(yī)案云平臺總結(jié)了中醫(yī)外用治療急性軟組織損傷的用藥規(guī)律，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了核心藥物乳香-沒藥藥理作用的潛在機制，可為臨床中藥外用治療急性軟組織損傷提供參考，亦可為中藥的療效機制研究提供思路。