張 煒 周欣雅 馬凱麗 李 華 虞功亮 敖鴻毅 霍 達(dá)

(1.青海師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 西寧 810000; 2.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所中國(guó)科學(xué)院藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢430072; 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4.青海省國(guó)家公園科研監(jiān)測(cè)評(píng)估中心, 西寧 810000)

青海湖地處青藏高原東北部, 平均海拔約3200 m,位于我國(guó)東部季風(fēng)區(qū)、西北部干旱區(qū)和西南部高寒區(qū)的交匯地帶[1], 具有明顯的地區(qū)性氣候特點(diǎn), 干旱、少雨、多風(fēng)、太陽輻射強(qiáng)烈和氣溫日較差大,屬于高原半干旱高寒氣候區(qū)[2]。青海湖是我國(guó)最大的內(nèi)陸湖泊和最大的咸水湖[3], 其形成初期屬于淡水湖, 擁有大小入湖河流70余條, 但是由于東邊出水口處日月山的抬升, 使湖盆封閉, 致使湖水無法匯出, 最終湖水性質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)在的微咸水水體[4]。近幾十年來, 青海湖水位不斷上升。這些上升的湖水淹沒周邊的草地及砂石, 形成小型的淺水水體[5]。隨著畜牧業(yè)在青海湖周邊的快速發(fā)展, 高營(yíng)養(yǎng)負(fù)荷土壤也隨著地表徑流沖入這些湖濱淹沒水體中并逐步進(jìn)入青海湖及其子湖, 顯著地改變了水體中微生物的群落結(jié)構(gòu)及其組成[6,7]。

圍繞著青海湖及周邊湖泊的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu), 許多學(xué)者開展了相應(yīng)的工作。Zhang等[8]在青藏高原東北部研究了鹽度及季節(jié)性如何影響自由生活細(xì)菌與顆粒附著型細(xì)菌的群落裝配。研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)散限制決定了淡水湖泊的群落組裝而隨著鹽度增加,異質(zhì)性選擇逐漸成為群落裝配的決定性因素。Ren等[9]在青海湖主湖和子湖水體中進(jìn)行了微生物群落結(jié)構(gòu)的調(diào)查, 研究發(fā)現(xiàn)溪流和湖泊中的微生物群落在豐度上具有顯著差異, 這些差異導(dǎo)致了微生物代謝潛力的顯著差別。這些研究暗示生境多樣性顯著地影響青海湖的微生物群落結(jié)構(gòu)。有關(guān)海湖流域內(nèi)不同類型的子湖及湖水淹沒區(qū)等水體的研究尚未見報(bào)道, 因此對(duì)于這些不同類型的水體與青海湖高度相關(guān)并具有重要的生態(tài)功能亟待進(jìn)一步研究。

浮游細(xì)菌驅(qū)動(dòng)湖泊生態(tài)系統(tǒng)中多種元素循環(huán),在分解有機(jī)質(zhì)和驅(qū)動(dòng)能量流動(dòng)等方面發(fā)揮了重要的作用[10]。游離生活型浮游細(xì)菌具有極高的多樣性, 他們數(shù)量龐大、循環(huán)迅速及響應(yīng)環(huán)境變化靈敏,是水體元素循環(huán)最主要的驅(qū)動(dòng)者[11]。附著型浮游細(xì)菌依靠黏附在動(dòng)物、植物和微生物群體上生存,他們的代謝模式往往與其附著的生物高度關(guān)聯(lián)[12]。大量研究揭示傳統(tǒng)基于培養(yǎng)的微生物多樣性研究具有很大的局限性[13]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展, 全面深度的測(cè)序?qū)⒔沂疚⑸飶V泛的多樣性。由此, 微生物地理學(xué), 即不同生存類型的微生物, 經(jīng)過棲居地的環(huán)境條件篩選, 形成具有本土特征的微生物多樣性格局成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[14]。

微生物棲居環(huán)境是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素。在同一水體中, 不同類型棲居地微生物群落差異的研究可更好地了解水環(huán)境微生物如何適應(yīng)環(huán)境變化。近年來, 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,微生物多樣性的研究不再局限于可培養(yǎng)微生物的調(diào)查?；诟咄繙y(cè)序技術(shù)的擴(kuò)增子測(cè)序使得對(duì)特殊生境中微生物的大范圍研究成為可能[15]。受全球氣候變化的影響, 青藏高原氣候趨于變暖變濕,青海湖亦受影響。2004年起青海湖水位保持抬升、水域面積持續(xù)增大。如今青海湖水位上漲, 湖水淹沒周邊放牧的緩地草原, 這種水位的抬升給青海湖帶來了豐富的氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽, 提高了湖水的營(yíng)養(yǎng)水平, 同時(shí)也形成了具有局部聯(lián)通性的破碎化斑塊。這為我們提供了研究不同類型水體中微生物群落變化的研究模型。

本研究將青海湖主湖與周邊湖濱淹沒區(qū)水體構(gòu)成的關(guān)聯(lián)水體作為研究模型, 探究微生物群落結(jié)構(gòu)在不同水體類型中的變化, 探究在不同類型水體中特化的可能具有關(guān)鍵代謝功能的微生物群體, 為進(jìn)一步了解微生物驅(qū)動(dòng)高原鹽堿湖泊的能量代謝過程提供幫助。

1 材料與方法

1.1 采樣方法、時(shí)間及區(qū)域

本次調(diào)查于2020年8月在青海湖共設(shè)置主湖區(qū)樣點(diǎn)16個(gè), 不同類型湖濱帶淹沒區(qū)樣點(diǎn)11個(gè), 現(xiàn)場(chǎng)采用YSI多功能水質(zhì)分析儀進(jìn)行pH、溶解氧(DO)、水溫(T)、TDS和鹽度的檢測(cè)。對(duì)調(diào)查區(qū)域主湖區(qū)及濱湖淹沒區(qū)均采用北原式采水器采取表層水, 將部分水用于浮游細(xì)菌的過濾, 剩余水樣進(jìn)行水化學(xué)指標(biāo)測(cè)定。總磷、溶解性磷、總氮、硝酸鹽、氨氮、亞硝酸鹽及高錳酸鹽指數(shù)參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行檢測(cè)。采樣點(diǎn)具體坐標(biāo)如圖1所示。

圖1 采樣點(diǎn)示意圖Fig.1 Diagram of sampling sites

1.2 樣品采集、處理及DNA高通量測(cè)序

將適量體積的(200—500 mL)的水樣利用負(fù)壓抽濾裝置富集至聚碳酸酯膜(0.2 μm Millipore GTTP04700)抽干, 錫紙包裹, 并避光低溫(–80℃)保存,以備水體總DNA提取。DNA提取使用經(jīng)典的苯酚-氯仿-乙醇沉淀法, 具體操作步驟見參考文獻(xiàn)[15]。采用細(xì)菌16S rRNA基因V3—V4區(qū)通用引物對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系中包含: 1 μL DNA模板, 3 μL 25 mmol/L MgSO4, 5 μL 25 mmol/L dNTPs, 1 μL每個(gè)雙端引物(338F: 5′-ACTCCTA CGGGAGGCAGCA-3′; 806R: 5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′)[17], 10 μL 5 × Fast Pfu聚合酶,純水補(bǔ)足體系。擴(kuò)增程序如下: 98℃預(yù)變性2min,30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(98℃變性30s, 50℃退火30s, 72℃延伸60s), 72℃終延伸5min, 4℃保溫。PCR產(chǎn)物純化后檢測(cè)其純度, 并使用Qubit 2.0進(jìn)行DNA濃度的定量。參照說明書構(gòu)建雙端300 bp(PE300)文庫(kù), 使用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

二代擴(kuò)增子高通量下機(jī)樣品數(shù)據(jù)使用QIIME 2分析[18]。使用Trimmomatic[19]過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)。使用Usearch的Unoise 3[20]算法進(jìn)行降噪、去除嵌合體得到擴(kuò)增子序列變異和特征表, 得到的ZOTUs使用SILVA 132數(shù)據(jù)庫(kù)[21]進(jìn)行注釋。將得到的OTU Table根據(jù)獲得的最低豐度樣品進(jìn)行抽平, 利用R語言stat包和dplyr包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 各分類單位的豐度采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式進(jìn)行表示。數(shù)據(jù)均值比較方式為Welcoxon秩和檢驗(yàn)。采用 R語言的Vegan包進(jìn)行OTU的α多樣性分析、β多樣性分析。環(huán)境因子數(shù)據(jù)與物種分布數(shù)據(jù)采用消除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(Detrended correspondence analysis, DCA)后根據(jù)特征根值選擇最終分析模型為RDA。使用R語言vegan包的rda()進(jìn)行模型構(gòu)建, 并使用單因素方差分析(ANOVA)模型參數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 青海湖主湖區(qū)與淹沒區(qū)浮游細(xì)菌群落相對(duì)豐度差異分析

通過16S高通量擴(kuò)增子測(cè)序分析發(fā)現(xiàn), 青海湖主湖區(qū)及淹沒區(qū)在分類門水平上相對(duì)豐度最高的為變形菌門(Proteobacteria, 44.8%), 且數(shù)據(jù)波動(dòng)較小(標(biāo)準(zhǔn)差5.3%), 其次是擬桿菌門(Bacteroidetes,25.9%±7.8%)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria, 13.6%±5.4%)、放線菌門(Actinobacteria, 7.54%±9%)、柔壁菌門(Tenericutes, 3.32%±2%)。數(shù)據(jù)表明變形菌門和擬桿菌門的細(xì)菌在青海湖主湖及湖濱淹沒區(qū)中均廣泛存在(圖2A)。從門級(jí)水平上來看, 青海湖主湖和湖濱淹沒區(qū)的微生物豐度差異很大(圖2B)。對(duì)于高豐度微生物來說, 主湖與淹沒區(qū)在高豐度物種的組成差異是顯著的。在wilcox 差異檢驗(yàn)中除一些低豐度類群, 如酸桿菌門(Acidobacteria)、 熱境絲菌門(Caldiserica)、CandidatusDependentiae、出芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和暫定名稱馬爾古利斯氏菌門(CandidatusMargulisbacteria)以外,其余各門均存在極顯著差異(P<0.01)。藍(lán)細(xì)菌門在主湖中相對(duì)豐度顯著高于淹沒區(qū)且總豐度較高。

圖2 青海湖細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門級(jí)差異Fig.2 Bacterial community structure in Qinghai Lake at Phylum level

從屬級(jí)水平來看(圖3), 水月亮菌屬(Aquiluna)、玫瑰色桿菌屬(Roseibacterium)及MWH-UniP1類群在淹沒區(qū)的豐度顯著高于青海湖主湖區(qū)。與之相對(duì)應(yīng)的是Ambiguous、LD29、Nodosilinea、極地桿菌屬(Polaribacter)、Polycyclovorans及未培養(yǎng)細(xì)菌的豐度在青海湖主湖相對(duì)較高(P<0.05)。這些微生物的在兩個(gè)區(qū)域中的差異暗示了這些微生物在不同環(huán)境下表現(xiàn)出各自不同的功能。

圖3 屬水平分類下各豐富細(xì)菌分布差異(僅相對(duì)豐度>1%的分類元納入統(tǒng)計(jì))Fig.3 Differences in the distribution of abundant bacteria at the genus level (Only taxa with relative abundance >1% are included in the statistics)

2.2 物種多樣性指數(shù)分析

我們使用Shannon-Winner指數(shù)法分析了青海湖及濱湖淹沒區(qū)各樣品的多樣性, 結(jié)果表明, 淹沒區(qū)樣品微生物多樣性顯著高于主湖水體中(圖4)。兩者平均值分別為4.01±0.145和3.67±0.136。Chao1多樣性趨勢(shì)與Shannon多樣性相同, 淹沒區(qū)樣品多樣性顯著高于青海湖主湖。(Wilcoxon test,P<0.01)這表明淹沒區(qū)水體微生物的種類更為豐富?；诜嵌攘慷嗑S尺度法分析樣品間的差異表明, 青海湖主湖的微生物群落結(jié)構(gòu)較為集中, 且與淹沒區(qū)水體可以較為明顯的在二維坐標(biāo)系下被區(qū)分; 而淹沒區(qū)水體的微生物群落結(jié)構(gòu)差異度則相對(duì)較大(圖5)。個(gè)別樣品與其他樣品在降維結(jié)果中相離較遠(yuǎn), 這可能是由淹沒區(qū)水體的復(fù)雜環(huán)境構(gòu)成決定的。對(duì)于樣品的Beta多樣性, 我們使用4種不同的方式計(jì)算了樣品間的群落相似性。我們計(jì)算了樣品間的Jaccard距離和Bray距離并分別使用Hclust聚類及UPGMA方式進(jìn)行聚類, 為了便于理解樣品間的相似性, 結(jié)果以(1- Distance)呈現(xiàn)。四種分析結(jié)果均與NMDS的降維分析結(jié)果一致。青海湖的大多數(shù)樣品間群落結(jié)構(gòu)存在極高的相似性(圖6)。這表現(xiàn)在Beta多樣性距離矩陣聚在一起。僅有QHH07及QHH15樣點(diǎn)與淹沒區(qū)樣品存在一定的相似性。對(duì)于淹沒區(qū)樣品來說YMQ.05樣品則與本研究中所有的其他樣品差異度都很大, 其他各樣品均遵循相同生境相似的群落結(jié)構(gòu)。

圖4 青海湖及濱湖淹沒區(qū)物種多樣性的Alpha多樣性指數(shù)Fig.4 Alpha diversity index of species diversity in Qinghai Lake and the inundation area

圖5 物種群落結(jié)構(gòu)的非度量多維尺度法分析Fig.5 A non-metric multidimensional scaling approach to the analysis of species community structure

圖6 樣品間Beta多樣性分析Fig.6 Beta diversity analysis between samples

從水化學(xué)指標(biāo)來看, 除總氮、總磷、水溫和氨氮外, 青海湖主湖與淹沒區(qū)在多個(gè)化學(xué)指標(biāo)均呈現(xiàn)顯著差異。其中pH、TDS和硝酸鹽為極顯著差異(P<0.001)。淹沒區(qū)水體相較于青海湖主湖呈現(xiàn)出高pH、高可溶磷及高亞硝酸鹽的趨勢(shì)。青海湖主湖則有更高的可溶性有機(jī)物、硝酸鹽和鹽度(圖7)。RDA分析(圖8)顯示影響青海湖主湖與淹沒區(qū)分布差異的主要環(huán)境因子是pH(ANOVA,P<0.001)、總磷(P<0.05)和溫度(P<0.05)。這說明, 雖然淹沒區(qū)與青海湖主湖中差異環(huán)境因子眾多, 但影響物種豐度分布的環(huán)境因子十分有限。

圖7 青海湖主湖與淹沒區(qū)水化學(xué)指標(biāo)差異Fig.7 Differences in water chemistry indicators between the main lake and the inundated area of Qinghai Lake

圖8 環(huán)境因子與物種分布相關(guān)的冗余分析Fig.8 Redundancy analysis showing the relationship between environmental factors and species distribution

3 討論

青海湖水體中變形菌、擬桿菌與藍(lán)細(xì)菌是豐度較高的類群, 與之前其他的青海湖水體研究結(jié)果一致[22]。同時(shí)也與一些淡水水體中的研究相同[23],這表明了這些類群在淡水生態(tài)系統(tǒng)中的基礎(chǔ)性作用以及其對(duì)于鹽度的廣泛適應(yīng)性。值得注意的是:在青海湖中節(jié)線藻(Nodosilinea)的總體豐度很高,同時(shí)在主湖水體的豐度顯著高于淹沒區(qū)。這表明該類群適應(yīng)高鹽度浮游生存環(huán)境。節(jié)線藻在最近的研究中被報(bào)道在淡水[24]和陸地生態(tài)系統(tǒng)[25]中廣泛分布, 有些研究還發(fā)現(xiàn)了部分節(jié)線藻可以進(jìn)行固氮[26]。最近的一項(xiàng)研究在加拿大高原堿水湖泊沉積物中發(fā)現(xiàn)了與亞洲湖泊沉積物高度一致的核心微生物類群[27]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了節(jié)線藻在高原咸水湖泊的碳、氮循環(huán)中可能發(fā)揮著重要作用。

之前對(duì)于青海湖微生物群落特征已有一些報(bào)道, Ren等[9]對(duì)青海湖流域的湖水和入湖河流的微生物群落進(jìn)行了密集的實(shí)地采樣, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)入湖河流和青海湖主湖水體中的微生物多樣性存在差異,且群落的Beta多樣性結(jié)構(gòu)與功能多樣性密切相關(guān)。在本研究中, 青海湖主湖中的微生物群落保持較高的一致性, 表現(xiàn)在Beta多樣性分析中主湖點(diǎn)位的高度聚集, 同時(shí)Alpha多樣性指數(shù)的平均值波動(dòng)較小, 這說明青海湖主湖水體混合較為均勻, 區(qū)域特征不明顯。微生物在水環(huán)境中承擔(dān)著重要的元素循環(huán)作用, 復(fù)雜的微生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成與環(huán)境互作使得群落結(jié)構(gòu)響應(yīng)環(huán)境變化過程十分靈敏[28]。結(jié)合水化學(xué)指標(biāo)的特征我們發(fā)現(xiàn), 青海湖淹沒區(qū)中亞硝酸鹽、可溶性磷指標(biāo)相對(duì)較高, 這些元素往往是水體中較為活躍的元素。亞硝酸鹽是硝化作用的中間產(chǎn)物, 能夠通過氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌之間的緊密配合立刻轉(zhuǎn)化為硝酸鹽[29]。同樣的可溶性磷容易被藻類利用, 最終結(jié)合為有機(jī)磷等更為穩(wěn)定的形式被保存在湖泊中[30]。在本研究中, 更高的多樣性可能給青海湖淹沒區(qū)水體帶來更多種類的分解者。淹沒區(qū)的總可溶性有機(jī)物在淹沒區(qū)顯著更低說明這些分解者將水體中的有機(jī)物分解, 將小的顆粒懸浮物分解成為其他浮游生物可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。淹沒區(qū)更低的鹽度可能給更多的分解者生存提供了有利的空間。

青海湖淹沒區(qū)在歷史上曾經(jīng)是裸露的草地、土地或是砂石, 水位上升被淹沒后, 原本生存在這些植物、礦物表面的微生物經(jīng)過水體沖刷進(jìn)入到淹沒區(qū)中, 這使得淹沒區(qū)水體中出現(xiàn)了相對(duì)較高比例的附著性微生物。對(duì)于附著型微生物來說, 其生存依賴于附著基質(zhì), 這決定了這些微生物類群在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝模式上與浮游類群存在明顯的差異。Yang等[22]的研究對(duì)青海湖水體的表面沉積物進(jìn)行了高通量測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 青海湖沉積物表面的微生物群落組成主要受到鹽度而非地理距離的影響。我們的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于淹沒區(qū)水體微生物與主湖類群顯著不同, 且不同附著基質(zhì)間也存在少量差異。根據(jù)我們系統(tǒng)的分析, 淹沒區(qū)特定屬豐度顯著高于主湖區(qū), 例如Aquiluna, 由于其不可培養(yǎng)性, 對(duì)于其研究?jī)H限于近年來基于測(cè)序技術(shù)的研究。Leoni等[31]首次報(bào)道了Aquiluna在鹽度約為14.5%的水體中的存在。我們?cè)谇嗪：难芯窟M(jìn)一步推測(cè)Aquiluna在具有固著物的淹沒區(qū)水體中豐度較高, 暗示了其生活習(xí)性可能偏向黏附在基質(zhì)上, 且具有較強(qiáng)的鹽度耐受能力。相比之下, 針對(duì)Roseibacterium及MWHUniP1在咸水中的研究已經(jīng)比較多[32], 這些種類所具有的共同特點(diǎn)是都常被發(fā)現(xiàn)在咸水底質(zhì)或沼澤中, 暗示了對(duì)于這一類生境的獨(dú)特適應(yīng)性。

4 結(jié)論

本研究將青海湖主湖水體與其相關(guān)的淹沒區(qū)水體進(jìn)行了種群結(jié)構(gòu)及其多樣性的比較, 闡明了不同類型水體的微生物群落結(jié)構(gòu)特征。青海湖主湖微生物群落結(jié)構(gòu)在各采樣點(diǎn)間差異較小, 證明了青海湖主湖的水體混合較為均勻。與之相對(duì)應(yīng)的是在淹沒區(qū)水體中, 不同的附著基質(zhì)造成了各區(qū)域的微生物差異較大。淹沒區(qū)水體中富集的微生物差異類群展現(xiàn)出了明顯的營(yíng)附著生存特征。值得注意的是, 造成兩種水體藍(lán)藻豐度最大的屬是節(jié)線藻屬, 我們的研究發(fā)現(xiàn)這種絲狀藍(lán)細(xì)菌在青海湖主湖各個(gè)樣點(diǎn)均廣泛存在, 且主湖豐度顯著高于淹沒區(qū),這暗示節(jié)線藻可以適應(yīng)咸水環(huán)境在驅(qū)動(dòng)咸水水體的元素循環(huán)中發(fā)揮巨大作用。

致謝:

感謝中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所的王一郎博士、陳友信博士在樣品收集及整理中的幫助, 同時(shí)感謝天津農(nóng)學(xué)院的曹琪同學(xué)在文章修改過程中的工作。