張得芳，于 倩，史文君

（青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810016）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光集團(tuán)（帶有熒光標(biāo)記的特異性探針等），并利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)DNA模板進(jìn)行定量分析的方法，常用于檢測(cè)基因表達(dá)譜、基因表達(dá)量分析、轉(zhuǎn)錄組結(jié)果驗(yàn)證分析等方面[1]，是一種應(yīng)用廣泛、靈敏度高[2]的分析方法。在qRT-PCR的分析過(guò)程中，多種因素如RNA和cDNA的濃度純度[3]、各階段的反應(yīng)條件等都會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生影響[4]，選擇表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因可對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)進(jìn)行準(zhǔn)確校正，從而減小數(shù)據(jù)誤差[5]，不恰當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因會(huì)導(dǎo)致表達(dá)譜的偏移從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]，因此選擇合適的內(nèi)參基因?qū)υ囼?yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

內(nèi)參基因是在基因表達(dá)過(guò)程中不受溫度等外部條件影響且在不同樣品中均穩(wěn)定表達(dá)的參照基因[7]，利用這個(gè)基因的表達(dá)水平可以準(zhǔn)確量化初始材料的載量。管家基因在所有細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，因此在進(jìn)行基因表達(dá)水平的研究時(shí)常用其作為內(nèi)參基因進(jìn)行試驗(yàn)。常見(jiàn)的管家基因有：肌動(dòng)蛋白基因（ACT/Actin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（EF1α）、多聚泛素酶基因（UBI/UBQ）、18S核糖體RNA（18S）、β2-微球蛋白基因（B2M）和親環(huán)蛋白基因（CYP）等[8]?，F(xiàn)有的研究表明，在所有組織、發(fā)育時(shí)期、生理?xiàng)l件下均穩(wěn)定表達(dá)的理想內(nèi)參基因并不存在，所以其表達(dá)的穩(wěn)定性是相對(duì)的，需要研究者根據(jù)自己的樣品類型及試驗(yàn)條件來(lái)選擇合適的內(nèi)參基因。由于時(shí)空的變化，RNA的表達(dá)水平并不恒定的，細(xì)胞周期的不同階段內(nèi)以及不同類型的細(xì)胞或組織都可能存在差異，因此需要根據(jù)實(shí)際研究的細(xì)胞和組織類型以及實(shí)驗(yàn)要求，從多種內(nèi)參基因中篩選出適合自己試驗(yàn)的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，同時(shí)也可以選擇多內(nèi)參基因的研究方法，設(shè)置兩個(gè)或兩個(gè)以上的內(nèi)參基因，取均值后校正目的基因，從而得到更可靠的結(jié)果。常見(jiàn)的內(nèi)參基因在不同植物[9]、不同處理的樣本中表達(dá)并不穩(wěn)定，盲目選擇不適宜的內(nèi)參基因往往會(huì)導(dǎo)致結(jié)果分析的偏離甚至得到錯(cuò)誤結(jié)論[10]，所以研究特定植物表達(dá)模式前進(jìn)行其內(nèi)參基因篩選是很有必要的。正確選擇內(nèi)參基因，很大程度上依賴于所研究的細(xì)胞或組織及試驗(yàn)條件，不同的試驗(yàn)需要尋找適合試驗(yàn)體系的內(nèi)參基因[11]。現(xiàn)已篩選出在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[12]、茄子（Solanum melongema）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、蘋果（Malus pumila）、棉花（Gossypium hirsutum）、甘蔗（Saccharum officinarum）、銀杏（Ginkgo biloba）、杉木（Cunninghamia lanceolata）等植物中在特定條件或組織部位中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，用于植物基因表達(dá)譜表達(dá)分析、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和脅迫下作用機(jī)制等方面的研究。

寧夏枸杞（Lycium barbarum）和黑果枸杞（Lycium ruthenicum）均為茄科枸杞屬灌木，耐鹽堿、干旱、荒漠，常在綠化造林中用作水土保持的樹種，在我國(guó)西北等地體現(xiàn)出較高的生態(tài)價(jià)值，也是中國(guó)特有的藥食同源類植物[13]，具有較高的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。目前枸杞的研究大部分主要集中在育種栽培、化學(xué)成分分析、藥理學(xué)與臨床應(yīng)用、食品及食品保健品開(kāi)發(fā)等方面，對(duì)于枸杞耐鹽性的相關(guān)報(bào)道大多是生理生化變化等內(nèi)容，關(guān)于離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控機(jī)制及相關(guān)基因的功能研究方面涉及比較少，有待于進(jìn)行更多、更全面地研究來(lái)填補(bǔ)空缺，因此對(duì)于枸杞抗鹽堿的研究具有重要的意義。

本研究在枸杞以及其他茄科植物如番茄、馬鈴薯、茄子等植物中挑選出GAPDH、Actin、EF1α、UBI、18S這5個(gè)常用基因?yàn)楹蜻x內(nèi)參基因，以不同濃度NaCl處理后的寧夏枸杞、黑果枸杞組培苗的葉片部分為試驗(yàn)材料，對(duì)5個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR等試驗(yàn)，通過(guò)反應(yīng)循環(huán)閾值（Ct）、變異系數(shù)等指標(biāo)分析評(píng)估表達(dá)最穩(wěn)定的基因，并利用GeNorm、Normfinder和BestKeeper軟件進(jìn)行穩(wěn)定性分析，進(jìn)而篩選出最適合寧夏枸杞、黑果枸杞熒光定量PCR的內(nèi)參基因，為后續(xù)通過(guò)qRT-PCR分析枸杞基因表達(dá)趨勢(shì)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)材料選用長(zhǎng)勢(shì)良好的寧夏枸杞和黑果枸杞組培幼苗，將根部培養(yǎng)基洗凈后移至裝有清水的培養(yǎng)瓶中，并對(duì)枸杞幼苗進(jìn)行0（CK），100，200，300，400mmol·L-1NaCl溶液處理培養(yǎng)，每個(gè)濃度均設(shè)置3次重復(fù)，每瓶培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)放5~8株幼苗，處理7d后分別采樣編號(hào)，用液氮速凍后，放置于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 枸杞總RNA的提取與檢測(cè)

稱取400mg不同濃度鹽脅迫后的冷凍枸杞葉片，在液氮中充分研磨，使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Ex‐traction Kit試劑盒提取枸杞葉片部分的總RNA，通過(guò)Nanodrop OneC超微量分光光度計(jì)對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度和純度（OD值）的測(cè)定和檢驗(yàn)，篩選出濃度大于100ng·μL-1且A260/280在1.90~2.20的RNA樣品，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性對(duì)其濃度純度進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 cDNA合成

使用PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。反應(yīng)使用10μL體系：5x PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2μL、Total RNA模板 根據(jù)濃度計(jì)算（最多500ng）、RNase Freed dH2O補(bǔ)充到10μL。反應(yīng)條件為：37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）、85℃5s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA放置于-20℃冰箱中，用于后續(xù)的PCR驗(yàn)證以及qRT-PCR的反應(yīng)。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)枸杞的其他現(xiàn)有研究中篩選出5個(gè)枸杞、番茄、馬鈴薯等茄科植物常用的內(nèi)參基因GAPDH、Actin、EF1α、UBI、18S為候選內(nèi)參基因（表1），通過(guò)NCBI等數(shù)據(jù)平臺(tái)或已有文獻(xiàn)中檢索獲得候選內(nèi)參基因的序列信息，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，長(zhǎng)度20~25bp，CG%為45%~55%，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，在進(jìn)行試驗(yàn)前將上下游引物均稀釋到工作濃度。

表1 候選內(nèi)參基因的qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers of candidate internal reference genes

1.5 普通PCR和qRT-PCR

先通過(guò)普通PCR驗(yàn)證引物的特異性，反應(yīng)體系為25μL，其中包括：模板（第一鏈cDNA）1μL、Premix Taq（Ex TaqVersion 2.0 plus dye）12.5μL、上游引物（20μM）0.5μL、下游引物（20μM）0.5μL、滅菌水10.5μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；95℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min、共35個(gè)循環(huán)、72℃后延伸5min，再通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性驗(yàn)證。

使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，反應(yīng)在BIO-RAD CFX Connect Real-Time Systern（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，上海）qRT-PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)以2μL枸杞第一鏈cDNA為模板，加入TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5μL、PCR Forward Primer（10μM）1μL、PCR Reverse Primer（10μM）1μL、滅菌水8.5μL，體系共25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共50個(gè)循環(huán)，溶解曲線65~95℃，增加0.5℃用時(shí)0.05s。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010對(duì)qRT-PCR結(jié)果中的周期閾值（Ct）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，并用OriginPro 9.1軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖的繪制，評(píng)估其是否適宜用作熒光定量PCR反應(yīng)的內(nèi)參基因。

使用RefFinder平臺(tái)基于GeNorm、Normfinder和BestKeeper軟件算法對(duì)5個(gè)候選基因的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算驗(yàn)證，綜合各方法得到適用于本研究后續(xù)試驗(yàn)中最為準(zhǔn)確、合適的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞RNA的檢測(cè)與引物特異性驗(yàn)證

先使用超微量分光光度計(jì)對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度和純度的檢測(cè)，得到的濃度值均高于100ng·μL-1，OD值（A260/280）在2.00~2.20；通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的RNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1，雙條帶型（18s、28s）清晰無(wú)拖帶，完整度較好，表明提取的枸杞RNA濃度和純度都達(dá)到試驗(yàn)要求，可用于下一步研究。

由圖2可知，以所有候選內(nèi)參基因的cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可知，擴(kuò)增結(jié)果均可得到清晰、單一的特異性條帶，明亮無(wú)雜帶，表明擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，可用于后續(xù)的qRT-PCR試驗(yàn)。

2.2 鹽脅迫條件下枸杞內(nèi)參基因的qRT-PCR分析

以枸杞cDNA為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行熒光定量PCR分析，根據(jù)5個(gè)候選內(nèi)參基因的熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖譜（圖3）可知，在不同濃度的NaCl溶液（0，100，200，300，400mmol·L-1）處理下，熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖譜中均只出現(xiàn)單一主峰，前后無(wú)其他雜峰；由擴(kuò)增曲線（圖4）可知，擴(kuò)增曲線為S型，無(wú)其他異常波動(dòng)，表明熒光定量PCR中引物特異性較好，其中，GAPDH、Actin、EF1α基因的曲線更集中、重復(fù)性高，其引物特異性表現(xiàn)優(yōu)于UBI、18S基因。

M.D2000；1-5.0，100，200，300，400mmol·L-1 NaCl Lycium barbarum；6-10.0，100，200，300，400mmol·L-1 NaCl Lycium ruthenicum

M.D2000；1.GAPDH；2.Actin；3.EF1α；4.UBI；5.18S

圖3 qRT-PCR的熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖譜Figure 3 The melting curve derivative map of qRT-PCR

圖4 qRT-PCR的擴(kuò)增曲線圖譜Figure 4 The amplification curve map of qRT-PCR

5個(gè)候選內(nèi)參基因在經(jīng)不同濃度NaCl處理后的寧夏枸杞與黑果枸杞中的熒光定量PCR結(jié)果如圖5。循環(huán)閾值（Ct）是選擇內(nèi)參基因的重要標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)Ct值的變化趨勢(shì)判斷基因的表達(dá)量穩(wěn)定情況。由圖5可知，5個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值均值大部分集中在18~25之間，其表達(dá)水平存在差異。其中，EF1α、UBI、18S基因的反應(yīng)Ct值變化幅度很大，穩(wěn)定性不高：EF1α基因的表達(dá)情況隨著鹽脅迫濃度的升高呈先下降后上升再下降的情況，且在寧夏枸杞中最高濃度下有所回升；UBI基因的變化趨勢(shì)在寧夏枸杞和黑果枸杞中都為明顯的持續(xù)下調(diào)；18S基因的變化趨勢(shì)為先下降后上升再下降，在黑果枸杞中400mmol·L-1NaCl處理下變化趨勢(shì)又有所上升。綜上，這3個(gè)基因均不宜作為內(nèi)參基因用于熒光定量PCR的試驗(yàn)，且與上述3個(gè)基因相比，GAPDH、Actin基因的穩(wěn)定性較好，其中Actin基因的Ct值變化最小，更適合作為內(nèi)參基因進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 5個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值變化Figure 5 Changes in Ct values of five candidate internal reference genes

2.3 鹽脅迫條件下枸杞內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.3.1 GeNorm軟件分析將不同候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值由高到低進(jìn)行排序，表達(dá)穩(wěn)定值越低代表基因的穩(wěn)定性越好，反之越差，程序默認(rèn)低于1.5的穩(wěn)定值是內(nèi)參基因穩(wěn)定表達(dá)的數(shù)值范圍。由表2可知，寧夏枸杞和黑果枸杞中，排名前兩位的內(nèi)參基因?yàn)锳ctin和GAPDH，其表達(dá)穩(wěn)定值分別為1.142和0.560，小于1.5的預(yù)定范圍，穩(wěn)定性較好，表明這兩個(gè)基因適合作為內(nèi)參基因用于寧夏枸杞和黑果枸杞的qRT-PCR試驗(yàn)中，而EF1α、UBI和18S基因的表達(dá)穩(wěn)定值均大于1.5，這些基因在枸杞中表達(dá)的穩(wěn)定性較差,不適合作為內(nèi)參基因用于后續(xù)反應(yīng)。

表2 GeNorm軟件分析5個(gè)候選內(nèi)參基因在不同條件下的表達(dá)穩(wěn)定性Table 2 GeNorm analysis of five candidate reference genes with respect to their expression stability under different conditions

2.3.2 NormFinder軟件軟件得出的數(shù)據(jù)中表達(dá)穩(wěn)定值與基因穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，即數(shù)值越小，基因的表達(dá)越穩(wěn)定。由表3可知，寧夏枸杞中，候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值由低到高依次為UBI、Actin、GAPDH、EF1α和18S，黑果枸杞中由低到高排序依次為Actin、GAPDH、EF1α、18S、UBI，Actin基因的表達(dá)穩(wěn)定值最小，即穩(wěn)定性最好。

表3 NormFinder軟件分析5個(gè)候選內(nèi)參基因在不同條件下的表達(dá)穩(wěn)定性Table 3 NormFinder analysis of five candidate reference genes with respect to their expression stability under different conditions

2.3.3 BestKeeper軟件通過(guò)qRT-PCR反應(yīng)得出的Ct值判斷內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定程度，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）越低的基因表達(dá)的穩(wěn)定性越好。由表4可知，5個(gè)候選內(nèi)參基因中，GAPDH、EF1α、UBI、18S基因在寧夏枸杞和黑果枸杞中的標(biāo)準(zhǔn)差大于1，即這些基因的表達(dá)在本試驗(yàn)中鹽脅迫條件下不穩(wěn)定，不宜作為鹽脅迫試驗(yàn)中用作后續(xù)熒光定量PCR試驗(yàn)的內(nèi)參基因使用。綜合兩種枸杞中基因的表達(dá)情況，Actin基因的標(biāo)準(zhǔn)差均小于1，表達(dá)的穩(wěn)定性最高。

表4 BestKeeper軟件分析5個(gè)候選內(nèi)參基因在不同條件下的表達(dá)穩(wěn)定性Table 4 BestKeeper analysis of five candidate reference genes with respect to their expression stability under different conditions

2.3.4 綜合分析由表5可知，本試驗(yàn)以經(jīng)過(guò)不同濃度NaCl脅迫后的寧夏枸杞和黑果枸杞幼苗的葉片部分為材料，根據(jù)不同軟件算法綜合排名以及qRT-PCR結(jié)果篩選出的最適合進(jìn)行寧夏枸杞與黑果枸杞實(shí)時(shí)熒光定量分析試驗(yàn)的內(nèi)參基因?yàn)锳ctin基因，EF1α、UBI和18S基因的表達(dá)穩(wěn)定性較差,不適合用作內(nèi)參基因。

表5 5個(gè)候選內(nèi)參基因在不同條件下表達(dá)穩(wěn)定性的綜合分析Table 5 Comprehensive analysis of expression stability of five candidate reference genes under different conditions

3 討論與結(jié)論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR因其靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性、范圍廣等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于mRNA定量分析、基因表達(dá)譜等多方面研究中，其試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性主要依托于根據(jù)不同類型的植物樣本以及反應(yīng)進(jìn)行的條件選擇合適的內(nèi)參基因。在qRT-PCR中，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性非常重要，直接影響著試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行表達(dá)分析時(shí)，選擇多個(gè)內(nèi)參基因作為校正標(biāo)準(zhǔn)，更有利于研究的準(zhǔn)確進(jìn)行。GeNorm、Norm‐Finder和BestKeeper程序在對(duì)參考基因的打分排名中會(huì)產(chǎn)生輕微的差異[14]，這可以由統(tǒng)計(jì)算法的差異來(lái)解釋[11]。本研究使用了3種不同的統(tǒng)計(jì)算法，結(jié)合熒光定量反應(yīng)中各基因的表現(xiàn)，盡量減少參考基因穩(wěn)定性評(píng)估中可能出現(xiàn)的偏差。

GAPDH基因是光合作用固氮循環(huán)、糖降解、糖異生等反應(yīng)的關(guān)鍵因子，是最常用的內(nèi)參基因之一，因其同源性較低，較為獨(dú)特[15]。CRYSTIAN等[16]對(duì)甘蔗在不同脅迫條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因進(jìn)行篩選得出，GAPDH基因在所有軟件中表現(xiàn)最穩(wěn)定，表明其適用于甘蔗干旱脅迫的基因表達(dá)研究；WANG等[17]對(duì)不同組織部位和鹽堿、干旱脅迫下的棉花內(nèi)參基因進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，GAPDH和UBQ7基因均可作為內(nèi)參基因用于根、葉片的鹽堿以及干旱條件下熒光定量分析中，適用范圍較廣。但也有研究表明GAPDH基因在某些特定條件下其表達(dá)存在不穩(wěn)定性，L?VDAL等[18]對(duì)不同非生物脅迫下番茄內(nèi)參基因篩選結(jié)果表明，GAPDH和PGK基因在光脅迫期條件下排名最高，但在氮元素和寒冷脅迫期時(shí)排名不佳。

Actin基因是一類高度保守的球狀微絲結(jié)構(gòu)蛋白，可分為α、β、γ 3種，β-Actin基因在不同組織中的表達(dá)量最高、變化量最小[19]，也作為內(nèi)參基因廣為使用。蘇西婭等[20]對(duì)銀杏雌雄株不同組織部位的最適內(nèi)參基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同候選基因的穩(wěn)定性有所不同，GbUBQ在不同發(fā)育時(shí)期的雄株葉片中表達(dá)最穩(wěn)定，GbACT在雌株葉片表達(dá)最穩(wěn)定。EF1α是細(xì)胞內(nèi)含量?jī)H次于肌動(dòng)蛋白的蛋白質(zhì)因子，其基因在根和葉片中穩(wěn)定高度保守性表達(dá)[21]。NICOT等[22]使用GeNorm軟件對(duì)馬鈴薯進(jìn)行了寒冷、鹽堿等非生物脅迫，結(jié)果表明EF1α表現(xiàn)最穩(wěn)定；樊連梅等[23]對(duì)蘋果果實(shí)著色期的qRT-PCR理想內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，結(jié)果表明EF-1α的表達(dá)水平高且最穩(wěn)定；但DA CRUZSARAIVA等[24]在大豆的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因在不同的發(fā)育時(shí)期和不同條件的脅迫下表達(dá)量會(huì)有不同程度的變化，其穩(wěn)定性表現(xiàn)不佳。

UBI/UBQ基因是泛素家族基因，主要作用于蛋白質(zhì)的降解過(guò)程[25]，該基因在同一物種的不同品系之間以及不同的軟件之間的計(jì)算結(jié)果都會(huì)顯示出基因表達(dá)的差異，但是在紫花苜蓿（Medicago lupulina）的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)在不同濃度的鋅脅迫下處于比較穩(wěn)定的狀態(tài)[26]；AULER等[27]在水稻內(nèi)參基因的研究中發(fā)現(xiàn)UBQ5基因可作為內(nèi)參基因用于所有樣品和軟件的評(píng)估，在基因表達(dá)時(shí)穩(wěn)定性表現(xiàn)較好。

18S基因主要在維持細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)代謝等途徑發(fā)揮作用[28]，是真核生物細(xì)胞中最保守的基因之一[29]。MIKA‐MI等[30]在對(duì)紅毛菜屬植物的研究中發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)缺乏、鹽脅迫和溫度脅迫條件下，18S基因的表達(dá)也會(huì)出現(xiàn)隨著脅迫時(shí)間和濃度的變化而變化的現(xiàn)象。這些基因因其特定的表達(dá)特點(diǎn)常被用作內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR分析。

研究表明，在不同處理、不同植物組織中，最適合的內(nèi)參基因存在差異。鹽堿環(huán)境等非生物脅迫會(huì)影響到植物中的看家基因的表達(dá)量。例如，GALLI等[31]在草莓（Fragaria ananassa）的鹽脅迫發(fā)現(xiàn)GAPDH基因的表達(dá)水平隨著鹽堿的濃度而改變；ZHANG等[32]對(duì)罌粟（Papaver somniferum）中的研究表明，不同的脅迫處理也影響著看家基因的表達(dá)量；CHEN等[33]對(duì)狗牙根（Cynodon dactylon）的8個(gè)參考基因在不同非生物條件脅迫下的基因表達(dá)進(jìn)行研究得出，在鹽、干旱、冷和熱脅迫下在葉和根中不同的基因表現(xiàn)出差異表達(dá)穩(wěn)定性，PP2A和CACS的表達(dá)水平在鹽脅迫下的根和葉中、干旱脅迫下的葉中以及冷熱脅迫下的根中的表達(dá)水平穩(wěn)定，EF1α和TIP41在干旱脅迫植物的根中表達(dá)穩(wěn)定，UPL7、TUB和GAPDH在冷脅迫下在葉片中穩(wěn)定表達(dá)，PP2A和TIP41在熱脅迫下的葉片中是穩(wěn)定的。因此，針對(duì)不同處理、不同組織部位的植物樣品，在進(jìn)行不同的qRT-PCR反應(yīng)時(shí)應(yīng)選擇與之對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因，不應(yīng)一概而論，這也在一定程度上表明了進(jìn)行表達(dá)分析時(shí)篩選合適內(nèi)參基因的重要性。

本研究從5個(gè)候選基因中篩選出Actin基因的表達(dá)的穩(wěn)定性最高，其表達(dá)并沒(méi)有受到不同脅迫處理的影響，是最適合寧夏枸杞、黑果枸杞qRT-PCR反應(yīng)進(jìn)行的內(nèi)參基因，保證了后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，也為后續(xù)對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)模式分析以及在鹽脅迫條件下的抗逆機(jī)制等方面的研究提供理論指導(dǎo)。