劉卉琳，曲 超，肖 蓉，周曉晨，劉 紹

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南匯湘軒生物科技股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410323）

動(dòng)物的骨骼是由蛋白質(zhì)和鈣等物質(zhì)組成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成的管子，管內(nèi)充滿骨髓，營(yíng)養(yǎng)極為豐富[1]。新鮮畜禽骨中蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量與鮮肉接近[2]，均含有豐富的氨基酸[3]；鮮骨中還含有人體生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，例如人腦發(fā)育不可缺少的磷脂質(zhì)、磷蛋白，防止衰老作用的軟骨素[4-5]以及維生素A、B[6]等；骨骼中的磷酸鈣、骨膠原、骨粘蛋白是老人和小孩必需補(bǔ)充的鈣元素的有效來(lái)源；另外，骨骼中的磷鐵等微量元素是鮮肉中的數(shù)倍[7-9]。

豬骨是肉制品加工過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。豬骨中全價(jià)的可溶性蛋白含量較高，且鈣、鐵、鋅、磷等礦物質(zhì)元素的比例適中，易被人體吸收。豬骨經(jīng)相應(yīng)蛋白酶水解后，可生成亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸等多種氨基酸[10-11]，生物學(xué)效價(jià)高。因此，豬骨是食品加工領(lǐng)域一種優(yōu)質(zhì)廉價(jià)且易得的天然資源，應(yīng)用前景廣闊[12-15]。

該研究以新鮮豬骨制備的豬骨泥為材料制作了一款風(fēng)味豬骨膏，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)豬骨泥酶解[16-18]條件和美拉德反應(yīng)配方進(jìn)行了優(yōu)化，并根據(jù)豬骨膏的品質(zhì)特點(diǎn)，選用市售豬骨高湯膏與試驗(yàn)所得風(fēng)味豬骨膏進(jìn)行質(zhì)構(gòu)比較，為豬骨膏的工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試豬骨泥由長(zhǎng)沙市聰廚食品有限公司提供；試驗(yàn)用酶為風(fēng)味蛋白酶、蛋白酶型S（武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司九龍分公司）；其他試劑還包括增香劑（東莞市大彎區(qū)食品有限公司），L-半胱氨酸、木糖、葡萄糖，食品級(jí)，市售；姜、鹽、料酒、玉米淀粉、麥芽糊精、葡萄糖（市售）。參考了相關(guān)資料，經(jīng)過(guò)多次預(yù)試驗(yàn)后初步確定豬骨膏的基礎(chǔ)配方為：豬骨酶解液100 mL、根據(jù)酶解液質(zhì)量加入3%葡萄糖、5.0%木糖、0.3%L-半胱氨酸、0.2%硫胺素、1.5%食鹽、1.8%增味劑、0.8%玉米淀粉、1.5%麥芽糊精（百分含量均為質(zhì)量比）。

主要儀器與設(shè)備包括電熱恒溫水浴鍋（北京國(guó)華醫(yī)療器械廠）、電子萬(wàn)用爐（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、YP302N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司）、電子分析天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限責(zé)任公司）、TA-XT2i Plus 質(zhì)構(gòu)儀（英國(guó)Stable Micro System 公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬骨膏的制作工藝流程（1）原料的預(yù)處理。稱取已解凍的豬骨泥100 g，放入鍋中，加入10 g 料酒、適量姜于沸水之中，預(yù)煮3 min 后，撇去浮沫，過(guò)濾，將豬骨泥置于潔凈燒杯中。（2）豬骨酶解液的制備。將預(yù)煮好的豬骨泥以固液比1 ∶4 的比例，置于60℃的恒溫水浴鍋中加熱，根據(jù)選定好的酶比、pH 值在一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行酶解[16-18]。（3）美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備。將酶解產(chǎn)物過(guò)濾，得到豬骨酶解液，加入葡萄糖、木糖和L-半胱氨酸，在電爐上加熱至100℃反應(yīng)1 h，得到美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。（4）風(fēng)味豬骨膏的制備。在美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，加入鹽、增味劑等進(jìn)行調(diào)味，并利用玉米淀粉和麥芽糊精增稠[19-22]，待溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/3，用玻璃棒蘸取少許溶液，0.5 min 內(nèi)溶液不掉下來(lái)時(shí)停止加熱，在冷卻過(guò)程中，加入一定量的硫胺素[23-25]，用玻璃棒緩慢攪拌直至完全冷卻。詳細(xì)流程見(jiàn)圖1。

圖1 風(fēng)味豬骨膏制作流程圖

1.2.2 酶解條件優(yōu)化（1）單因素試驗(yàn)。在參考文獻(xiàn)和初步試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定基礎(chǔ)酶解條件為：稱取100 g 豬骨泥于500 mL 燒杯中，按固液比1 ∶4 加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 值到8.0，根據(jù)豬骨泥的質(zhì)量加入0.7%的蛋白酶（風(fēng)味蛋白酶∶蛋白酶型S=1 ∶2.5），在60℃恒溫水浴中酶解30 min。分別考察酶比（1 ∶1.5、1 ∶2.0、1 ∶2.5、1 ∶3.0、1 ∶3.5、1 ∶4.0）、酶解時(shí)間（20、25、30、35、40、45 min） 和pH 值（6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）對(duì)酶解得率的影響。（2）正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，找到合適的參數(shù)區(qū)間，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)酶解參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以獲得最優(yōu)酶解組合。

1.2.3 美拉德反應(yīng)配方優(yōu)化（1）單因素試驗(yàn)。在參考文獻(xiàn)和初步試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定美拉德反應(yīng)的基本條件為：葡萄糖添加量6%，L-半胱氨酸0.3%，木糖添加量2%，反應(yīng)溫度100°C，pH 值6.5，反應(yīng)時(shí)間1 h。分別考察葡萄糖添加量（5%、5.5%、6%、6.5%、7%）、木糖添加量（1%、1.5%、2%、2.5%、3%）、L-半胱氨酸添加量（0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%）對(duì)豬骨膏感官品質(zhì)的影響。（2）正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，找到合適的參數(shù)區(qū)間，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)3 種物質(zhì)的添加量進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以獲得最佳組配。

1.2.4 市售產(chǎn)品與試驗(yàn)產(chǎn)品的比較根據(jù)豬骨膏的品質(zhì)特點(diǎn)，選用市售豬骨高湯膏與試驗(yàn)所得風(fēng)味豬骨膏進(jìn)行質(zhì)構(gòu)比較。

1.3 考察指標(biāo)及方法

1.3.1 酶解得率按公式（1）計(jì)算酶解得率。

酶解得率（%）=（豬骨泥質(zhì)量-酶解殘留物質(zhì)量）÷豬骨泥質(zhì)量×100 （1）

1.3.2 感官評(píng)價(jià)挑選年齡在20～22 歲的10 名測(cè)評(píng)員（5 名男性和5 名女性）組成感官評(píng)價(jià)小組，正式評(píng)價(jià)前進(jìn)行專業(yè)訓(xùn)練，熟悉風(fēng)味豬骨膏的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（表1），能夠較好地區(qū)分不同風(fēng)味豬骨膏的感官特征。

表1 風(fēng)味豬骨膏感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 質(zhì)構(gòu)分析采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定豬骨高湯膏與試驗(yàn)所得風(fēng)味豬骨膏的硬度、粘性指數(shù)、內(nèi)聚性等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)，每組樣品進(jìn)行4 次平行檢測(cè)，質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)如下：P50 探頭，測(cè)試前速度 5 mm/s，測(cè)定速度 1 mm/s，測(cè)試后速度 5 mm/s，測(cè)試距離 5 mm，探針探測(cè)力 5.0 g。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 酶 比由圖2 可知，酶解得率隨著蛋白酶型S 比例的增加而增加；當(dāng)酶比達(dá)到1 ∶3.5 之后，酶解得率的增幅趨近于平緩。分析其原因可能是隨著酶比的不斷增加，雖然酶解得率一直在持續(xù)增加，但由于參與酶解反應(yīng)的底物量是一定的，當(dāng)?shù)孜铮簇i骨泥中的蛋白質(zhì)）完全被分解為氨基酸和小分子肽后，酶解得率也不會(huì)再增加，因此即使再增加蛋白酶型S 的比例，酶解得率也不會(huì)有明顯增加。從節(jié)約資源和成本的角度綜合考慮，將風(fēng)味蛋白酶與蛋白酶型S 的比例設(shè)定為1 ∶2、1 ∶2.5、1 ∶3 這3 個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖2 酶比對(duì)豬骨湯酶解的影響

2.1.2 酶解時(shí)間由圖3 可知，酶解得率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但在酶解時(shí)間達(dá)到40 min 后，其酶解得率的增長(zhǎng)速度有所下降。這可能是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，酶與底物越來(lái)越少，所以反應(yīng)速度越來(lái)越慢，反應(yīng)產(chǎn)物的增加速度也隨之下降，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可能酶解得率仍會(huì)呈現(xiàn)緩慢上升的態(tài)勢(shì)，但酶解反應(yīng)速度較慢，從節(jié)省時(shí)間和節(jié)約能源的角度考慮，將酶解時(shí)間定為30～40 min 是比較合適的，故后續(xù)選取30、35、40 min 這3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)豬骨湯酶解的影響

2.1.3 pH值 由圖4 可知，酶解得率隨著pH 值的升高而呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)pH 值為8.0 時(shí)，酶解得率達(dá)到最大值。究其原因可能是隨著pH 值的增加，反應(yīng)液堿性越來(lái)越強(qiáng)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)開(kāi)始發(fā)生變化甚至變性，導(dǎo)致酶活性下降，因此后續(xù)將pH 值設(shè)定為8.0、9.0、10.0 這3 個(gè)水平來(lái)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 pH 值對(duì)豬骨湯酶解的影響

2.1.4 正交試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了酶解時(shí)間、酶比和pH 值的適宜范圍，由此獲得正交試驗(yàn)的因素和水平如表2 所示，根據(jù)L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得結(jié)果如表3 所示。由表3 可知，各因素對(duì)豬骨泥酶解得率的影響由大到小排列依次為A（酶比）＞C（pH值）＞B（酶解時(shí)間），且最優(yōu)水平為A2B1C1，即最佳酶解條件為酶比1 ∶2.5、酶解時(shí)間30 min、pH 值8.0。由于該組合未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9 個(gè)試驗(yàn)中，故按照酶比1 ∶2.5、酶解時(shí)間30 min、pH 值8.0 的條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得酶解得率的平均值為86.75 %，稍低于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中A2B3C1（編號(hào)6）組合的酶解得率（86.79%）。由表4 的方差分析結(jié)果可知，酶比和pH 值對(duì)豬骨泥酶解得率的影響顯著，而酶解時(shí)間對(duì)豬骨泥酶解得率的影響不顯著。因此，結(jié)合正交試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果，并考慮到酶與底物充分發(fā)生反應(yīng)，最終確定A2B3C1組合為豬骨泥酶解的最優(yōu)條件，即酶比1 ∶2.5、酶解時(shí)間40 min、pH 值8.0。

表2 酶解條件正交試驗(yàn)的因素及水平

表3 酶解條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 酶解條件正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.2 美拉德反應(yīng)配方優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 葡萄糖添加量由圖5 可知，葡萄糖的用量顯著影響美拉德反應(yīng)液的感官品質(zhì)，當(dāng)葡萄糖添加量在5%～6%范圍內(nèi)時(shí)，隨著葡萄糖添加量的不斷增加，美拉德反應(yīng)液的感官分?jǐn)?shù)也隨之提高；但當(dāng)葡萄糖添加量在6%～7%范圍內(nèi)時(shí)，隨著葡萄糖添加量的增加，感官分?jǐn)?shù)開(kāi)始下降，產(chǎn)物風(fēng)味逐漸下降，還會(huì)出現(xiàn)濃濃的焦糊味。這可能是因?yàn)楫?dāng)葡萄糖達(dá)到一定添加量后，反應(yīng)體系中的游離氨基酸顯著減少，加劇褐變反應(yīng)，多余的葡萄糖加熱過(guò)度而產(chǎn)生焦糖味，顏色和味道都逐漸加深，最終導(dǎo)致肉香味變淡甚至被掩蓋。因此，后續(xù)正交試驗(yàn)中葡萄糖添加量水平設(shè)定為6%、6.5%、7%。

圖5 葡萄糖不同添加量下美拉德反應(yīng)液的感官品質(zhì)

2.2.2 木糖添加量從圖6 可以看出，美拉德反應(yīng)溶液的感官評(píng)價(jià)得分隨木糖添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)；而且當(dāng)木糖添加量為2%，豬肉香味明顯，醇厚感最佳，無(wú)焦糊味，色澤光亮，感官分?jǐn)?shù)最高。這可能是因?yàn)槟咎菚?huì)加速美拉德反應(yīng)的進(jìn)程，從而產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)。但當(dāng)木糖增加到一定程度后，會(huì)發(fā)生過(guò)度焦糖化反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物整體品質(zhì)降低，從而感官分?jǐn)?shù)也會(huì)隨之下降。但是鑒于木糖增加量大于2%時(shí)美拉德反應(yīng)溶液的感官品質(zhì)變化不大，同時(shí)考慮到木糖價(jià)格高的因素，因此后續(xù)正交試驗(yàn)中木糖添加量設(shè)定為1.5%、2%、2.5%。

圖6 木糖不同添加量下美拉德反應(yīng)液的感官品質(zhì)

2.2.3 L-半胱氨酸添加量由圖7 可知，當(dāng)L-半胱氨酸添加量為0.35%時(shí)，產(chǎn)品整體感官品質(zhì)最佳，豬肉香味濃厚、飽滿。半胱氨酸在高溫過(guò)程中會(huì)與還原糖結(jié)合會(huì)發(fā)生Strecker 降解反應(yīng)，產(chǎn)生大量的肉味特征香氣物質(zhì)，提高產(chǎn)物整體風(fēng)味。當(dāng)L-半胱氨酸的添加量低于0.3%時(shí)，含硫氨基酸較少，豬肉香味淡，風(fēng)味不足。當(dāng)L-半胱氨酸添加量超過(guò)0.3%時(shí)，產(chǎn)物風(fēng)味變化不太顯著。因此，后續(xù)正交試驗(yàn)L-半胱氨酸的添加量設(shè)定為0.3%、0.35%、0.4%。

圖 7 L-半胱氨酸不同添加量下美拉德反應(yīng)液的感官品質(zhì)

2.2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了葡萄糖、木糖、L-半胱氨酸添加量的適宜范圍，由此獲得正交試驗(yàn)的因素和水平如表5 所示，根據(jù)L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得結(jié)果如表6 所示。由表6 可知，3 個(gè)因素對(duì)美拉德反應(yīng)液感官品質(zhì)的影響有大到小排列依次為A（葡萄糖添加量）＞B（木糖添加量）＞C（L-半胱氨酸添加量），且最優(yōu)組合為A1B2C2（編號(hào)2 的試驗(yàn)組），即葡萄糖添加量為6.0%，木糖添加量為2.0%，L-半胱氨酸添加量為0.35%，此時(shí)豬骨酶解液經(jīng)美拉德反應(yīng)后的反應(yīng)液感官評(píng)分為89.2 分，產(chǎn)品豬肉味濃郁，色澤光亮，滋味飽滿細(xì)膩。

表5 美拉德反應(yīng)配方正交試驗(yàn)的因素及水平

表6 美拉德反應(yīng)配方正交試驗(yàn)的結(jié)果

由表7 可知，因素A（葡萄糖添加量）、B（木糖添加量）和C（L-半胱氨酸添加量）的顯著水平均小于0.05，說(shuō)明A、B、C 這3 個(gè)因素對(duì)美拉德反應(yīng)液的整體感官品質(zhì)的影響均達(dá)到了顯著水平。

表7 美拉德反應(yīng)配方的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.3 市售豬骨高湯膏與試驗(yàn)所得風(fēng)味豬骨膏的質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果

從表8 可以看出，風(fēng)味豬骨膏的硬度、粘性系數(shù)和內(nèi)聚性這3個(gè)指標(biāo)的數(shù)值均大于市售的豬骨高湯膏，這可能是因?yàn)樵囼?yàn)制得的風(fēng)味豬骨膏原料中含有的骨膠原比市售豬骨高湯膏的含量多，所以給體系帶來(lái)了一些粘性，同時(shí)酶解后可溶性物質(zhì)等含量相較于市售的豬骨高湯膏有所增加，使之具有更穩(wěn)定的硬度和更好的膏體狀態(tài)。

表8 市售豬骨高湯膏與風(fēng)味豬骨膏的質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果

3 結(jié) 論

以豬骨泥為原料，經(jīng)過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定了豬骨酶解最佳條件和美拉德反應(yīng)最優(yōu)配方，結(jié)果表明：在風(fēng)味蛋白酶與蛋白酶型S 比例為1 ∶2.5、酶解時(shí)間40 min、pH 值8.0 的條件下，酶解得率最高為86.79%；豬骨酶解液美拉德反應(yīng)的最佳工藝為葡萄糖添加量為6.0%，木糖添加量為2.0%，L-半胱氨酸添加量為0.35%，在100℃的條件下反應(yīng)1 h；調(diào)味后經(jīng)蒸發(fā)濃縮等工藝得到風(fēng)味豬骨膏成品，用適量水稀釋即可馬上飲用，該產(chǎn)品具備骨湯特有風(fēng)味，香氣濃郁，滋氣味鮮美，并富含氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，食用快速方便，可以滿足現(xiàn)代消費(fèi)者快節(jié)奏生活的需要。同時(shí)，經(jīng)過(guò)質(zhì)構(gòu)比較，所研制風(fēng)味豬骨膏的硬度、粘性系數(shù)和內(nèi)聚性這3 個(gè)指標(biāo)數(shù)值均大于市售的豬骨高湯膏。