王立芹，曹振玉，何長流，王小青，李路文，楊美玲

（1.臨沂市森林濕地保護中心，山東 臨沂 276001；2.臨沂科技職業(yè)學院，山東 臨沂 276025）

銀杏（Ginkgo biloba）為銀杏科銀杏屬落葉喬木，幾億年前就已出現(xiàn)在地球上，是第四紀冰川運動后遺留下來的裸子植物中最古老的孑遺植物，和它同綱的其他植物幾乎都已滅絕，因此銀杏又有“活化石”的美稱。它具有一系列迷人的特征，包括大基因組、對非生物和生物脅迫的出色抗性以及雌雄異株繁殖等，使其成為生物學研究的理想模型物種[1]。

鋅指蛋白是一類具有手指狀結構域的轉錄因子[2]，對基因調(diào)控起重要的作用，并在促進植物發(fā)育、增強植物抗逆性等方面發(fā)揮重要功能[3]。根據(jù)成員結構和功能特征可將鋅指轉錄因子進一步分為幾個亞家族。近年來，BBX 蛋白因其多種功能而備受關注[4]。植物中的BBX 蛋白在N 端由1 個或2 個保守的B-box結構域組成，有時在C 端有一個 CCT（CONSTANS、CO 樣和 TOC1）結構域。其中，B-box 基序在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和轉錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而CCT 結構域參與核轉運和轉錄調(diào)控[5-7]。在擬南芥中，已鑒定出 32 種BBX 蛋白，根據(jù)B-box 結構域和CCT結構域的差異可將這32 種BBX 蛋白分為5 個亞組[6]。

隨著研究的深入，有越來越多的證據(jù)表明，植物 BBX 蛋白在開花誘導、光形態(tài)發(fā)生、避蔭反應、類胡蘿卜素生物合成和生物和非生物應激反應等多種生理和生化過程中發(fā)揮著關鍵作用[8]。CONSTANS（CO）/AtBBX1是擬南芥中研究的首個BBX基因，是通過觸發(fā)開花基因座T（FT）基因的表達來控制開花時間的中心協(xié)調(diào)因子[9]；研究還發(fā)現(xiàn)BBX4、BBX7和BBX32 基因也可調(diào)節(jié)開花時間。另外，已有數(shù)十個BBX基因被確定為早期光形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)因子[7]；BBX4、BBX21、BBX22和BBX23被證實可正調(diào)控植物光形態(tài)發(fā)生，而BBX19、BBX20、BBX24等可對擬南芥光形態(tài)發(fā)生進行負調(diào)控[10]。一些BBX基因也通過介導細胞伸長顯示出它們在避蔭反應中的功能[11]。BBX 蛋白還參與非生物應激反應和激素信號網(wǎng)絡。例如，BBX18 和BBX23 是熱形態(tài)發(fā)生的正向調(diào)節(jié)因子，它們的缺陷突變將導致熱響應性下胚軸伸長受限[12]。BBX24 在擬南芥中最初是作為一種耐鹽蛋白（STO）被分離出來的，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白增加了酵母細胞的耐鹽活性，當其在擬南芥中過表達時，可明顯促進高鹽度條件下根的生長[13]。BBX基因在植物激素信號轉導中的功能也有報道。AtBBX18（AtDBB1a）是赤霉素（GA）信號通路中的正調(diào)節(jié)劑[12]。有趣的是，BBX蛋白在果實發(fā)育過程中也發(fā)揮了重要作用。MdBBX22（MdCOL11）參與MdHY5介導的信號轉導并調(diào)節(jié)蘋果皮中花青素的積累[14]，SlBBX20 蛋白通過直接激活PHYTOENE SYNTHASE 1 的表達促進了番茄葉綠體的發(fā)育和類胡蘿卜素的積累[8]。

目前，擬南芥、番茄、梨和蘋果中關于BBX 家族的研究報道較多，但有關銀杏中BBX基因的相關研究尚未見報道。2021 年，Liu 等[1]公布了銀杏基因組序列。這為BBX基因在銀杏中的功能研究提供了條件。該研究根據(jù)基于隱馬爾可夫模型（HMM）的圖譜（B-box 型鋅指結構域，PF00643），使用SMART和Pfam 數(shù)據(jù)庫篩選和驗證了銀杏全基因組注釋蛋白質(zhì)，從中鑒定出12 個GbBBX基因，并對GbBBX 蛋白成員的保守結構域、基因結構、系統(tǒng)發(fā)育關系和組織表達譜進行了分析，以期為銀杏中BBX基因的進一步功能表征提供依據(jù)，同時也為進一步揭示銀杏生長發(fā)育機理提供了堅實的分子基礎。

1 材料與方法

1.1 銀杏GbBBX 轉錄因子的鑒定

為了識別BBX 轉錄因子家族，從Pfam 數(shù)據(jù)庫下載了B-box 型鋅指結構域（PF00643）的隱馬爾可夫模型（HMM）譜。銀杏的參考基因組在GigaDB數(shù)據(jù)庫中下載[15]。使用截止E 值≤0.01 的HMMER SEARCH3.0 和SMART 數(shù)據(jù)庫確認BBX 家族成員之間的保守域。使用ExPaSy 在線工具計算理論pI 和Mw 值。采用SWISS-MODEL 在線工具進行蛋白質(zhì)建模，采用softberry 在線軟件預測基因的推定亞細胞定位（http://www.softberry.com）。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

GbBBX基因的蛋白序列來自銀杏參考基因組（http://gigadb.org/dataset/100613），SlBBX基因的序列來自番茄參考基因組SL4.0（https://solgenomics.net/organ ism/Solanum_lycopersicum/genome），而AtBBXs的蛋白序列來自擬南芥參考基因組 （https://www.arabidopsis.org/）。采 用MEGA-X 程 序 構 建GbBBX、SlBBX 和AtBBX 蛋白的無根鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹，引導測試重復1 000 次。

1.3 保守基序、基因結構和啟動子區(qū)域順式作用元件分析

使用MEME 在線工具估計保守域，并使用DNAMAN進行比對。采用Gene Structure Display Server預測GbBBX的基因結構。選擇GbBBX基因CDS區(qū)2 000 bp 的上游序列作為啟動子區(qū)域，并使用PlantGBRE 網(wǎng)絡工具預測每個基因中的順式元件。采用Tbtools 繪圖[15]。

1.4 表達模式分析

轉錄組原始數(shù)據(jù)是從 GigaDB 數(shù)據(jù)庫中下載，每百萬外顯子模型的每千堿基片段數(shù)（FPKM）值代表相應的基因表達量[16]。表達量熱圖通過R 語言pheatmap 包完成。為了深入了解GbBBX基因家族在銀杏植物整個發(fā)育階段的潛在功能，從銀杏基因組在線數(shù)據(jù)庫選擇了來自浙江省天目山的銀杏胚（雌樹）、雄蕊（雄樹）和幼苗（莖和葉混合樣）3 個部位的表達量數(shù)據(jù)，并篩選GBBBX家族基因用于表達譜分析。

2 結果與分析

2.1 銀杏BBX 轉錄因子篩選及理化性質(zhì)分析

根據(jù)基于隱馬爾可夫模型（HMM）的圖譜（B-box型鋅指結構域，PF00643），使用SMART 和Pfam 數(shù)據(jù)庫篩選和驗證了全基因組注釋蛋白質(zhì)。在銀杏基因組中共鑒定出12 個GbBBX基因?；谒鼈兊娜旧w位置區(qū)域排序，12 個GbBBX基因在基因亞家族中被命名為GbBBX1至GbBBX12。根據(jù)注釋的基因組中GbBBX基因家族的物理位置信息，發(fā)現(xiàn)12 個GbBBX基因廣泛分布在第2、3、9 號染色體以外的其他染色體中；其中，GbBBX1和GbBBX2基因位于1 號染色體上，GbBBX4、GbBBX5、GbBBX6基因位于5 號染色體，其它成員分別位于不同的染色體上（表1）。GbBBX 蛋白的分子量（Mw）在 29.595 59 kDa （GbBBX4編碼） 和 81.740 51 kDa （GbBBX10編碼） 之間變化。GbBBX 的理論等電點（PI）介于5.05（GbBBX4編碼）和8.07（GbBBX10編碼）之間，且大部分為弱酸性蛋白。亞細胞定位預測結果表明，GbBBX2、GbBBX4、GbBBX7、GbBBX8、GbBBX9和GbBBX12編 碼 的 蛋白質(zhì)主要定位于細胞核中，而GbBBX1、GbBBX3、GbBBX5、GbBBX6、GbBBX10和GbBBX11編 碼 的 蛋白質(zhì)定位于細胞核外結構，如葉綠體和線粒體等部位。

表1 GbBBX 基因家族信息

2.2 GbBBX 蛋白家族的保守結構域

如圖1 所示，銀杏中B-box 鋅指結構域的保守序列主要以2 種形式存在，分別為B-box1（C-X2-CX7-8-C-X2-D-X-A-X-L-C-X2-C-D-X3-H-X2-N-X4-H，以藍色表示）和B-box2[C-X2-C-X8-C-X7-C-X2-CX4-H（N）-X6-8-H 的，以綠色表示]。蛋白質(zhì)序列比對結果顯示，2 個B-box 結構域具有高度相似的保守序列。例如，構成鋅指的半胱氨酸（C）和天冬氨酸（D）殘基在B-box 結構域中高度保守。然而，通過對GbBBX 家族成員保守結構域的分析可知，由于B-box1 結構域中的保守氨基酸殘基（Asn、Leu、His和 Arg）保守基序符號被反轉，因此B-box1 結構域基序比B-box2 結構域的基序更加保守。此外，BBX家族還具有高度保守的CCT 結構域（R-X5-R-Y-X2-KX3-R-X3-K-X2-R-Y-X2-R-K-X2-A-X2-R -X-R-X2-G-RF-X-K，圖1 中以紅色表示）。12 個GbBBX 蛋白中，GbBBX3、GbBBX4、GbBBX7、GbBBX8這4 個基因編碼的蛋白質(zhì)僅含有一個B-box2 結構域，而其余8 個基因編碼的蛋白質(zhì)包含了完整的2 個B-box 結構域和1 個CCT 保守結構域。

圖1 GbBBX 蛋白家族的結構域

2.3 銀杏BBX 轉錄因子基因結構分析

由圖2 可知，GbBBX基因家族的外顯子數(shù)量在1～5 個之間。其中，GbBBX5、GbBBX6、GbBBX9和GbBBX10這4 個基因有5 個外顯子，即銀杏BBX基因家族中33.3%的基因有5 個外顯子；GbBBX1、GbBBX4、GbBBX7、GbBBX8和GbBBX11這5 個基因有3 個外顯子，占比41.7%；GbBBX2和GbBBX12這2 個基因有2 個外顯子，占比16.7%；GbBBX3基因只有1 個外顯子，占比8.3%。此外，GbBBX基因家族各成員基因長度具有明顯的差異，其中最長的基因為GbBBX9，而最短的基因為GbBBX4。

圖2 GbBBXs 的基因結構分析

2.4 不同物種BBX 轉錄因子的系統(tǒng)進化分析

在進化分類中，GbBBX5、GbBBX6、GbBBX9和 GbBBX10 蛋白被發(fā)現(xiàn)是同源的，它們都包含2 個保守的B-box 結構域和1 個CCT 保守結構域；而GbBBX1、GbBBX11、GbBBX2、 和GbBBX12 蛋 白同源性較高，同樣包含2 個保守的B-box 結構域和1個CCT 保守結構域；GbBBX4 和GbBBX8 蛋白同源性較高，他們只有單一的1 個B-box 結構域；特殊的是，GbBBX3 和GbBBX7 與其他GBBBX 成員的同源性較低，他們也只有單一的1 個B-box 結構域。

為了研究GbBBX基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關系，基于銀杏中的GbBBX 蛋白序列、擬南芥中的AtBBX 蛋白序列和番茄中的SlBBX 蛋白序列構建了鄰接（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3 所示，所有BBX 蛋白被分為5個進化枝，其中每個進化枝均包含了來自3 個物種的BBX 蛋白，且各物種在各分支的蛋白數(shù)量相似；各進化枝都對應于它們指定的結構域，而一些具有相似結構域的 GbBBX 蛋白被聚集成不同的進化枝，例如GbBBX3 和GbBBX7 被分別聚集在進化枝II 和進化枝III 中；大部分的GbBBX 蛋白被聚集在進化枝I 中，而擬南芥和番茄的BBX 蛋白聚集在其他4 個進化枝中，說明在整個物種進化當中，銀杏的同源性與模式植物擬南芥和果實模式植物番茄同源關系較遠。但特別的是，番茄的SlBBX26 被聚集在進化枝I 當中，說明雖然物種間同源關系較遠，但是BBX 蛋白仍存在非常保守的結構域，由此推測，GbBBX 可能在銀杏的生長發(fā)育過程中扮演著番茄SlBBX26 類似的功能。

圖3 銀杏、番茄和擬南芥中BBX 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.5 銀杏BBX 轉錄因子啟動子區(qū)域順式作用元件分析

選擇編碼區(qū)上游的 2 000 個堿基對（bp）作為GbBBX中的啟動子序列，以預測順式調(diào)控元件。在GbBBX基因家族的啟動子區(qū)域中總共鑒定出32 類順式元件類型（圖4）。少數(shù)GbBBX基因具有與細胞發(fā)育相關的順式元件，例如參與胚乳表達的順式調(diào)節(jié)元GbBBX1 GbBBX11 GbBBX9 GbBBX7 GbBBX5 GbBBX6 GbBBX2 GbBBX8 GbBBX3 GbBBX4 GbBBX12 GbBBX10件、柵欄葉肉細胞分化的元素、與分生組織表達相關的順式調(diào)節(jié)元件、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)的順式調(diào)節(jié)元件等。此外，許多GbBBX基因含有與應激反應途徑相關的順式元件，包括對光的反應、厭氧誘導、防御、缺氧特異性誘導有關的增強子、低溫反應、干旱誘導、晝夜節(jié)律控制、防御和應激反應等。另外，GbBBX基因啟動子區(qū)域中還存在部分典型的激素相關順式調(diào)節(jié)元件，包括脫落酸反應元件、水楊酸和赤霉素以及生長素反應的元件。特別的是，在GbBBX家族基因啟動子區(qū)域中，參與光反應的順式作用元件最多，包括ACE、AE-box、Box 4、chs-CMA1a、GATA-motif、G-Box、GT1-motif、I-box、MRE、Sp1、TCT-motif（表2）。

圖4 預測 GbBBX 基因家族的順式作用元件

表2 銀杏GbBBX 基因家族啟動子保守順式作用元件

2.6 銀杏BBX 轉錄因子表達模式分析

如圖 5 所示，大多數(shù)GbBBX基因在不同部位中表現(xiàn)出表達差異性，可將12 個GbBBX的表達模式分為3 組。其中，GbBBX2、GbBBX3和GbBBX8這3 個基因在胚中的表達量相對較高；而GbBBX5、GbBBX6、GbBBX9、GbBBX11和GbBBX12這5 個 基因在幼苗中的表達量較高，在其他組織類型中不表達或低表達；GbBBX1、GbBBX4、GbBBX7和GbBBX10這4 個基因在銀杏雄蕊和幼苗中均有高量的表達。這些結果表明，GbBBX基因在銀杏植株的生長發(fā)育過程中具有多種功能。

圖5 銀杏不同部位的GbBBX 基因的表達模式

3 討 論

B-box（BBX）轉錄因子是鋅指蛋白家族的一個亞家族，具有多種生物學功能，近年來引起了學者的廣泛關注[7]。隨著二代測序技術的不斷完善，大多數(shù)物種的參考基因組測序完成，越來越多的BBX 轉錄因子家族被鑒定出來。例如，擬南芥中包含32 個BBX 成員[6]、番茄中包含29 個BBX 成員[17]、辣椒中包含23 個BBX 成員[18]。該研究結果顯示，銀杏中鑒定出12 個GbBBX 蛋白。GbBBX基因在銀杏的12條染色體上分布不均勻，并且相對于擬南芥和番茄來說成員數(shù)量較少。推測這可能是因為進化過程中物種特異性的重復或缺失導致了不同物種間BBX 轉錄因子家族數(shù)量存在差異。

在銀杏中，根據(jù)結構域的數(shù)量和類型將12 個成員分為2 類，包括4 個具有單一B-box 結構域的基因和8 個具有2 個B-box 結構域和1 個CCT 結構域的基因。B-box 保守基序在蛋白質(zhì)相互作用和轉錄調(diào)控中起關鍵作用，而CCT 結構域主要參與核轉運和轉錄調(diào)控[19]。此外，外顯子-內(nèi)含子結構也影響基因的功能。GbBBX家族的外顯子數(shù)量從 1 個到 5 個不等，整個家族中僅有1 個基因沒有內(nèi)含子。通過聚類分析構建的系統(tǒng)發(fā)育樹將銀杏、番茄和擬南芥的BBX 蛋白分為5 個進化枝。由于高度保守的外顯子-內(nèi)含子特征，相同進化枝中的BBX 蛋白可能具有相似的功能。功能多樣性的另一個原因是啟動子區(qū)域中不同的順式調(diào)節(jié)元件[20]。啟動子區(qū)域的大量順式元件與光反應有關，包括Box4、G-Box、GT1-motif 等。許多BBX 蛋白在光信號通路中發(fā)揮關鍵作用，例如，AtBBX20 是光信號轉導的正調(diào)節(jié)因子[21]。此外，GbBBX基因啟動子區(qū)域中還存在與激素相關的順式調(diào)節(jié)元件，如ABRE參與對脫落酸的反應，TCA-element 參與水楊酸反應，CGTCA-motif 和TGACG-motif 是參與茉莉酸甲酯反應所必需的順式作用元件。啟動子區(qū)域中多樣化的結構域、結構和順式調(diào)節(jié)元件可能導致GbBBX轉錄因子家族的多種功能。

多項研究表明，BBX基因廣泛參與植物的生長發(fā)育過程。例如，擬南芥中的B-box 蛋白STH2 是光形態(tài)發(fā)生的正調(diào)節(jié)因子，在轉錄激活中起直接作用[21]。沉默PpBBX16可減少梨（Pyrus pyrifolia）中花青素的積累[22]。擬南芥中含有B-box 結構域的AtBBX19轉錄調(diào)節(jié)因子參與了光形態(tài)發(fā)生[10]。COP1 介導的AtBBX22基因降解促進了擬南芥幼苗的發(fā)育[23]。擬南芥的AtBBX21基因可以與COP1 相互作用來調(diào)節(jié)植株的避蔭反應，并促進長下胚軸的形成[4]。然而，迄今為止，BBX 家族基因在銀杏中的具體作用仍不清楚。該研究以來自浙江省天目山的銀杏胚（雌樹）、雄蕊（雄樹）和幼苗（莖和葉混合樣）的轉錄組數(shù)據(jù)進行GbBBX基因表達量的分析。所有12 個GbBBX基因都參與了銀杏生長發(fā)育過程的調(diào)控，并且在各組織中組成型表達。這說明GbBBX基因可能在銀杏雄樹雌樹的生長發(fā)育過程、新陳代謝和響應外界脅迫等方面扮演重要的角色。但是具體的調(diào)控機制和功能需要進一步的分子生物學試驗來驗證。該研究為篩選參與銀杏生長發(fā)育的轉錄因子提供了有力的參考，為進一步表征GbBBX的功能奠定了堅實的基礎。