蘇卓文，盧彩鴿，蔡淑琳，張濤濤，董 丹，趙 娟，張殿朋

（北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京 100097）

蘆筍莖枯病是由有絲分裂孢子真菌天門冬擬莖點霉菌（Phomopsis asparagi）引起的莖部病變，是蘆筍生產(chǎn)上的毀滅性病害，其發(fā)生程度呈逐年加重的趨勢[1]。目前，我國傳統(tǒng)病蟲害防治手段以物理防治和農(nóng)業(yè)防治為主，化學(xué)防治為輔，傳統(tǒng)防治技術(shù)雖然能夠在一定程度上對病蟲害進行防治，但病蟲害抗藥性以及農(nóng)藥殘留等問題不僅影響防治效果，也與綠色可持續(xù)發(fā)展理念相悖。近年來，綠色防治技術(shù)逐漸受到人們的重視[2]。生物防治是綠色防治技術(shù)的重要內(nèi)容，具有經(jīng)濟、安全、不產(chǎn)生抗藥性等特點，在病蟲害防治領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

近年來，利用內(nèi)生生防細(xì)菌防治植物病害的生物防治手段備受關(guān)注。CUI 等[3]從馬鈴薯塊莖中分離出拮抗馬鈴薯瘡痂病的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌；HAMAOKA 等[4]發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌KOF112 是一株具有廣譜真菌拮抗作用的內(nèi)生菌株，能夠很好地定殖于葡萄植株，有助于葡萄栽培中的害蟲管理；SREBOT 等[5]測定了固氮葡糖醋桿菌在番茄植株上的定殖能力及其對植物病原菌青枯菌的生防效果。大量研究表明，利用植物內(nèi)生細(xì)菌對植物病蟲害進行生物防治，能夠更有效地解決拮抗菌在宿主植物中的生長和繁殖問題，從而為促進植物健康生長提供更加有利的條件。目前，對于蘆筍莖枯病的防治技術(shù)大多還停留在傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治方式上，如柴文臣等[6]研究了5種農(nóng)藥對蘆筍莖枯病的防治效果；倪蘭庭[7]從傳統(tǒng)防治技術(shù)的3個方面總結(jié)了蘆筍莖枯病的防治要點，如清除病株、加強管理、地表覆蓋和藥劑治療等；瞿華香等[8]闡述了蘆筍莖枯病的防控現(xiàn)狀，主要包括蘆筍的栽培技術(shù)、農(nóng)藥防治和防控技術(shù)，并強調(diào)了蘆筍抗病育種的重要性。有關(guān)蘆筍病害的生物防治研究較少，鑒于此，針對分離自北京密云區(qū)野生蘆筍根部的52 株內(nèi)生細(xì)菌，采用體外平板對峙試驗和溫室防效測定試驗，篩選對蘆筍莖枯病具有生防效果的優(yōu)良菌株，并確定菌株的分類學(xué)地位，初步探索其抑菌活性，為蘆筍莖枯病的生物防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試52 株內(nèi)生細(xì)菌均分離自北京市密云區(qū)的野生蘆筍根部；供試病原菌天門冬擬莖點霉菌（P.asparagi）分離自北京市農(nóng)林科學(xué)院蘆筍種植基地的感病蘆筍。上述菌株均由北京市農(nóng)林科學(xué)院生防微生物研究室分離、純化和保藏。

1.2 供試培養(yǎng)基

內(nèi)生細(xì)菌活化培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基[9]；平板對峙培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基[10]；生防相關(guān)性狀測定培養(yǎng)基：CAS 培養(yǎng)基[11]（檢測嗜鐵素）、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基[12]（檢測幾丁質(zhì)酶）、脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基[13]（檢測蛋白酶）、剛果紅培養(yǎng)基[14]（檢測纖維素酶）和Pikovskaya’s 瓊脂培養(yǎng)基[15]（檢測磷酸酯酶）。

1.3 試驗方法

1.3.1 拮抗菌的初篩 采用平板對峙法進行篩選。將蘆筍莖枯病菌接種于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，自菌落邊緣用無菌打孔器取直徑5 mm 的菌餅，菌絲面朝下置于平板中央，在距離蘆筍莖枯病菌菌餅4 cm 處用接種環(huán)取供試內(nèi)生細(xì)菌劃線，以僅接種蘆筍莖枯病菌的平板作為空白對照（CK），每組試驗3次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察和記錄病原菌直徑，7 d后計算抑菌率[16]。

1.3.2 初篩拮抗菌的溫室防效測定 以體外篩選的拮抗菌作為溫室防效測定的出發(fā)菌株。供試蘆筍品種為京綠蘆1 號（購自北京鳳鳴雅士公司），選取株高、莖粗和生長階段相同的健康蘆筍，采用共同接種法，接種P.asparagi孢子懸液（105個/mL）后，同一時間段內(nèi)用拮抗菌株發(fā)酵液（107cfu/mL）噴施，設(shè)陽性對照（僅接種P.asparagi，不噴施拮抗菌株發(fā)酵液）及空白對照（CK，不接種P.asparagi，不噴施拮抗菌株發(fā)酵液），每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)20 株健康蘆筍。記錄10 d 后蘆筍莖枯病的發(fā)病情況并進行拮抗菌液的第2 次噴施，之后每隔10 d 統(tǒng)計1 次發(fā)病情況，計算病情指數(shù)及相對防治效果，30 d 后結(jié)束病情統(tǒng)計。

蘆筍莖枯病分級標(biāo)準(zhǔn)[17]：

0級：蘆筍整株沒有病斑；

1 級：蘆筍主莖病斑繞莖長度占主莖周長25%以下，或側(cè)枝發(fā)病率25%以下；

2 級：蘆筍主莖病斑繞莖長度占主莖周長25%～50%，或側(cè)枝發(fā)病率25%～50%；

3 級：蘆筍主莖病斑繞莖長度占主莖周長50%～75%，或側(cè)枝發(fā)病率50%～75%；

4 級：蘆筍主莖病斑繞莖長度占主莖周長75%以上，或側(cè)枝發(fā)病率75%以上。

防效計算方法：

病株率=（病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%，

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×該級嚴(yán)重度）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）×100，

防治效果=（病原菌孢子液處理組病情指數(shù)-拮抗細(xì)菌與病原菌共同處理組病情指數(shù)）/病原菌孢子液處理組病情指數(shù)×100%。

1.3.3 拮抗菌株生防相關(guān)性狀檢測 將靶標(biāo)拮抗菌在28 ℃下培養(yǎng)24 h，然后分別接種于1.2 中制備的生防相關(guān)性狀測定培養(yǎng)基平板上，每處理3 個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)72 h，根據(jù)平板上菌落周圍透明圈直徑大小初步評估菌株的生防能力。

1.3.4 拮抗菌株鑒定 形態(tài)觀察：將最終篩選出的拮抗內(nèi)生細(xì)菌接種于LB 平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h 后在顯微鏡下觀察菌落形態(tài)、大小，并記錄菌落的色澤、透明度、致密度和邊緣等特征情況。

生理生化特性分析：參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[18]對拮抗菌株的生理生化指標(biāo)進行鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：參照TIANGEN 細(xì)菌基因組試劑盒說明書提取生防細(xì)菌的基因組DNA。以總DNA作為模板，用引物27F/1492R（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′/5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′）擴增16S rDNA 序列[19]，引物gyrB1/gyrB2（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′/5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCA-3′）擴 增gyrB基因[20]。PCR 擴 增 體 系：2×TaqMix 20 μL、基 因 組DNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 23 μL。PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火35 s（16S rDNA）或者60 ℃退火30 s（gyrB），72 ℃延伸1 min，擴增30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果（北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司）在NCBI 的BLAST 搜索比對，根據(jù)同源性鑒定種屬。使用MEGA 7.0 軟件，采用鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析（重復(fù)次數(shù)為1 000）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0 軟件，差異顯著性檢驗采用Duncan’s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍莖枯病菌拮抗菌株的體外篩選

采用平板對峙法對52 株蘆筍內(nèi)生細(xì)菌進行了體外拮抗試驗，共有7 株（占比13%）內(nèi)生細(xì)菌對蘆筍莖枯病菌具有拮抗活性。其中，抑菌率超過60%的有3 株，分別是YS-G10、YS-G3 和GLDJ5，其對應(yīng)抑菌率分別為85.00%、63.70%、75.89%；其余菌株抑菌率在32.33%～47.63%，YS-J1 抑菌率最低（表1）。菌株YS-G10 對蘆筍莖枯病菌的抑制效果最為明顯（圖1a），通過顯微鏡觀察病原菌菌絲發(fā)現(xiàn)，YS-G10能夠使病原菌菌絲卷曲、折疊，菌絲細(xì)胞出現(xiàn)泡囊化現(xiàn)象，而正常菌絲細(xì)長，光滑且均勻（圖1b）。

表1 7株拮抗菌株對蘆筍莖枯病菌拮抗活性的體外試驗結(jié)果Tab.1 Antagonistic activity of seven antagonistic strains against P.asparagi in vitro

圖1 菌株YS-G10對P.asparagi的拮抗活性Fig.1 Antifungal activity of strain YS-G10 against P.asparagi

2.2 拮抗菌株對蘆筍莖枯病的溫室防效

對體外對峙試驗篩選出的3株拮抗能力較強的菌株進行溫室防效測定，結(jié)果（表2）表明，第1 次拮抗菌噴施處理后10 d，各試驗處理組與對照組的病情指數(shù)之間出現(xiàn)差異，處理后30 d 陽性對照組染病植株整株枯萎死亡。統(tǒng)計顯示，處理后30 d 菌株YS-G10 和GLDJ5 發(fā)酵液對蘆筍莖枯病的防治效果在50%以上，分別為73.44%、62.50%；YS-G3 發(fā)酵液處理的防效較弱，僅為21.88%。綜合體外平板對峙結(jié)果和溫室防效結(jié)果，最終確定菌株YS-G10 為蘆筍莖枯病的最優(yōu)拮抗菌株，拮抗效果較為明顯（圖2）。

表2 3株初篩生防細(xì)菌對蘆筍莖枯病的溫室防效Tab.2 Greenhouse control effect of three strains of primarily screened biocontrol bacteria on stem blight of asparagus

圖2 菌株YS-G10溫室防效測定Fig.2 Control effect of strain YS-G10 in greenhouse

2.3 菌株YS-G10生防相關(guān)性狀檢測

將菌株YS-G10 在生防相關(guān)性狀檢測培養(yǎng)基上培養(yǎng)48～72 h 后，觀察其產(chǎn)酶特性。由圖3 可知，菌株YS-G10 在蛋白酶和纖維素酶檢測平板上能夠形成明顯的透明圈，在嗜鐵素、幾丁質(zhì)酶和磷酸酯酶檢測平板上沒有水解活性。推測菌株YS-G10 可能通過產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶等水解酶類物質(zhì)破壞病原真菌細(xì)胞壁或抑制病原菌致病毒素的產(chǎn)生，從而達到抑制蘆筍莖枯病的效果。

圖3 菌株YS-G10產(chǎn)蛋白酶（a）和纖維素酶（b）檢測結(jié)果Fig.3 Results of strain YS-G10 producing protease（a）and cellulase（b）

2.4 菌株YS-G10的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)特征 將所篩選的內(nèi)生細(xì)菌YS-G10接種于LB 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h 后進行菌株形態(tài)觀察。在LB 培養(yǎng)基上菌株YS-G10 的菌落呈奶白色，菌落中心偏黃，邊緣偏白，不透明，表面有褶皺，易挑起，隨培養(yǎng)時間增長，菌落變厚，邊緣不規(guī)則（圖4a）。革蘭氏染色結(jié)果為陽性菌，單個，短桿狀（圖4b）。

圖4 菌株YS-G10的菌落形態(tài)（a）及顯微鏡觀察結(jié)果（b）Fig.4 Results of YS-G10 colony morphology（a）and microscopic observation（b）

2.4.2 生理生化特性 菌株YS-G10 的生理生化特性檢測結(jié)果如表3。由表3可得出，該菌在pH 值7.5環(huán)境下能夠正常生長，在pH 值8.5 和pH 值9.5 環(huán)境下不能生長。該菌株能夠利用甘油、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、衛(wèi)茅醇、肌醇、甘露醇、α-甲基-D-甘露糖糖苷、α-甲基-D-葡萄糖糖苷、N-乙酰-葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉靈檸檬酸鐵、水楊苷、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-松三糖、D-棉子糖、淀粉、木糖醇、D-龍膽二糖、葡萄糖酸鉀、2 酮基-葡萄糖酸鉀。YS-G10 在20 ℃和40 ℃下生長良好，60 ℃下不能生長。

表3 菌株YS-G10的生理生化特性檢測結(jié)果Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of strain YS-G10

2.4.3 分子生物學(xué)鑒定 以菌株YS-G10 基因組DNA 為模板，對其16S rDNA 序列和gyrB基因片段進行PCR 擴增，分別獲得1 400 bp 左右的單一特異性片段。根據(jù)16S rDNA 序列構(gòu)建的進化樹結(jié)果（圖5）表明，菌株YS-G10 與4 株貝萊斯芽孢桿菌[Bacillus velezensisstrain NN95（MT114576.1）、Bacillus velezensisstrain NN05（MT114571.1）、Bacillus velezensisFC37（OU487633.1）、Bacillus velezensisstrain BCRC 17467（EF433407.1）]聚類在一個分支上。根據(jù)gyrB基因序列構(gòu)建的進化樹（圖6），菌株YS-G10 也與4 株貝萊斯芽孢桿菌[Bacillus velezensisstrain JT3-2（MT437378.1）、Bacillus velezensisstrain NN05（MT119758.1）、Bacillus velezensisstrain NN95（MT119763.1）、Bacillus velezensisstrain BCRC 17467（DQ903176.1）]單獨構(gòu)成一個分支，而同屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）的其他菌種則聚于其他幾個組中。綜合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗結(jié)果，初步鑒定菌株YS-G10 為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

圖5 菌株YS-G10的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain YS-G10

圖6 菌株YS-G10的gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of gyrB gene sequence of strain YS-G10

續(xù)表3 菌株YS-G10的生理生化特性檢測結(jié)果Tab.4（Continued） Physiological and biochemical characteristics of strain YS-G10

3 結(jié)論與討論

近年來，芽孢桿菌屬被認(rèn)為是最成功的生物防治劑，有些菌株可以在根組織中定殖而不產(chǎn)生有害影響，并通過拮抗、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性、爭奪根際生態(tài)位等不同機制抑制植物病原菌。其中，貝萊斯芽孢桿菌是一種具有廣譜抑菌能力的生防細(xì)菌，其對多種病原菌具有不同程度的抑制作用，具有拮抗多種病原菌的能力，如立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、鐮孢菌（Fusarium）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea） 、草 莓 炭 疽 病 菌（Colletotrichum gloeospoioides）、煙 草 黑 脛 病 菌（Phytophthora nicotianae）、鏈格孢菌（Alternaria alternate）、西瓜枯萎病菌（F.oxysporum）[21]等。且此類細(xì)菌具有許多不同的生防特性，如產(chǎn)植物激素和抗生素、產(chǎn)水解酶破壞真菌結(jié)構(gòu)、溶磷和固氮作用等[22]。

本研究成功篩選出1株內(nèi)生芽孢桿菌YS-G10，在體外平板對峙試驗中，YS-G10 對P.asparagi的抑菌率達到85.00%，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，YS-G10對病原菌真菌菌絲生長具有較強的抑制作用，使真菌菌絲產(chǎn)生明顯的形態(tài)扭曲；溫室防效測定結(jié)果表明，蘆筍莖枯病菌與107cfu/mL YS-G10發(fā)酵液共同接種，蘆筍莖枯病癥狀相比陽性對照和其他拮抗菌處理明顯減輕，防效達到73.44%。根據(jù)形態(tài)學(xué)檢測以及16S rDNA 和gyrB基因測序，初步鑒定YS-G10 為貝萊斯芽孢桿菌。

水解酶的產(chǎn)生是細(xì)菌作為潛在生物防治劑的一個重要特征，這些水解酶能夠通過降解真菌的細(xì)胞壁或抑制病原菌致病毒素的產(chǎn)生來抑制真菌的生長。DHOUIB 等[23]從番茄組織中分離出1 株能夠產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和β-葡聚糖酶的內(nèi)生芽孢桿菌C2，其能夠在體內(nèi)和體外有效抑制番茄黃萎病。病原真菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì)、葡聚糖、纖維素等物質(zhì)，因此，許多內(nèi)生細(xì)菌可通過產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶如幾丁質(zhì)酶、纖維素酶等來控制植物真菌病害。此外，有些真菌病原菌侵染植物是通過分泌真菌效應(yīng)蛋白來抑制植物防御反應(yīng)，調(diào)控植物生理機制使其能適應(yīng)真菌侵染，并為真菌提供營養(yǎng)物質(zhì)[24]。經(jīng)過驗證，YS-G10 能夠大量分泌蛋白酶和纖維素酶，因此，推測YS-G10 可能通過產(chǎn)生水解酶類物質(zhì)達到抑制病原菌的效果。

盡管YS-G10 是一株較為有效的生防芽孢桿菌，但要將該菌株實際應(yīng)用于蘆筍莖枯病的防治中，還需要進行生物制劑的研發(fā)和菌劑安全性評估等生產(chǎn)試驗，并深入研究該菌株抑菌活性成分及其作用機制，為蘆筍莖枯病的生物防治奠定基礎(chǔ)。