倪卓 莫少妮 謝非凡 黎智華

傳統(tǒng)的骨修復(fù)材料主要有自體骨、異體骨、脫鈣骨基質(zhì)、生物陶瓷和金屬材料。自體骨來源有限，異體骨和金屬材料等植入材料易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，使傷口愈合時間延長，嚴(yán)重時甚至不愈合。近年來，以天然高分子水凝膠制備生物支架成為研究熱點，其模擬人體細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境，負(fù)載種子細(xì)胞（軟骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞）和生長因子，轉(zhuǎn)移至骨組織環(huán)境中，誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖和分化，以促進(jìn)骨骼生長[1-2]。天然高分子水凝膠是線性高分子通過共價鍵、氫鍵、離子鍵、靜電作用或分子間纏繞形成的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的彈性半固體聚合物，能在水中溶脹而不溶解，具有高吸水性、高保水性和生物穩(wěn)定性。與合成高分子水凝膠比較，天然高分子水凝膠具有優(yōu)異的生物相容性、低細(xì)胞毒性和生物可降解性等多種優(yōu)點，適合應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域。其中明膠、殼聚糖和海藻酸鈉分子鏈中含有羥基和氨基等活性官能團(tuán)，具有良好的生物相容性，且可以對其進(jìn)行改性和功能化，在骨缺損修復(fù)和治療領(lǐng)域具有顯著優(yōu)勢。

骨缺損是由于外傷、腫瘤、感染或先天遺傳等因素造成骨骼損傷或缺失，針對不同類型的骨缺損，采用不同種類的修復(fù)材料治療不同類型骨缺損尤為重要。本文總結(jié)了明膠、殼聚糖和海藻酸鈉水凝膠復(fù)合材料的制備方法和凝膠反應(yīng)機(jī)理，比較了不同的凝膠反應(yīng)動力學(xué)研究方法，總結(jié)其在骨組織修復(fù)應(yīng)用中的研究進(jìn)展，為凝膠復(fù)合材料的分子設(shè)計和臨床應(yīng)用提供了思路。

1 凝膠材料制備方法及其凝膠機(jī)理

明膠（gelatin）是膠原蛋白的部分水解產(chǎn)物，由18 種不均勻分布的氨基酸組成，分子量為幾萬至十幾萬，R1 ～R5 為氨基酸殘基（見圖1）。明膠分子中含有羥基、羧基和氨基，是兩性聚合物。根據(jù)制備方法不同，明膠可以分為酸法（A型）明膠、堿法（B型）明膠和酶法明膠，A 型明膠的等電點為7.0 ～9.0，B 型明膠的等電點為4.7 ～5.2。在骨組織修復(fù)應(yīng)用中，明膠沒有膠原蛋白出現(xiàn)的蛋白排斥反應(yīng)，具有低抗原性和生物相容性，是模擬骨組織環(huán)境的理想材料。

圖1 明膠結(jié)構(gòu)

殼聚糖（chitosan）是甲殼素N-脫乙酰基的產(chǎn)物，殼聚糖的分子結(jié)構(gòu)與甲殼素相似，具有復(fù)雜的雙螺旋結(jié)構(gòu)（見圖2）。殼聚糖分子中含有豐富的氨基與羥基，在分子內(nèi)和分子間易形成氫鍵，在酸性介質(zhì)中溶解，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一表面帶正電荷的天然多糖聚合物，具有生物相容性、可降解性和抗菌性，在骨組織修復(fù)工程應(yīng)用中具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖2 殼聚糖結(jié)構(gòu)

海藻酸鈉（sodium alginate）來源于褐藻類植物，是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic，M）和α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronic，G）按（1→4）鍵連接組成的線性陰離子聚合物（見圖3）。在海藻酸鈉的分子結(jié)構(gòu)中，M單元和G 單元的立體構(gòu)象不同，以MM、MG、GG 三種配對方式隨機(jī)交替連接，這兩種糖醛酸在分子結(jié)構(gòu)中的比例和排列順序的變化會導(dǎo)致海藻酸鈉性質(zhì)（粘性、膠凝性和離子選擇性）的差異。

圖3 海藻酸鈉結(jié)構(gòu)

明膠和殼聚糖分子中含有氨基、羥基等活性官能團(tuán)，海藻酸鈉分子中含有羥基、羧基等活性官能團(tuán)，這些物質(zhì)來源于動植物，無害無毒，具有良好的生物相容性和可降解性，使用交聯(lián)劑設(shè)計結(jié)構(gòu)制備性能優(yōu)異的水凝膠材料在骨組織修復(fù)工程中具有顯著優(yōu)勢。明膠、殼聚糖和海藻酸鈉水凝膠復(fù)合材料制備方法主要有化學(xué)交聯(lián)法和物理交聯(lián)法?；瘜W(xué)交聯(lián)法是指線性聚合物在交聯(lián)劑、熱和光等條件作用下形成以共價鍵連接的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)聚合物，該過程具有不可逆性。物理交聯(lián)法主要是通過物理作用（氫鍵作用、靜電作用和范德華力）使線型聚合物形成體型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)聚合物，該過程具有熱可逆性。

1.1 化學(xué)交聯(lián)法

以化學(xué)交聯(lián)法制備明膠、殼聚糖和海藻酸鈉水凝膠復(fù)合材料所采用的交聯(lián)劑可分為共價交聯(lián)劑和離子交聯(lián)劑：共價交聯(lián)劑有戊二醛和生物類化合物（京尼平、茶多酚、阿魏酸和咖啡酸）等；離子交聯(lián)劑有氯化鈣、氯化鋅、氯化銅和三聚磷酸鈉等。

1.1.1 共價交聯(lián)

采用戊二醛與含氨基或羥基的明膠和殼聚糖反應(yīng)制備凝膠材料具有反應(yīng)速度快和交聯(lián)程度大的特點。研究發(fā)現(xiàn)，戊二醛與含氨基聚合物應(yīng)受pH和反應(yīng)物濃度的影響，在較高的pH介質(zhì)中，交聯(lián)反應(yīng)主要由席夫堿反應(yīng)控制；在較低的pH介質(zhì)中，戊二醛可能與明膠中羥基脯氨酸和羥基賴氨酸的羥基反應(yīng)，形成以半縮醛結(jié)構(gòu)為橋聯(lián)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)產(chǎn)物[3]。當(dāng)反應(yīng)物濃度較低時，產(chǎn)生分子內(nèi)交聯(lián)，醛基與氨基反應(yīng)形成不穩(wěn)定的席夫堿結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步反應(yīng)形成以2, 6-二羥基四氫吡喃聚醚為橋聯(lián)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)聚合物[4]（見圖4）。雖然戊二醛交聯(lián)能提高凝膠復(fù)合材料的力學(xué)性能，但研究發(fā)現(xiàn)戊二醛交聯(lián)劑對負(fù)載細(xì)胞有一定的毒性，采用濃度超過0.5%的戊二醛與明膠反應(yīng)制備復(fù)合支架時，嚴(yán)重影響支架負(fù)載的成骨細(xì)胞的生長和增殖[5]。

圖4 明膠與戊二醛反應(yīng)

因為醛類交聯(lián)劑具有細(xì)胞毒性，所以采用無毒無害的生物交聯(lián)劑與明膠、殼聚糖反應(yīng)制備骨缺損修復(fù)凝膠材料成為研究熱點，這些天然生物交聯(lián)劑結(jié)構(gòu)中含有羧基和羥基等官能團(tuán)，直接或經(jīng)氧化后與明膠和殼聚糖分子鏈中的活性基團(tuán)反應(yīng)實現(xiàn)交聯(lián)固化。京尼平是梔子苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物，其細(xì)胞毒性低和生物相容性好，與明膠或殼聚糖等含氨基聚合物發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)可以制備組織工程支架[6]。京尼平與含氨基天然高分子反應(yīng)具有pH 依賴性，在不同pH介質(zhì)中，京尼平與含氨基天然高分子交聯(lián)機(jī)理不同[7]。在酸性或中性環(huán)境中，形成由短鏈京尼平為交聯(lián)橋的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)聚合物。在堿性介質(zhì)中，形成以長鏈京尼平為交聯(lián)橋的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)聚合物。采用京尼平與殼聚糖反應(yīng)制備骨修復(fù)支架，負(fù)載人間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)京尼平濃度對細(xì)胞增殖沒有顯著影響，材料對細(xì)胞的毒性低，促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖[8]。

1.1.2 離子交聯(lián)

海藻酸鈉可以與多種二價或三價的金屬陽離子反應(yīng)形成水凝膠，如Ca2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+等。海藻酸鈉與二價金屬離子凝膠化形成“蛋盒模型”（Egg-model），分子中的兩個G 段與多個Ca2+離子發(fā)生螯合作用，Ca2+離子被海藻酸鈉分子夾在中間，由于鈣離子誘導(dǎo)鏈－鏈締合作用，形成類似蛋盒的結(jié)構(gòu)[9]（見圖5）。通過海藻酸鈉與金屬離子螯合反應(yīng)制備的水凝膠支架具有多孔結(jié)構(gòu)，是骨修復(fù)工程體外細(xì)胞培養(yǎng)的良好載體。目前，軟骨細(xì)胞單層培養(yǎng)去分化是骨組織工程應(yīng)用中的難題，采用海藻酸鹽可以保持軟骨細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，使去分化的軟骨細(xì)胞重新表達(dá)，對于軟骨組織的構(gòu)建具有重要意義[10]。

圖5 海藻酸鈉與氯化鈣反應(yīng)

殼聚糖和明膠分子中含有大量的羥基、氨基和部分酰胺基，可以與二價金屬離子（Ca2+、Mg2+、Co2+）發(fā)生配位反應(yīng)形成水凝膠材料。通過制備含銅羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合支架，負(fù)載成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)銅離子具有很強(qiáng)的抗菌性，在體內(nèi)能夠有效抑制金黃色葡萄球菌的生長，在修復(fù)感染性骨缺損中具有重要意義[11]。

1.2 物理交聯(lián)法

物理交聯(lián)法制備水凝膠材料主要是通過物理作用（氫鍵作用、靜電作用和范德華力）使線性聚合物形成體型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠材料。通過物理方法制備的水凝膠具有熱可逆性，加熱時凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)槿芤骸?/p>

1.2.1 氫鍵作用

氫鍵交聯(lián)制備水凝膠通過分子間或分子內(nèi)的氫鍵將線性高分子交聯(lián)形成凝膠材料。明膠凝膠具有溶膠－凝膠轉(zhuǎn)化的可逆性，明膠溶液的溫度降低，明膠多肽鏈被誘導(dǎo)形成反應(yīng)位點，與相鄰的多肽鏈形成氫鍵交聯(lián)，復(fù)合為類似膠原的右手超螺旋結(jié)構(gòu)，形成一個交聯(lián)點，得到具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的明膠凝膠材料，重新加熱后，明膠凝膠轉(zhuǎn)化為溶膠。

1.2.2 靜電相互作用

通過靜電作用制備凝膠材料主要是帶有相反電荷聚合物產(chǎn)生靜電相互作用使聚合物鏈發(fā)生交聯(lián)的過程，稱為復(fù)凝聚或自組裝。該過程受反應(yīng)體系pH、參與復(fù)凝聚反應(yīng)單體的質(zhì)量比和反應(yīng)體系溫度等因素影響。復(fù)凝聚反應(yīng)以靜電相互作用為驅(qū)動力，與反應(yīng)物的帶電荷密不可分。因此，影響該過程的關(guān)鍵因素為介質(zhì)pH。明膠為兩性天然高分子，在大于等電點介質(zhì)中，帶負(fù)電荷；在小于等電點介質(zhì)中，帶正電荷。在合適pH 介質(zhì)中，明膠可以與帶正電荷聚合物如殼聚糖[12]（見圖6）制備凝膠復(fù)合材料或者與帶負(fù)電荷聚合物（海藻酸鈉、阿拉伯膠）進(jìn)行復(fù)凝聚反應(yīng)制備凝膠復(fù)合支架，其在骨缺損修復(fù)中具有重要應(yīng)用。Gentile等[13]采用明膠與海藻酸鈉進(jìn)行復(fù)凝聚反應(yīng)，以氯化鈣為交聯(lián)劑制備負(fù)載生長因子的凝膠材料，結(jié)果表明該復(fù)合凝膠材料可保持軟骨細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖，在骨修復(fù)中具有顯著應(yīng)用潛力。帶正電荷的明膠與帶負(fù)電荷的海藻酸鈉進(jìn)行復(fù)凝聚，制備負(fù)載種子細(xì)胞的骨修復(fù)支架，結(jié)果表明與純殼聚糖支架相比，復(fù)合支架具有更高的力學(xué)性能和孔隙率，促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化[14]。

圖6 明膠與殼聚糖復(fù)凝聚反應(yīng)

2 凝膠反應(yīng)動力學(xué)研究方法

2.1 紫外分光光度法

凝膠材料的反應(yīng)動力學(xué)復(fù)雜，可以采用紫外分光光度法研究京尼平交聯(lián)殼聚糖或明膠反應(yīng)動力學(xué)。京尼平與含氨基聚合物的交聯(lián)反應(yīng)為不可逆過程，具有pH依賴性，在紫外吸收光譜中，反應(yīng)產(chǎn)物在600 nm 波長處存在特征吸收峰，該峰強(qiáng)度隨著交聯(lián)反應(yīng)時間的增大而增強(qiáng)[15]，最終達(dá)到平衡。采用紫外分光光度法研究在pH為6.75和10.5條件下乳球蛋白與京尼平的反應(yīng)動力學(xué)[16]，建立反應(yīng)方程=k[β-乳球蛋白]a[Genipin]b，結(jié)合Arrhenius方程，得到在pH 為6.75 和10.5 條件下，反應(yīng)級數(shù)分別為0.22 和-0.24，反應(yīng)活化能為66.2 kJ/mol 和9.40 kJ/mol，表明pH對乳球蛋白與京尼平交聯(lián)反應(yīng)具有顯著影響。

2.2 流變法

采用“流變動力學(xué)”可以表達(dá)聚合物反應(yīng)動力學(xué)機(jī)理與流變學(xué)性能間的關(guān)系。根據(jù)Flory凝膠化理論，在可逆和不可逆凝膠中，粘度、模量和扭矩等物理量隨反應(yīng)時間增加，對于簡單m級不可逆凝膠化過程，凝膠轉(zhuǎn)化率與反應(yīng)物的初始濃度無關(guān)，假設(shè)凝膠化過程復(fù)合Arrhenius 方程，凝膠時間的倒數(shù)與C(m-1)和e(Ea/RT)的乘積成正比，即，tgel為凝膠時間（動力學(xué)凝膠化過程中達(dá)到凝膠點的時間），C為組分濃度，Ea為反應(yīng)活化能，m為反應(yīng)級數(shù)。有研究采用流變法研究京尼平與殼聚糖交聯(lián)反應(yīng)動力學(xué)，結(jié)果顯示反應(yīng)活化能為41.26 kJ/mol，反應(yīng)級數(shù)為1.86[17]。京尼平與明膠的交聯(lián)反應(yīng)具有溫度依賴性，在較高溫度下，交聯(lián)反應(yīng)符合Arrhenius方程，活化能介于63.2 kJ/mol和67.8 kJ/mol之間[18]。

2.3 其他方法

采用原子吸收光譜可以測定海藻酸鈉與氯化鈣或氯化鋅凝膠過程中鈣離子或鋅離子濃度變化，以線性模型（LAM）模擬海藻酸鈣凝膠與金屬離子凝膠反應(yīng)動力學(xué)過程，得到海藻酸鈉與氯化鈣或氯化鋅凝膠反應(yīng)動力學(xué)方程，反應(yīng)初始速率方程為和LAM 模型假設(shè)反應(yīng)速率或離子交換速率比擴(kuò)散速率快，建立起反應(yīng)過程中金屬離子濃度與反應(yīng)時間的關(guān)系式通過線型擬合曲線可得到相關(guān)動力學(xué)參數(shù)。原子吸收光譜是以自由金屬離子對光的吸收為基礎(chǔ)，定量測定化學(xué)元素的光譜分析方法，適用于以離子為交聯(lián)劑的凝膠反應(yīng)體系。凝膠反應(yīng)主要是官能團(tuán)之間的反應(yīng)，通過紅外光譜研究凝膠化過程中特征官能團(tuán)隨時間的變化關(guān)系也可以研究凝膠反應(yīng)動力學(xué)過程。

3 凝膠復(fù)合生物材料在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用

天然高分子水凝膠材料具有三維多孔結(jié)構(gòu)，良好的吸水性、黏彈性和生物相容性，廣泛應(yīng)用于骨組織修復(fù)和治療領(lǐng)域，單一天然高分子凝膠生物支架不能為種子細(xì)胞的生長和增殖提供良好的機(jī)械性能，常與其他材料復(fù)合制備凝膠生物支架用于骨修復(fù)和治療（見表1）。

表1 天然高分子凝膠材料負(fù)載細(xì)胞用于組織工程

以氯化鈣為交聯(lián)劑制備明膠/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠材料，載入小鼠成軟骨前體細(xì)胞后，經(jīng)過培養(yǎng)，細(xì)胞存活率仍高達(dá)95%[24]。通過低溫擠出3D打印法，以辣根過氧化物酶（HRP）為酶交聯(lián)劑，將絲素蛋白與酪胺改性明膠進(jìn)行快速交聯(lián)，制備具有多孔結(jié)構(gòu)的水凝膠支架，植入動物模型12周和16周后進(jìn)行組織學(xué)檢查[25]。發(fā)現(xiàn)該多孔結(jié)構(gòu)的水凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，適合軟骨組織的再生，與干細(xì)胞相結(jié)合，在軟骨組織修復(fù)和再生中具有良好的應(yīng)用前景。

為了提高負(fù)載種子細(xì)胞存活率和凝膠復(fù)合材料的成骨性能，向負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞的凝膠復(fù)合材料中加入生長因子、羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白等具有成骨誘導(dǎo)作用的物質(zhì)，以達(dá)到促進(jìn)骨細(xì)胞成骨分化的目的。HA 是骨骼的主要成分，具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性，將其與天然高分子復(fù)合制備生物支架用于骨修復(fù)治療，結(jié)果顯示該材料具有良好的機(jī)械性能和生物相容性，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在BG/CS/HA 支架上表現(xiàn)出了明顯的增殖[26]。在負(fù)載細(xì)胞的復(fù)合凝膠支架中加入生長因子也顯示出促進(jìn)堿性磷酸酶的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞成骨分化性能，加快骨缺損的修復(fù)進(jìn)程[27-28]。

自愈性水凝膠是一種可實現(xiàn)自我修復(fù)的新型智能材料，近年來，采用生物相容性好的天然高分子制備負(fù)載種子細(xì)胞的自愈性水凝膠成為研究的熱點。體內(nèi)三維環(huán)境的變化容易導(dǎo)致凝膠材料中負(fù)載的細(xì)胞生長狀況和形態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞存活率低，自愈性水凝膠動態(tài)化學(xué)鍵的存在使負(fù)載細(xì)胞處于動態(tài)環(huán)境中，促進(jìn)細(xì)胞之間相互接觸傳遞信息和與環(huán)境互動，同時注射后的水凝膠在患處實現(xiàn)自愈合將種子細(xì)胞固定于患處，有利于抵抗多變的體內(nèi)環(huán)境，使負(fù)載種子細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，提高種子細(xì)胞的存活率，在骨組織修復(fù)應(yīng)用中具有顯著優(yōu)勢[29-30]。有研究采用強(qiáng)氧化劑高碘酸鈉氧化海藻酸鈉制備帶醛基的海藻酸，通過氧化海藻酸上的醛基與具有酰肼基的聚乙二醇反應(yīng)生成可逆共價酰腙鍵制備水凝膠，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該水凝膠不僅具有物理凝膠的凝膠－溶膠性質(zhì)和pH 敏感性，有望應(yīng)用于細(xì)胞載體[31]。

4 小結(jié)與展望

尋找理想的骨修復(fù)材料是骨科材料領(lǐng)域的研究熱點，理想的骨修復(fù)材料應(yīng)該具有良好的生物相容性、可降解性、良好的力學(xué)性能和較高孔隙率、滲透性能等特點。生物類交聯(lián)劑具有良好的生物相容性和低細(xì)胞毒性，有利于種子細(xì)胞的黏附、生長和增殖[32]。通過帶相反電荷的天然高分子進(jìn)行自組裝或復(fù)凝聚，以化學(xué)交聯(lián)法結(jié)合物理交聯(lián)法制備的凝膠復(fù)合生物支架為種子細(xì)胞的增殖和分化提供了穩(wěn)定微環(huán)境，在顴骨修復(fù)和頜骨缺損等骨組織修復(fù)和臨床治療具有重要價值。本文總結(jié)凝膠反應(yīng)動力學(xué)研究方法和凝膠復(fù)合材料在骨修復(fù)工程中的應(yīng)用，對于凝膠生物材料的分子工程設(shè)計具有重要意義，為臨床應(yīng)用提供參考。目前，負(fù)載種子細(xì)胞的天然高分子凝膠載體應(yīng)用于骨缺損修復(fù)治療仍處于實驗室階段，主要包括有細(xì)胞實驗、動物實驗、力學(xué)性能和生物性能評價等，臨床研究數(shù)據(jù)較少。未來研究方向?qū)?yōu)化凝膠材料組成和結(jié)構(gòu)，精準(zhǔn)模擬骨組織微環(huán)境，向臨床研究發(fā)展，相關(guān)技術(shù)的發(fā)展使天然高分子凝膠材料將在骨組織修復(fù)工程領(lǐng)域發(fā)揮巨大的作用。