羅秋蓮

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西南寧 530004)

魚腥草(Houttuyniacordata) 又名折耳根、蕺菜、紫蕺等, 為三白草科蕺菜屬多年生草本植物,是我國傳統(tǒng)的藥食兩用的食材之一,因其特殊的腥味而得名。魚腥草具有利尿通淋、清熱解毒、消腫排膿等功效,用于治療肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱痢、熱淋、痛瘡腫毒等癥,其主要成分為揮發(fā)油、多糖類、黃酮類、生物堿、維生素等[1-2]。研究表明,魚腥草多糖具有抗病毒作用；魚腥草水提物對血熱病毒(EHFV)有一定抑制作用；魚腥草是很好的免疫調(diào)節(jié)劑，它能增強白細胞的吞噬功能[3-4]。目前國內(nèi)外對魚腥草的研究主要集中在揮發(fā)油成分上,而對魚腥草多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性研究還鮮有報道。該試驗以熱水浸提取得的魚腥草多糖為研究對象,通過測定魚腥草多糖對羥基自由基、DPPH自由基的清除和亞鐵離子的螯合能力,評價魚腥草多糖的抗氧化活性,運用紫外光譜儀和傅里葉紅外光譜儀對其基本理化性質(zhì)進行分析,以期為魚腥草多糖的結(jié)構(gòu)信息和生物活性研究奠定基礎(chǔ),有利于魚腥草資源的開發(fā)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象。新鮮魚腥草,洗凈晾干,粉碎后備用。

1.1.2主要試劑。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma-Aldrich公司；抗壞血酸(VC)、濃硫酸、三氯乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、菲諾嗪、四水合氯化亞鐵、鐵氰化鉀、七水合三氯化鐵、鄰二氮菲、無水乙醇、硫酸亞鐵、30%雙氧水，均為國產(chǎn)分析純；試驗用水為超純水。

1.1.3主要儀器與設(shè)備。LYNX6000高速離心機,Thermo Scientific公司；AE-200電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；UV-1800 紫外光譜儀,日本島津公司；Mili-Q Advantage A10超純水系統(tǒng),美國Millipore公司；Nicolet iS50 FT-IR紅外光譜儀，美國Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1多糖的提取工藝流程。魚腥草洗凈、晾干→粉碎機粉碎→95%乙醇浸泡24 h→離心、抽濾→濾渣低溫烘干→90 ℃熱水浸提濾渣3次(每次2 h)→離心、抽濾→合并濾液→蒸發(fā)濃縮→85%乙醇沉淀24 h→離心分離→冷凍干燥→脫蛋白→魚腥草多糖。

1.2.2多糖含量的測定。采用苯酚-硫酸法[5]測定多糖含量。

1.2.2.1葡萄糖標準溶液的制備。精確稱取200 mg干燥至恒重的葡萄糖,以超純水定容至50 mL容量瓶中，取1 mL該溶液于50 mL容量瓶中定容,得濃度為0.08 mg/mL葡萄糖標準溶液。

1.2.2.2魚腥草多糖溶液的制備。精確稱取魚腥草多糖40.0 mg,定容至100 mL容量瓶中，取1 mL該溶液于10 mL容量瓶中定容,得到0.04 mg/mL魚腥草多糖溶液。

1.2.2.3標準曲線的繪制。分別吸取葡萄糖標準溶液(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL)于干燥試管中,以超純水各補至2.0 mL,再依次加入6%苯酚溶液1.0 mL和5.0 mL濃硫酸,搖勻,室溫下放置20 min后于490 nm處測定其吸光度。以超純水作為空白,以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.2.4多糖含量的測定。配制適當濃度的多糖樣液,吸取多糖溶液1.0 mL,按“1.2.2.3”操作步驟進行,測定樣品溶液吸光度,多糖含量按以下公式計算：

(1)

式中,0.91為多糖的校正系數(shù)。

1.2.3多糖的脫蛋白。準確稱取魚腥草多糖4.0 g,以超純水溶解后加入Sevage試劑(V氯仿∶V正丁醇=4∶1),多糖溶液和Sevage試劑按3∶1的體積混勻后劇烈振搖30 min。放室溫下靜置2 h后,以轉(zhuǎn)速為8 000 r/min離心5 min,分出水層和有機層之間的沉淀。分液后,水液溶解重復(fù)以上步驟,直至沉淀完全析出。

1.2.4紫外光譜分析。取適量多糖樣品以超純水溶解后,于190～400 nm進行紫外光譜掃描。

1.2.5紅外光譜分析。取多糖樣品約1 mg,以KBr壓片,使用Nicolet iS50 FT-IR傅里葉紅外光譜儀于4 000～500 cm-1進行掃描。

1.2.6抗氧化活性研究。以對羥基自由基、DPPH自由基的清除和亞鐵離子螯合能力為指標[5],研究魚腥草多糖的抗氧化活性。

1.2.6.1羥基自由基清除能力測定。在Chen等[6]方法的基礎(chǔ)上作微小改動對魚腥草多糖的羥基自由基清除能力進行測定。往6支試管中依次加入1.5 mL鄰二氮菲(0.5 mmol)、2 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L,pH=7.4)、1 mL 硫酸亞鐵溶液(0.75 mmol),混勻。往樣品組中加入1 mL多糖溶液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和6.00 mg/mL)、1 mL 過氧化氫(0.01%,v/v),混勻后,置37 °C下恒溫反應(yīng)1 h,測定536 nm處的吸光度。以抗壞血酸(VC)作為陽性對照,以超純水作為空白,平行測定3次,取平均值。按以下公式計算魚腥草多糖對羥基自由基的清除能力：

(2)

式中,As為樣品組吸光度,A1為對照組吸光度,A0為空白組吸光度。

1.2.6.2DPPH自由基清除能力測定。在Jahanbin等[7]方法的基礎(chǔ)上作微小改動對魚腥草多糖的DPPH自由基清除能力進行測定。往6支試管中加入2 mL不同濃度的多糖溶液(0.05、0.10、0.20、0.40、0.60和0.80 mg/mL)和2 mL DPPH-乙醇溶液(0.1 mmol),室溫下暗處避光反應(yīng)30 min,測定517 nm處的吸光度。用抗壞血酸(VC)作為陽性對照,以超純水作為空白,平行測定3次,取平均值。按以下公式計算魚腥草多糖對DPPH自由基的清除率：

清除率=(1-As/A0)×100%

(3)

式中,A0為空白組吸光度,As為樣品組吸光度。

1.2.6.3亞鐵離子螯合能力。在Hu等[8]方法的基礎(chǔ)上作微小改動對魚腥草多糖的亞鐵離子螯合能力進行測定。分別往試管中加入1 mL 不同濃度多糖溶液( 1、2、3、4、5和6 mg/mL)、 0.2 mL菲啰嗪溶液(5 mmol)、0.1 mL 氯化亞鐵溶液(2 mmol)和3.7 mL超純水,混勻。室溫下反應(yīng)10 min后,測定562 nm處的吸光度,用乙二胺四乙酸(EDTA)作為陽性對照,以超純水作為空白，平行測定3次,取平均值。按以下公式計算魚腥草多糖的亞鐵離子螯合能力：

亞鐵離子螯合能力=(1-As/A0)×100%

(4)

式中,A0為空白組吸光度,As為樣品組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測定以葡萄糖濃度為橫坐標(X)、吸光度為縱坐標(y)繪制標準曲線，得出標準曲線回歸方程為y=12.994x+0.06(R2=0.996 6)。結(jié)果顯示在葡萄糖濃度為0～0.08 mg/mL 線性關(guān)系良好。根據(jù)標準曲線回歸方程，計算得出魚腥草多糖含量為62.33%。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 紫外光譜分析經(jīng)典的Sevage法脫蛋白效果較明顯,但其不足之處在于多糖的損耗率較大,因此參考文獻[5]選擇脫蛋白次數(shù)為4次。如圖2所示,紫外光譜圖顯示多糖在200 nm波長附近處有多糖較弱吸收峰,說明該物質(zhì)含有多糖成分。在260和280 nm波長處無明顯的吸收峰,說明多糖樣品中不含蛋白質(zhì)和核酸成分,或所含蛋白質(zhì)和核酸的量很低,Sevage法將此類物質(zhì)已基本除凈。

圖2 魚腥草多糖的紫外光譜圖

2.3 紅外光譜分析魚腥草多糖的紅外光譜掃描如圖3所示,由圖3可知,多糖在4 000～500 cm-1有多處吸收峰,在3 404.27 cm-1波長處有羥基的強烈伸縮振動吸收峰,2 927.05 cm-1處有甲基的C—H較弱伸縮振動吸收峰,這都是多糖的特征吸收峰[9-10]。1 775～1 725 cm-1沒有吸收峰,說明該物質(zhì)沒有羧酸或者乙酰氧基上的C==O伸縮振動吸收峰,表明該多糖為中性多糖；1 620.28 cm-1處的吸收峰為結(jié)晶水或者水化物的吸收峰[9,11]；1 386.48 cm-1處的吸收峰為C—H的變角振動吸收峰；1 101.42、1 046.98和1 014.95 cm-1是吡喃糖環(huán)的特征吸收峰,來自吡喃糖環(huán)的C—O—H伸縮振動和C—O—C糖苷鍵的非對稱振動吸收峰[9-10]。在835.59 cm-1處有弱吸收峰，表示多糖中可能含有 α-D-半乳吡喃糖、α-D-葡萄吡喃糖、β-D-阿拉伯吡喃糖或者α-D-甘露吡喃糖；在761.92 cm-1有明顯吸收峰，表明有 α-D-木吡喃糖[9,11]。根據(jù)紅外光譜分析結(jié)果可以鑒定魚腥草多糖是含有α-或β-構(gòu)型的吡喃中性多糖。

圖3 魚腥草多糖的紅外光譜圖

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1羥基自由基清除能力。羥基自由基被認為是最具有活性、對人體毒害最強、毒性最大的一種自由基,它可以穿過細胞膜作用于碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物分子引起氧化損傷導(dǎo)致細胞死亡從而引發(fā)衰老等各種疾病[12]。因此,在生命體內(nèi)對羥基自由基的清除具有重要意義。從圖4可以看出，魚腥草多糖對羥基自由基具有較好的清除效應(yīng),且多糖濃度與清除率呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系,清除率隨著濃度的增大而上升。當濃度為0.25 mg/mL時,對羥基自由基的清除率較低，為6.3%；當多糖濃度達到6.00 mg/mL時,對羥基自由基的清除率上升至69.35%;,但與VC陽性對照組相比,其抗氧化活性相對較弱。

圖4 魚腥草多糖對羥基自由基的清除

2.4.2DPPH自由基清除能力。DPPH是一種自由基復(fù)合物,被廣泛用于證實各種樣品的自由基清除能力。DPPH自由基在醇溶液中穩(wěn)定存在時呈現(xiàn)紫色,遇到抗氧化物時可使DPPH自由基孤對電子被配對而導(dǎo)致溶液變成淡黃色[13-14]。從圖5可以看出,在0.05～0.80 mg/mL時,魚腥草多糖對DPPH自由基具有明顯的清除效應(yīng),并且清除能力與多糖濃度成正比。當多糖濃度達到0.80 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率上升至83.36%,與VC陽性對照組的清除率基本相當,表明魚腥草多糖對DPPH自由基的清除能力很強。

圖5 魚腥草多糖對DPPH自由基的清除

2.4.3亞鐵離子螯合能力。在不同種類的金屬離子中,Fe2+被認為是最強的氧化劑,這是由于它的反應(yīng)活性高,可以加速脂質(zhì)氧化分解氫自由基以及脂質(zhì)過氧化物酶活性，它的主要作用機理為Fe2++H2O2→Fe3++ OH· + OH-[15]。從圖6可以看出，魚腥草多糖對亞鐵離子具有一定的螯合能力,在1～6 mg/mL時,多糖對亞鐵離子螯合能力隨著濃度的增大而增強,當濃度為1 mg/mL時，對亞鐵離子的螯合能力為6.9%,具有較弱的螯合能力；當濃度為6 mg/mL時，對亞鐵離子的螯合能力上升為30.54%,螯合能力明顯增強；但與陽性對照組相比,其螯合能力遠弱于EDTA。

圖6 魚腥草多糖對亞鐵離子的螯合能力

3 結(jié)論

該試驗以熱水浸提并經(jīng)脫蛋白后得到的魚腥草多糖作為研究對象,對其基本理化性質(zhì)和體外抗氧化活性進行研究。紫外光譜圖顯示多糖在200 nm波長附近處有多糖較弱吸收峰,表明該物質(zhì)含有多糖成分。紅外光譜儀檢測結(jié)果表明,魚腥草多糖具有多糖的特征性基團,是含有α-或β-構(gòu)型的吡喃中性多糖?？寡趸钚栽囼灲Y(jié)果表明,魚腥草多糖對DPPH自由基具有很強的清除能力,在高濃度時,其清除能力與陽性對照組基本相當,對羥基自由基的清除和亞鐵離子的螯合能力均表現(xiàn)出較好的抗氧化效應(yīng),且隨著多糖濃度的增大,其清除效應(yīng)越強,呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。該研究可為后續(xù)深入探究魚腥草多糖的高級結(jié)構(gòu)信息和生物活性研究奠定基礎(chǔ),有利于魚腥草資源的開發(fā)與利用。