李文宗,梁 鑫,楊露露,王潤豪,王 磊

(1.河南華智營養(yǎng)科技有限公司，河南新鄉(xiāng) 453000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京 100081)

甘薯病毒病是甘薯的重要病害，具有種類繁多、分布廣泛、容易傳播、危害嚴重、防控困難等特點。甘薯是無性繁殖作物，在感染病毒后，在甘薯體內(nèi)病毒會不斷積累，逐代加重，進而引起甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)的下降以及種性的退化，嚴重損害甘薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]，是目前限制甘薯生產(chǎn)的主要因素之一。已知侵染甘薯的病毒有30余種[2-3]。甘薯卷葉病毒(sweet potato leaf curl virus，SPLCV)、甘薯羽狀斑駁病毒(sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)、甘薯褪綠矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)是3種嚴重危害甘薯的病毒，在世界甘薯種植區(qū)廣泛分布[4-6]。其中，SPLCV為單鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組大小約2.8 kb，是雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬成員[7]；SPFMV為正義單鏈RNA病毒，基因組大小約10 kb，是馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬成員;SPCSV為雙組份正義單鏈RNA病毒，基因組大小約15.3～16.0 kb，是長線形病毒科毛行病毒屬成員[8]。不同品種甘薯植株在遭受SPLCV病毒侵染后，會表現(xiàn)出不同程度的致病癥狀，如葉片向上卷曲、黃化等，此外其葉綠素含量指數(shù)、葉面積、葉片鮮重均有所降低[9]。SPFMV和SPCSV可以協(xié)生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害(sweet potato virus disease，SPVD)[10]，甘薯植株在單獨受到SFMV或SPCSV后的癥狀表現(xiàn)輕微，而受SPVD感染的甘薯植株表現(xiàn)出明顯的矮化、葉片褪綠、花葉明脈等癥狀[11]。SPVD的發(fā)生能夠顯著影響甘薯的產(chǎn)量，在SPVD發(fā)生嚴重時，可使甘薯的產(chǎn)量損失達到90%以上，甚至絕收，其原因在于甘薯植株在感染SPVD病毒后,其葉片葉綠素含量降低導致光合速率下降，進而影響甘薯的產(chǎn)量[12-14]。有研究表明，SPFMV在我國不同甘薯產(chǎn)區(qū)普遍存在，而種薯是否攜帶SPCSV則是苗期甘薯病毒病發(fā)生的關(guān)鍵因素[4,15-16]。因此，推廣和應(yīng)用甘薯脫毒種苗，可以有效地防止病毒病造成的危害。

病毒檢測是脫毒苗生產(chǎn)和田間苗病毒鑒定的重要環(huán)節(jié)之一，甘薯病毒病常用的檢測方法有癥狀學診斷法、指示植物檢測法(生物學檢測法)、血清學檢測法、分子生物學檢測法等。以聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)為代表的分子生物學檢測技術(shù)正逐步成為病毒檢測的主要方法。PCR技術(shù)的應(yīng)用彌補了癥狀學診斷法、指示植物檢測法、血清學檢測法的不足，如準確性低，檢測周期長，假陽性反應(yīng)率高等。常規(guī)PCR技術(shù)檢測一次只能檢測一種病毒，對于復合侵染的病毒需要進行多次PCR反應(yīng)，操作較為煩瑣。而多重PCR是在普通的單一PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，可以同時擴增多個基因，具有靈敏、快速、高效、成本低、特異性強、步驟簡便等特點，適合進行大量甘薯樣品的檢測[17]。目前關(guān)于應(yīng)用多重PCR對2種及以上的甘薯病毒的檢測已有相關(guān)研究[18-21]，但對于SPLCV、SPFMV和SPCSV 3種病毒的多重RT-PCR檢測鮮見相關(guān)報道。建立針對以上3種常見甘薯病毒的多重PCR檢測技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者以單一PCR為基礎(chǔ)，全面優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，建立了以上3種常見甘薯病毒的多重PCR檢測體系，以期為甘薯病毒檢測提供一種簡便、快捷的分子生物學方法，為甘薯田間病毒鑒定和甘薯脫毒苗的生產(chǎn)提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料材料：供試甘薯樣本為采自河南新鄉(xiāng)的帶有明顯病毒癥狀的甘薯田間樣本；將經(jīng)過檢測不含SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒的甘薯脫毒組培苗作為陰性對照。

試劑：植物DNA提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒購自百奧曼公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×TaqMix Pro(+Dye) 購自莫納生物公司，SPLCV病毒重組質(zhì)粒(含SPLCV CP基因)、SPFMV病毒重組質(zhì)粒(含SPFMV CP基因)、SPCSV病毒重組質(zhì)粒(含SPCSV CP基因)由河南華智營養(yǎng)科技有限公司構(gòu)建保存，其他所應(yīng)用的試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計與合成。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的SPLCV、SPFMV和SPCSV[21]外殼蛋白(CP)基因的核苷酸保守序列和文獻分別設(shè)計和合成引物。引物均由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

表1 甘薯病毒的特異性引物

1.2.2核酸的提取。稱取約100 mg的甘薯葉片，經(jīng)液氮研磨后按照植物總RNA提取試劑盒和植物總DNA提取試劑盒說明書分別提取甘薯葉片RNA和DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳分別檢測RNA和DNA的提取質(zhì)量。

1.2.3單一PCR反應(yīng)體系和條件。采用MonScriptTM RTⅢ Super Mix with dsDNase (Two-step)的說明書進行反轉(zhuǎn)錄試驗，獲取待測樣品的第1鏈cDNA，并以獲取的高質(zhì)量DNA或cDNA作為模板，分別對3種病毒進行特異性擴增檢測。單一PCR反應(yīng)體系：2×TaqMix Pro(+Dye) 10.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板或cDNA模板各1.0 μL，無菌水補足至20 μL。具體反應(yīng)程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)數(shù)為35；72 ℃最終延伸10 min。

待PCR擴增反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴增反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)束后，采用凝膠成像儀進行結(jié)果分析和記錄。

1.2.4多重PCR檢測反應(yīng)條件的優(yōu)化和建立。以SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒基因組混合質(zhì)粒作為模板，參考單一PCR反應(yīng)體系，加入以上3種病毒的特異性引物進行多重PCR反應(yīng)，對能夠影響多重PCR的幾個主要條件(引物添加量、退火溫度、循環(huán)數(shù))依次進行優(yōu)化，在進行某一個條件的優(yōu)化時，應(yīng)保持其他反應(yīng)條件不變。

引物SPLCV-F/R∶SPFMV-F/R∶SPCSV-F/R的使用量比例設(shè)置5個處理：0.5 μL/0.5 μL∶0.5 μL/0.5 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL∶0.2 μL/0.2 μL；0.1 μL/0.1 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.2 μL/0.2 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.4 μL/0.4 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL。

循環(huán)數(shù)分別設(shè)25、30、35、40次；退火溫度分別設(shè)48、52、56、 58、62 ℃。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5多重PCR的特異性檢測。分別以構(gòu)建完成的SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒基因組質(zhì)粒作為模板，應(yīng)用超微量紫外分光光度計測定DNA濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)將濃度換算為拷貝數(shù)。以濃度分別為107拷貝/μL的SPLCV、SPFMV、SPCSV病毒基因組重組質(zhì)粒當作模板，進行多重PCR，檢測反應(yīng)體系的特異性。同時，利用經(jīng)檢測不含有甘薯病毒的組培苗樣品測試多重PCR體系的特異性。

1.2.6多重PCR的靈敏性檢測。將SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒的基因組重組質(zhì)?；旌?，隨后進行10倍稀釋，選取濃度為106、105、104、103、102拷貝/μL 5個濃度梯度的3種病毒混合質(zhì)粒作為檢測模板，進行多重PCR檢測，以進行多重PCR的靈敏性檢測。

1.2.7多重PCR的初步應(yīng)用。從新鄉(xiāng)市郊區(qū)采集帶有相應(yīng)病毒癥狀的甘薯田間樣本，利用建立的多重PCR體系進行檢測。

1.2.8PCR產(chǎn)物的測序與序列分析。切膠回收部分多重PCR擴增產(chǎn)物，并將回收后的PCR產(chǎn)物送至武漢金開瑞生物工程有限公司進行測序，測序完成后，利用BLAST工具、DNAMAN軟件將測序結(jié)果進行序列比對和同源率分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒總RNA和DNA提取及質(zhì)量檢測分別利用植物總RNA提取試劑盒和RNA提取試劑盒獲取質(zhì)量較高的核酸。RNA凝膠電泳顯示(圖1a)，28S rRNA、18S rRNA條帶清晰，28S和18S的亮度比為1.5∶1.0～2.0∶1.0，無DNA條帶，無拖尾及彌散條帶，表明蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)基本去除，且完整性良好，可以進行后續(xù)試驗。DNA凝膠電泳結(jié)果顯示(圖1b)，基因組條帶單一明亮，無彌散條帶，說明DNA沒有發(fā)生降解，純度較高，可以進行后續(xù)試驗。

圖1 甘薯葉片總RNA(a)、總DNA(b)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2 多重RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化和確立以帶有病毒甘薯樣品的DNA/cDNA作為模板，分別利用SPLCV、SPFMV和SPCSV 3種病毒的特異性引物進行單一PCR擴增，分別擴增出180、295、774 bp的特異性條帶，符合預期目的條帶大小(圖2a)。在對SPLCV、SPFMV和SPCSV 3種病毒的多重RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化方案中，以單一RT-PCR作為基礎(chǔ)，分別對引物添加量、退火溫度、循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化。3對特異性引物不同添加量優(yōu)化試驗結(jié)果顯示，3對引物不同添加量組合對擴增產(chǎn)物的影響較大，對774和180 bp的目的條帶擴增影響尤為明顯，綜合比較在不同添加量情況下3條目的條帶的擴增亮度，多重PCR檢測體系的選擇引物配比組合為：0.2 μL/0.2 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL，且3種病毒擴增的目的條帶均比較明亮(圖2b)。退火溫度優(yōu)化試驗顯示，退火溫度為48、52 、56、 58 、62 ℃時，均可擴增出目的條帶，在58 ℃時，各目的條帶擴增有效性接近，因此選擇58 ℃作為多重PCR的最佳退火溫度(圖2c)。當循環(huán)數(shù)為25、30、35、40次時，均能擴增出目的條帶，且隨循環(huán)數(shù)增加，774bp的目的條帶亮度不斷增加，其中當循環(huán)次數(shù)分別為35和40次時，兩者差異不大，綜合考慮，選擇35次作為最優(yōu)的循環(huán)次數(shù)(圖2d)。根據(jù)以上不同條件的優(yōu)化結(jié)果，最終確定多重RT-PCR最佳反應(yīng)體系為：2×TaqMix Pro(+Dye) 10 μL,SPLCV上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL,SPFMV上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL,SPCSV上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA/cDNA模板各1.0 μL，補足ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min。

注：M.DL Marker 2000；a.單一PCR檢測結(jié)果(泳道1～3：SPLCV、SPFMV、SPCSV)；b.引物濃度優(yōu)化結(jié)果(泳道1～5：SPLCV-F/R∶SPFMV-F/R∶SPCSV-F/R的添加量分別為0.5 μL/0.5 μL∶0.5 μL/0.5 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL∶0.2 μL/0.2 μL；0.1 μL/0.1 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.2 μL/0.2 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；0.4 μL/0.4 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；c.退火溫度優(yōu)化結(jié)果(泳道1～5：48、52、56、58、62 ℃)；d.循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果(泳道1～4：25、30、35、40次)

2.3 多重PCR檢測體系的特異性特異性檢測試驗結(jié)果表明，利用建立的多重PCR方法均能在單一質(zhì)粒、兩兩混合質(zhì)粒和3種混合的質(zhì)粒中擴增出對應(yīng)的目的條帶，而從不含有病毒的脫毒組培苗樣品中未擴增出目的條帶(圖3)。這說明建立的多重PCR檢測體系具有良好的特異性。

注：M.DL 2000 DNA 分子量標準：泳道1.SPLCV;泳道2.SPFMV;泳道3.SPCSV;泳道4.SPLCV+SPFMV;泳道5.SPLCV+SPCSV;泳道6.SPFMV+SPCSV;泳道7.SPLCV+SPFMV+SPCSV;泳道8.脫毒苗樣品

2.4 多重PCR的靈敏性靈敏性試驗結(jié)果表明，建立的多重PCR方法對SPLCV、SPFMV和SPCSV的最低檢出濃度為104拷貝/μL(圖4)。這表明該體系可以實現(xiàn)對以上3種甘薯病毒104拷貝水平的檢測。

注：M.DL 2000 DNA 分子量標準:泳道1～5.106、105、104、103、102拷貝/μL

2.5 多重PCR檢測方法的應(yīng)用利用優(yōu)化后的多重PCR體系檢測甘薯田間樣本(圖5)。甘薯田間樣品多為不同病毒的復合侵染。從圖5可見，樣品2、3擴增3條目的條帶，為SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒復合侵染。樣品1、4、5擴增出2條目的條帶，為SPLCV和SPFMV的復合侵染。該研究建立的多重PCR方法可以在含有不同病毒的甘薯葉片樣本中擴增出相應(yīng)病毒的目的條帶，并能夠清晰地分辨出SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒。

注：M.DL 2000 DNA分子量標準；泳道1～5.甘薯田間樣品；泳道6.陰性對照

2.6 多重PCR擴增產(chǎn)物的鑒定將經(jīng)多重PCR擴增的SPLCV、SPFMV、SPCSV的條帶進行測序,并將測序結(jié)果與NCBI中的參考病毒基因序列進行同源性比對分析，SPLCV多重PCR擴增產(chǎn)物與日本、美國、廣東、山東、四川分離物的核苷酸同源率均在94%及以上，其中，與日本分離物的核苷酸同源率達到98%(圖6a)；SPFMV多重PCR擴增產(chǎn)物與澳大利亞、中國、西班牙、日本、韓國分離物核苷酸同源率在94%以上，其中，與澳大利亞分離物核苷酸同源率達到99%(圖6b)；SPCSV片段與西班牙、河南、山東、廣東、四川同源率在97%及以上(圖6c)。這說明根據(jù)設(shè)計的特異性引物建立的多重PCR體系對于3種病毒的檢測具有廣泛的適用性和可靠性。

注：a.SPLCV多重PCR擴增產(chǎn)物與SPLCV參考分離物核苷酸序列的同源率比對；b.SPFMV多重PCR擴增產(chǎn)物與SPFMV參考分離物核苷酸序列的同源率比對；c.SPCSV多重PCR擴增產(chǎn)物與SPCSV參考分離物核苷酸序列的同源率比對

3 討論與結(jié)論

目前核酸擴增技術(shù)仍是進行甘薯病毒檢測一項快速準確的技術(shù)，包括多重PCR技術(shù)[18-21]、熒光定量PCR技術(shù)[22-24]、LAMP恒溫擴增技術(shù)[25-27]、RPA重組酶聚合酶擴增技術(shù)[28]等方法。其中，熒光定量PCR技術(shù)有更高的靈敏性，但在進行多個病毒檢測時需要針對不同病毒設(shè)計特異性探針，成本較高；LAMP恒溫擴增技術(shù)具有特異性高、擴增結(jié)果可視化等優(yōu)點，但卻存在引物設(shè)計復雜、易產(chǎn)生非特異性擴增等缺點；RPA重組酶聚合酶技術(shù)具有反應(yīng)條件溫和、時間短、靈敏度高等優(yōu)點，但作為新興技術(shù)，其研究仍不成熟[29-31]。因此，多重PCR作為一項兼具費用低廉、操作簡單、結(jié)果精確等特點的技術(shù)，仍是進行多種病毒同時檢測經(jīng)濟有效的手段。與單重PCR相比，多重PCR技術(shù)可以在同一個反應(yīng)體系中加入2對及以上的特異性引物，實現(xiàn)多個目的基因同時擴增的目的[32]。多重PCR的檢測會存在不同引物對之間相互抑制或產(chǎn)生非特異性擴增等問題。在建立多重PCR反應(yīng)體系時，應(yīng)當合理選擇引物，并對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件不斷優(yōu)化，調(diào)整出適宜的反應(yīng)條件和體系。目前，多重PCR檢測體系已廣泛應(yīng)用于甘薯病毒病的檢測，王爽等[18]應(yīng)用多重PCR檢測了菜豆金色花葉病毒屬病毒和甘薯褪綠矮化病毒，許泳清等[19]利用雙重RT-PCR檢測甘薯褪綠矮化病毒和甘薯羽狀斑駁病毒，蔣素華等[20]運用多重RT-PCR建立了甘薯的褪綠矮化病毒、潛隱病毒、羽狀斑駁病毒的檢測體系。

因此，該研究在前人研究的基礎(chǔ)上，探索建立檢測SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種病毒的多重PCR體系。該研究通過參考相關(guān)文獻[33]，設(shè)計不同病毒的特異性引物且各目的片段大小有一定差異，SPLCV、SPFMV和SPCSV 3種病毒目的條帶的大小分別為180、295和774 bp，能有效區(qū)分目標病毒，便于檢測結(jié)果的觀察分析。通過對引物濃度的摸索試驗，確定了SPLCV、SPFMV、SPCSV的上下游引物添加量分別為0.2 μL/0.2 μL∶0.2 μL/0.2 μL∶0.5 μL/0.5 μL；退火溫度優(yōu)化和循環(huán)數(shù)優(yōu)化試驗表明，退火溫度為 58 ℃時，循環(huán)數(shù)為35次時，擴增效果最好。靈敏度試驗和特異性試驗表明，建立的多重PCR體系可以實現(xiàn)104拷貝/μL病毒的檢測，且具有良好的特異性。該研究采用2×TaqMaster mix預混液極大地優(yōu)化了操作步驟，并檢測5份甘薯田間樣品，準確、靈敏地檢測出復合侵染的甘薯病毒，其中樣品2、3為3種病毒復合侵染，且受SPLCV侵染較輕。此外，在樣品2、3中，SPFMV的亮度明顯高于SPCSV，表明樣品中SPFMV的病毒含量更高，這可能是由于SPCSV與SPFMV共同侵染甘薯時，SPFMV病毒含量比單獨侵染時增加600倍有關(guān)[34]。樣品1、4、5為2種病毒復合侵染。總之，該研究通過選擇和設(shè)計特異性引物，優(yōu)化影響多重PCR反應(yīng)的主要條件，建立針對SPLCV、SPFMV、SPCSV 3種甘薯病毒的多重PCR檢測體系，該體系可實現(xiàn)對3種甘薯病毒104拷貝/μL水平的檢測，具有良好的特異性和廣泛的適用性，可對田間采集的甘薯樣品進行快速準確的檢測，不僅能夠促進甘薯病毒檢測技術(shù)的發(fā)展，還可為甘薯病毒的檢測和防控提供技術(shù)支持。