李秀華，梁瑞萍,張仙保，李文霞,王亮明

(包頭市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古包頭 014013)

馬鈴薯早疫病(potato early blight)俗稱夏疫病、輪紋病或干斑病，在我國和世界各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)分布較為普遍，嚴(yán)重地塊發(fā)病率大于80%，減產(chǎn)達(dá)30%以上[1-4]。該病主要為害葉片，也能侵害葉柄、莖和薯塊。葉上病斑最初為褐色圓形斑點(diǎn)，以后逐漸擴(kuò)大成圓至近圓形，褐色至暗褐色，病斑邊緣明顯，有清晰的同心輪紋，有時(shí)病斑外緣有較窄的黃色暈圈。據(jù)報(bào)道，馬鈴薯早疫病主要由茄鏈格孢菌(Alternariasolani)引起[5]，另有研究表明馬鈴薯早疫病的病原菌分別為Alternariasolani和Alternariaalternata[6]。包頭地區(qū)是內(nèi)蒙古自治區(qū)種薯和商品薯的主產(chǎn)區(qū)之一，早疫病是常發(fā)病害，危害較為嚴(yán)重。為確定當(dāng)?shù)卦缫卟〔≡臍w屬，筆者采用常規(guī)組織分離法對包頭地區(qū)的馬鈴薯早疫病病原菌進(jìn)行分離鑒定，并利用苗期噴霧接種對部分馬鈴薯品種早疫病抗性進(jìn)行鑒定，以期為包頭地區(qū)馬鈴薯早疫病的綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和純化2019年6月陸續(xù)在包頭市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院院內(nèi)和固陽縣馬鈴薯試驗(yàn)區(qū)采集具典型同心輪紋的馬鈴薯早疫病病葉，依據(jù)常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原菌的分離、純化，得到供試菌株，命名為“mls1”。將病原菌保存于PDA斜面上，置于4 ℃冰箱保存。

1.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取一圈菌餅，挑針挑取菌餅接種于新的PDA平皿上，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3～7 d。肉眼觀察菌落顏色、形態(tài)、氣生菌絲特點(diǎn)，OLYMPUS CX31顯微鏡下觀察病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)。4～10 d后顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)，測量分生孢子的大小，包括長、寬、橫縱隔膜數(shù)、孢子顏色等。參考張?zhí)煊畹萚7-8]對鏈格孢屬的特征描述進(jìn)行鑒定。

1.3 病原菌的致病性測定病原菌置于PDA固體培養(yǎng)基上28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，7 d后用無菌水洗脫分生孢子，利用血球計(jì)數(shù)板制備成1×107個(gè)/mL孢子懸浮液。采用離體葉片法[9]，取新鮮無病蟲害的馬鈴薯葉片，無菌水沖洗后置于75%乙醇中振蕩消毒2 min，無菌水漂洗3次，置于鋪有無菌濕濾紙的平皿內(nèi)。采用涂抹法將孢子懸浮液接種于消毒后的馬鈴薯葉背面，空白對照以無菌水處理，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，接種后每24 h觀察1次。依據(jù)柯赫氏法則，發(fā)病后從病斑處再次分離病原菌，并與原接種菌進(jìn)行比較。

1.4 病原菌rDNA-ITS 序列鑒定收集在PDA平板上培養(yǎng)8～10 d 的早疫病菌菌絲體，采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[10]。利用真菌核糖體rDNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS) PCR 擴(kuò)增的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對提取的真菌總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(25 μL)：2.0 μL dNTPs(10 mmol/L)，5.0 μL 10×Reaction buffer(with MgCl2)，0.5 μLTaq聚合酶(5 U/μL)，ITS1(10 μmol/L)和ITS4(10 μmol/L)各2.0 μL，2.0 μL模板DNA(30 ng/μL)，11.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 45 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀GelDoc-it2imager下觀察照相，觀察到預(yù)期條帶后，PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.5 抗病性接種鑒定試驗(yàn)于2020年5月10日在包頭市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院育苗溫室進(jìn)行，供試品種購自內(nèi)蒙古自治區(qū)固陽縣精誠脫毒馬鈴薯繁育中心，種薯級別為原原種，經(jīng)催芽后種植于花盆內(nèi)，花盆內(nèi)為育苗基質(zhì)。每個(gè)品種播種25盆，每盆1粒，共計(jì)12個(gè)品種，3次重復(fù)。6月2日參試品種全部出苗。于4葉期噴霧接種鑒定菌株分生孢子懸浮液，分生孢子濃度為1×104個(gè)/mL，保濕(RH=100%)48 h后常規(guī)管理。溫室溫度為20～32 ℃。接種3 d后開始觀察，第7天對供試品種逐葉按照9級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)。

馬鈴薯早疫病病害分級標(biāo)準(zhǔn)[11]，0級：葉片無病斑；1級：病斑面積占整個(gè)葉面積5%及以下；3級：病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%；5級：病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%；7級：病斑面積占整個(gè)葉面積21%～50%；9級：病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上?？共⌒栽u價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[12]：免疫(I)，病情指數(shù)0；高抗(HR)，病情指數(shù)0～0.10；抗病(R)，病情指數(shù)0.11～20.00；中抗(MR)，病情指數(shù)20.01～40.00；中感(MS)，病情指數(shù)40.01～60.00；感病(S)，病情指數(shù)在60.01以上。

發(fā)病率(%)=發(fā)病葉片數(shù)/調(diào)查葉片數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)特征將馬鈴薯早疫病病原菌“mls1”接種在PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，如圖1所示，其氣生菌絲體生長快，較發(fā)達(dá)，初期氣生菌絲灰白色，約4 d后轉(zhuǎn)為灰綠色。PDA平皿上培養(yǎng)菌落形成以接種菌餅為中心的同心圓，約8 d長滿直徑9 cm的培養(yǎng)皿。如圖2所示，顯微鏡下觀察到氣生菌絲有隔膜和分支，分生孢子梗顏色黃褐色，單生或呈分支狀，較菌絲短且寬，寬5～10 μm。28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)至4 d后，顯微鏡下可觀察到分生孢子，由孢子梗頂端產(chǎn)生，單生或簇生，淡黃色至黃褐色，形態(tài)多樣，為短棍形、梨形、長橢圓形等。1～4個(gè)橫膈膜，0～3個(gè)縱、斜膈膜，大小多在(30～70) μm×(15～25) μm，多數(shù)頂端具喙，喙寬約5 μm。

注：a.培養(yǎng)7 d時(shí)菌落背面形態(tài)；b.培養(yǎng)7 d時(shí)菌落正面形態(tài)

圖2 馬鈴薯早疫病“mls1”分生孢子形態(tài)

2.2 病原菌致病性將分離純化后得到的馬鈴薯病原菌“mls1”菌株的分生孢子懸浮液接種于馬鈴薯健康離體葉片上，25 ℃恒溫保濕光照培養(yǎng)，約4 d，接種“mls1”菌株的葉片出現(xiàn)典型的同心輪紋癥狀，空白對照無癥狀。對接種后表現(xiàn)典型早疫病癥狀的馬鈴薯病斑進(jìn)行再分離、純化，得到與原菌株一致的病原菌。依據(jù)柯赫氏法則，證實(shí)標(biāo)記為“mls1”的原接種菌株為馬鈴薯早疫病的病原菌。

2.3 病原菌rDNA-ITS 序列鑒定利用CTAB法提取病原菌“mls1”基因組DNA，如圖3所示，馬鈴薯早疫病菌基因組DNA大小約在5 000 bp，無降解，無污染。所提DNA經(jīng)超微量分光光度計(jì)Thermo NanoDrop 2000定量到30 ng/μL，備用。利用真菌核糖體rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)( ITS) PCR 擴(kuò)增的通用引物 ITS1和ITS4對提取的真菌總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在早疫病病原菌基因組DNA中擴(kuò)增出1條540 bp左右的片段。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果表明，病原菌“mls1”的rDNA-ITS區(qū)大小為542 bp，將該序列與GenBank中已登錄序列進(jìn)行Blast比對。如圖4所示，該菌ITS序列與鏈格孢屬Alternaria同源性高，為100%，結(jié)合形態(tài)特性確定該病原菌為鏈格孢屬真菌。

圖3 馬鈴薯早疫病病原菌“mls1”基因組DNA(a)和ITS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(b)

圖4 馬鈴薯早疫病病原菌ITS序列Blast比對結(jié)果

2.4 不同品種馬鈴薯早疫病抗性接種鑒定溫室對12個(gè)馬鈴薯品種早疫病抗性接種鑒定，發(fā)現(xiàn)接種后3 d馬鈴薯葉片開始出現(xiàn)發(fā)病點(diǎn)，之后病斑開始擴(kuò)展，約7 d形成輪紋狀病斑，部分葉片干枯，之后發(fā)病進(jìn)展緩慢。在供試的12個(gè)馬鈴薯品種中，僅“中薯3號(hào)”病情指數(shù)為23.44，依據(jù)抗病性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可知，其對早疫病抗性評價(jià)是中抗。除“中薯3號(hào)”外，其余品種均是早疫病抗性品種，其中“荷蘭15”發(fā)病率和病情指數(shù)最高(表1)。

表1 不同馬鈴薯品種抗病性接種鑒定

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯早疫病在內(nèi)蒙古馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)是常發(fā)病害，尤其夏季雨熱同期發(fā)病較重，可侵染塊莖，對馬鈴薯產(chǎn)量造成一定影響[13-15]。該研究利用rDNA-ITS 序列鑒定，將所分離馬鈴薯早疫病菌株鑒定到鏈格孢屬(Alternaria)，未鑒定到種，這與已有報(bào)道類似[16-17]，下一步需設(shè)計(jì)特異性引物，再次進(jìn)行鑒定。

同時(shí)，接種鑒定了包頭地區(qū)一些市場栽培品種對早疫病的抗性，其中“中薯3號(hào)”屬于中抗品種，其余屬于抗性品種，在抗性品種中“荷蘭15號(hào)”病情指數(shù)最高。趙艷群等[18]對部分馬鈴薯品種的早疫病田間抗性進(jìn)行評價(jià)，其中“中薯3號(hào)”同為中抗品種，但病情指數(shù)高于該試驗(yàn)。Stewart等[19]以14個(gè)基因型馬鈴薯為試材，對其早疫病抗性進(jìn)行了評價(jià)，認(rèn)為溫室接種鑒定和田間自然發(fā)病抗性鑒定結(jié)果一致。梁偉伶[20]對部分馬鈴薯品種進(jìn)行了田間抗性鑒定和接種鑒定，評價(jià)結(jié)果略有不同。