楊先富，包濤濤，袁曉娟，彭彩麗，楊勝紅，楊政益，莫興虎，吳通奎，汪忠榮，王正文

(黔東南州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州黔東南 556000)

白細(xì)胞介素18(IL-18)，是動(dòng)物體內(nèi)一種重要的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子，1989年首次被描述[1]，1995年日本學(xué)者 Okamura等[2]從中毒性休克的鼠肝臟中分離并克隆出了該因子，1996年正式命名為白細(xì)胞介素18[3]，1999年Muneta等[4-5]從豬肺泡巨噬細(xì)胞中克隆到IL-18；IL-18在抗腫瘤、抗感染及免疫調(diào)節(jié)、抗超敏反應(yīng)、抗自身免疫性糖尿病、抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等方面有著積極的作用[6-7]。劍河白香豬產(chǎn)于貴州省劍河縣的叢林山寨中，是一種微型豬，生活條件帶有野性的特殊豬種。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外關(guān)于該豬種IL-18基因的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)引物設(shè)計(jì)、反轉(zhuǎn)錄、PCR、質(zhì)粒載體構(gòu)建技術(shù)克隆劍河白香豬的IL-18全基因，旨在為研究和開(kāi)發(fā)豬IL-18免疫增強(qiáng)劑及有效控制豬病毒性傳染病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集劍河白香豬原種場(chǎng)的5周齡仔豬脾臟，取脾臟20 mg，剪碎，放入1.5 mL離心管中，加100 μL生理鹽水，用組織勻漿機(jī)破碎，備用。

1.2 主要試劑EastepP? Super總 RNA提取試劑盒，購(gòu)自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR? Max DNA Polymerase、DL 2000 DNA Mkaker、TaKaRa miniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、 miniBEST Plasmid purification Kit、E.coliDH5a、瓊脂糖、L-瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；X-gal溶液、IPTG溶液、氨芐青霉素溶液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物根據(jù)GenBank收錄的豬IL-18基因序列(Y11132)，采用oligo7引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增劍河白香豬IL-18基因序列引物：正向引物(P1)，5′-ATGGCTGCTGAACCAGAAG-3′；反向引物(P2)，5′-CTAGTTCTTGTTTTGAACAGTGAACATTAT-3′。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 總RNA的提取在處理好的樣品中，每管加入500 μL RNA裂解液，顛倒離心管5次；然后加入500 μL稀釋液，混勻，以12 000 r/min離心5 min；在上清液中加入400 μL無(wú)水乙醇，混勻；將混合液轉(zhuǎn)移至離心柱(每管上清液分裝2個(gè)離心柱)，12 000 r/min離心1 min，棄濾液；加入DNA酶 Ⅰ 5 μL，孵育液孵育15 min；加入600 μL洗液，12 000 r/min離心45 s，棄濾液；再重復(fù)洗1次；將離心柱重新放置于收集管上，12 000 r/min 離心2 min；將離心柱置于洗脫管上，加入100 μL無(wú)核酸酶水，12 000 r/min離心1 min；收集的RNA保存于-70 ℃。

1.5 cDNA的合成在微量反應(yīng)管中配制下列反應(yīng)混合液：Random 6mers 1.5 μL；dNTP Mixture 1.0 μL；模板RNA 6.0 μL；RNase Free dH2O 1.5 μL；65 ℃保溫5 min后，冰上迅速冷卻。在上述微量反應(yīng)管中再加入下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：5×PrimeScriptⅡ Buffer 4.0 μL；RNase Inhibitor 0.5 μL；PrimeScriptⅡ RTase 1.0 μL；RNase Free dH2O 4.5 μL，緩慢搖勻。按照以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：30 ℃ 10 min，45 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min，冰上冷卻。

1.6 PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化PCR反應(yīng)液的配制：PrimeSTAR Max Premix(2×) 25.0 μL；Primer1 1.2 μL；Primer2 1.2 μL；cDNA模板0.5 μL；滅菌蒸餾水 22.1 μL。PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：裂解溫度為98 ℃，裂解時(shí)間10 s，退火溫度分別采用53、55、57、59 ℃,退火時(shí)間均為5 s，延伸溫度均為72 ℃，延伸時(shí)間均為5 s。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照管，共35個(gè)循環(huán)。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察4個(gè)不同退火溫度條件下cDNA擴(kuò)增的效果。

1.7 從瓊脂糖凝膠中回收DNA把1%瓊脂糖凝膠放在切膠儀上，切除含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用吸濕紙吸干凝膠表面的液體；按照TaKaRa miniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0提供的操作方法提取DNA，于-20 ℃保存DNA。

1.8 劍河白香豬IL-18基因質(zhì)粒構(gòu)建在微量反應(yīng)管中配置下列溶液：pMD19-T Vector 1 μL，Insert DNA 0.15 pmol，滅菌水3 μL，加入5 μL Solution Ⅰ，16 ℃反應(yīng)30 min。將上述10 μL溶液加入至100 μL DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，放置冰中30 min；42 ℃加熱45 s后，再在放置冰中1 min；加入890 μL SOC培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min；在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上，形成單菌落。

1.9 重組質(zhì)粒DNA提取從L-瓊脂平板培養(yǎng)基上挑選單個(gè)白色菌落接種到3 mL含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h；取出3 mL培養(yǎng)菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清液；用250 μL Solution Ⅰ 懸浮細(xì)菌沉淀；加入250 μL SolutionⅡ 裂解細(xì)菌；加入350 μL SolutionⅢ，混勻，直至形成凝集塊，室溫12 000 r/min離心10 min，棄濾液；將上清液轉(zhuǎn)移至離心柱，12 000 r/min離心1 min；將500 μL的BufferWA加入離心柱，12 000 r/min離心30 s，棄濾液；將700 μL BufferWB加入離心柱，12 000 r/min離心30 s，棄濾液，再重復(fù)該步驟；將離心柱安置于收集管上，再離心，除盡殘留液體；將離心柱安置在1.5 mL離心管上，將50 μL Elution Buffer加到離心柱膜中央，靜置1 min，12 000 r/min離心1 min，洗脫DNA。

1.10 擴(kuò)增目的DNA用前面所述的引物，采用優(yōu)化的PCR法，從重組質(zhì)粒DNA中擴(kuò)增目的DNA片段，進(jìn)行凝膠電泳，收集目的DNA片段，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1IL-18核苷酸序列測(cè)定結(jié)果從劍河白香豬脾臟組織細(xì)胞提取總RNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄、PCR法、電泳，通過(guò)凝膠成像儀觀察檢測(cè)表明，退火溫度在55 ℃時(shí)，約在580 bp處出現(xiàn)明顯的基因條帶，而退火溫度在53、57、59 ℃時(shí)，在580 bp處無(wú)基因條帶，因此，適宜的退火溫度為55 ℃。

2.2IL-18基因質(zhì)粒構(gòu)建、序列測(cè)定分析劍河白香豬IL-18 DNA經(jīng)回收后，與pMD19-T Vector的外源基因插入位點(diǎn)連接，再轉(zhuǎn)化DH5a后，挑選單個(gè)白色菌落，在含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒DNA，再進(jìn)行PCR電泳，約在580 bp處出現(xiàn)特異條帶(圖1)。

注：M.DL 2000 DNA Maker；1.PCR產(chǎn)物;-.陰性

將純化的DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，報(bào)告的核苷酸序列全長(zhǎng)為579 bp，根據(jù)3個(gè)堿基編碼1個(gè)氨基酸原理，推導(dǎo)編碼192個(gè)氨基酸(圖2)。

注：_表示堿基變異位點(diǎn)

2.3IL-18核苷酸結(jié)構(gòu)序列同源性分析利用DNA Star軟件，將劍河白香豬與其他品種豬的IL-18基因進(jìn)行同源性分析。由表1可知，與榮昌豬IL-18核苷酸結(jié)構(gòu)序列[8]比較，同源性為99.1%，存在5個(gè)堿基的差異，分別是第15位堿基(ATG中的A 為1)A→G，第29位堿基T→A，第70位堿基T→C，第456位堿基T→C，第554位堿基T→A；與張麗[8]研究的內(nèi)江豬IL-18核苷酸結(jié)構(gòu)序列比較，同源性為99.5%，存在3個(gè)堿基差異，分別是第15位堿基A→G，第225位堿基T→C，第475位堿基T→C；與來(lái)自GenBank(登錄號(hào)分別是AF 191088、AY262109)的2個(gè)IL-18核苷酸結(jié)構(gòu)序列相比，同源性均為99.8%，存在1個(gè)堿基差異，均為第15位堿基A→G。從上述堿基變異的情況看，劍河白香豬與其他品種豬相比，雖然IL-18核苷酸同源性很高，但I(xiàn)L-18基因序列結(jié)構(gòu)均存在不同程度的差異；不同品種豬之間IL-18核苷酸序列差異可以通過(guò)核苷酸進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，圖3表明，進(jìn)化樹(shù)有2個(gè)主要分支，Jianhe白香豬與AF191088、AY262109、Neijiang豬處于同一個(gè)分支，關(guān)系相對(duì)親近，Rongchang豬則在另1個(gè)分支，與Jianhe白香豬關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖3 IL-18核苷酸進(jìn)化樹(shù)(×100)

2.4IL-18核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分析使用DNA Star分析軟件，將劍河白香豬與其他品種豬IL-18氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，與榮昌豬比較，同源性為98.4%，出現(xiàn)3個(gè)氨基酸變化，分別是第10位的異亮氨酸(I)變?yōu)樘於０?N)，第24位的苯丙氨酸(F)變?yōu)榱涟彼?L)，第185位的甲硫氨酸(M)變?yōu)橘嚢彼?K)；與內(nèi)江豬比較，同源性為99.5%，出現(xiàn)1個(gè)氨基酸變化，為第159位的苯丙氨酸(F)變?yōu)榱涟彼?L)；與來(lái)自GenBank的2個(gè)氨基酸序列比較，同源性均為100%，且無(wú)氨基酸變化。從分析可以看出，除了GenBank的2個(gè)序列無(wú)氨基酸變化外，其他2個(gè)品種豬的IL-18發(fā)生了氨基酸變化；同樣，可以通過(guò)氨基酸進(jìn)化樹(shù)分析不同品種豬之間IL-18氨基酸序列的差異，從圖4可以看出，Jianhe白香豬、AF191088、AY262109、Neijiang豬處在同1個(gè)分支，而Rongchang豬則在另1個(gè)分支，Jianhe白香豬與AF191088、AY262109、Neijiang豬關(guān)系相對(duì)親近，與Rongchang豬關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖4 IL-18氨基酸進(jìn)化樹(shù)(×100)

表1 不同來(lái)源豬IL-18核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列比較

3 討論

據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，IL-18主要由單核巨噬細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞等產(chǎn)生，能調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫細(xì)胞的功能，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子[9]，對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答及各種生理功能的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用；IL-18可增強(qiáng)輔助性T細(xì)胞1的細(xì)胞免疫應(yīng)答，在輔助性T細(xì)胞2的免疫反應(yīng)中也產(chǎn)生一定的作用；IL-18對(duì)細(xì)胞內(nèi)寄生的各種病原體具有較強(qiáng)的抑制作用。據(jù)報(bào)道，IL-18可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生大量IFN-γ，γ干擾素能激活主要組織相融復(fù)合體 Ⅰ 蛋白的表達(dá)，組織相融復(fù)合體 Ⅰ 蛋白抗原結(jié)合部位與結(jié)合抗原肽段一起供殺傷性T細(xì)胞識(shí)別,啟動(dòng)和限制免疫細(xì)胞的殺傷[10],IFN-γ可以控制B淋巴細(xì)胞分泌免疫球蛋白[11]，調(diào)節(jié)免疫抗體水平，因此，有望成為一種新的疫苗佐劑，在增強(qiáng)疫苗免疫效果上發(fā)揮更大作用。

該試驗(yàn)所研究的劍河白香豬IL-18核苷酸序列，與榮昌豬、內(nèi)江豬、AY262109、AF191088 4個(gè)品種相比較，同源性在99.1%～99.8%，存在個(gè)別甚至幾個(gè)堿基的替代，說(shuō)明堿基變異程度小，同一物種IL-18基因結(jié)構(gòu)高度保守；與榮昌豬、內(nèi)江豬、AY262109、AF191088豬的IL-18氨基酸序列比較，同源性在98.4%～100%，只有榮昌豬、內(nèi)江豬分別存在3、1個(gè)氨基酸變化，來(lái)自GenBank的2個(gè)品種的IL-18氨基酸無(wú)變化，說(shuō)明同一物種IL-18氨基酸序列結(jié)構(gòu)高度保守；另外，雖然IL-18氨基酸序列結(jié)構(gòu)高度保守，但仍有少數(shù)氨基酸變化，這種變化是否導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分結(jié)構(gòu)及功能的改變，這些問(wèn)題有待進(jìn)一步研究；正常情況下，豬體內(nèi)自然產(chǎn)生IL-18數(shù)量甚微，免疫調(diào)節(jié)效果欠理想。因此，要想得到大量有活性的IL-18，可以通過(guò)蛋白質(zhì)的表達(dá)方法獲得，該研究的劍河白香豬IL-18基因結(jié)構(gòu)為表達(dá)IL-18產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。