苗貴東，吳小梅，楊慧連，牛秋芳

(1.興義民族師范學(xué)院民族藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室,貴州興義 562400;2.貴州省化學(xué)合成及環(huán)境污染控制和修復(fù)技術(shù)特色重點實驗室,貴州興義 562400;3.興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，貴州興義 562400)

黑麥草(LoliumperenneL.)(2n=2x=14)是被子植物門單子葉植物綱禾本科黑麥草屬(Lolium)植物[1]。黑麥草種子狹長，4～6 mm,成熟后易脫落，千粒重1.5 g[2]。黑麥草的營養(yǎng)價值較高，營養(yǎng)成分富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素，其中粗蛋白含量較為豐富，品質(zhì)優(yōu)良，適口性好，因此為多種家畜所喜食，消化率70%左右[3]。由于其優(yōu)良的飼草性，因此篩選優(yōu)質(zhì)牧草品種對于山地資源利用和精準(zhǔn)扶貧有極大的推動作用，具有重要的實際應(yīng)用價值。

RAPD (random amplified polymorphic DNA)，即隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記,RAPD是建立在PCR (polymerase chain reaction)基礎(chǔ)之上的一種可對整個未知序列基因組進行多態(tài)性分析的分子技術(shù),是由美國的Williams等[4]和加利福尼亞研究所Welsh等[5]領(lǐng)導(dǎo)的2個研究小組于1990年同時提出的。目前該技術(shù)已大量應(yīng)用于系譜分析及進化關(guān)系等方面的研究。目前該標(biāo)記技術(shù)還應(yīng)用于多年生黑麥草的遺傳多樣性和品種資源研究[6-7]。RAPD分子以一些人工合成的不同隨機寡核苷酸序列(10 bp) 作為引物，對所研究的基因組DNA(模板DNA)在Taq聚合酶的催化下，以dNTP作為原料進行PCR酶促體外擴增反應(yīng)，從而產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，擴增的產(chǎn)物可以通過聚丙烯酞胺凝膠或者瓊脂凝膠電泳分離和溴化乙錠(EB)染色，在紫外燈下可檢測擴增DNA片段的多態(tài)性。RAPD標(biāo)記的特點為標(biāo)記數(shù)量多，可以覆蓋基因組中所有位點；引物通用，成本低；操作簡單；使用的模板DNA量極少；操作安全，試劑毒性小等[8]。筆者運用RAPD標(biāo)記技術(shù)對黔西南引種的黑麥草群體開展群體遺傳多樣性分析，通過篩選RAPD標(biāo)記引物、PCR體系優(yōu)化及群體擴增，評價引種群體遺傳多樣性，旨在為開展群體選擇及種質(zhì)資源評價研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況試驗用地塊設(shè)在貴州省興義市頂效鎮(zhèn)興義民族師范學(xué)院試驗基地，坐落于貴州省西南部，地處105°36′E，25°12′N，海拔1 270～1 480 m,具有亞熱帶季風(fēng)氣候特征，干旱，日照長，無霜期300 d左右，年均氣溫14～19 ℃。雨熱同季，降水量在1 300～1 600 mm。試驗地屬于沙質(zhì)土，土壤貧瘠。

1.2 試驗材料所選取的黑麥草品種來源于江蘇省，選取均勻一致、品質(zhì)良好的黑麥草種子。在試驗基地進行黑麥草種植，到可收割期后，按照隨機選取方法隨機選取24株樣本，組成試驗群體。

1.3 黑麥草種植選用優(yōu)質(zhì)黑麥草種子，綜合參照文獻的方法[9-13]，確定種植時間及播種方法[14]。2018年12月26日黑麥草高度35～68 cm時收割，采用隨機采樣法采集24個樣本植株，分別放入24個采樣袋中并依次標(biāo)記1～24個序號，采集完畢后將樣本材料放到-80 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?，黑麥草收割后的留茬高度約為5 cm，并追肥尿素，澆水灌溉，待其生長高度達到可收割的高度時即可進行再次收割。

1.4 試驗方法對通過PCR擴增的群體試驗結(jié)果采用群體遺傳的分析方法進行遺傳多樣性分析及群體聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑麥草基因組DNA的提取及檢測經(jīng)過查閱相關(guān)文獻[15-18]，提取黑麥草24個嫩葉中的基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測得到基因組DNA(圖1)。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～10. 黑麥草個體DNA

2.2 RAPD引物篩選經(jīng)過多次PCR條件優(yōu)化與引物PCR擴增篩選，35條RAPD引物中，最終有6個引物獲得較好擴增(C13、C02、D16、E03、A18、B05)。將這些引物用于后續(xù)群體擴增，在由24個個體組成的黑麥草群體中，6個引物擴增獲得的清晰可統(tǒng)計的RAPD擴增條帶共52條，部分引物擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳后在凝膠成像系統(tǒng)成像的結(jié)果見圖2。

注：M.DL 2000 Marker

2.3 RAPD-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化試驗材料為黑麥草DNA，選取51條RAPD引物進行篩選，依據(jù)文獻[19-22]，體系中10×buffer含量為2.5 μL，DNA模板為2.0 μL固定不變，對6個因子(dNTP、MgCl2、Taq酶、引物濃度、退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù))均設(shè)置不同濃度梯度(表1)。

表1 RAPD-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的各成分及濃度梯度

2.3.1最佳Mg2+濃度的確定。Mg2+濃度直接影響酶活性，從圖3可見，Mg2+濃度大于2.6 mmol/L或低于2.6 mmol/L時，條帶彌散。因此，選擇2.6 mmol/L Mg2+為最佳反應(yīng)水平。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～6. Mg2+濃度2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0 mmol/L

2.3.2最佳dNTP濃度的確定。dNTP是PCR反應(yīng)的原料之一，其量不能過多也不能過少，過少會使反應(yīng)不充分，而過多則會抑制Mg2+，最終影響聚合酶的活力。從圖4可見，0.55 mmol/L為最佳dNTP濃度。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～10. 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55 mmol/L dNTP

2.3.3最佳Taq酶濃度的確定。Taq酶的活性以及用量對擴增的結(jié)果影響很大，用量過少，則擴增出的條帶少或無擴增；用量過多，則擴增出的條帶彌散或者非特異性條帶增多。從圖5可見，Taq酶的用量以0.20 U效果最好。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～8. 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 U Taq酶

2.3.4最佳引物濃度的確定。從圖6可見，經(jīng)過多次分析和比較，引物濃度在0.40 mmol/L時條帶清晰且非特異性條帶極少。因此，最佳引物濃度為0.40 mmol/L。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～9. 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mmol/L

2.3.5最佳退火溫度的確定。退火溫度過低或者過高均會引起非特異性擴增的增多。從圖7可見，最終確定35 ℃為最佳退火溫度。

注：M:DL 2000 Marker；泳道1～8. 32、33、34、35、36、37、38、39 ℃

2.3.6最佳循環(huán)次數(shù)的確定。從圖8可以看出，40次循環(huán)次數(shù)產(chǎn)生的帶型最好，因此40次循環(huán)為最佳循環(huán)。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～7. 25、30、35、40、45、50、55個循環(huán)

2.3.7最優(yōu)反應(yīng)體系的確立。優(yōu)化后的PCR總反應(yīng)體系10×Buffer 2.50 μL，MgCl22.60 μL，dNTP 1.375 μL，DNA模板 2.00 μL，Primer 0.750 μL，Taq酶 0.750 μL，ddH2O 15.025 μL，總計25 μL。RAPD-PCR反應(yīng)程序見表2。

表2 PCR反應(yīng)程序

2.4 多樣性分析黑麥草RAPD引物在群體中擴增后經(jīng)過瓊脂糖電泳后在凝膠成像系統(tǒng)得到的部分結(jié)果見圖9。多態(tài)位點比率是指具有多態(tài)性的位點數(shù)占檢測到的位點數(shù)的比例，它是可以衡量一個種群內(nèi)遺傳變異水平高低的重要指標(biāo)，可用于分析黑麥草種內(nèi)之間遺傳變異率，針對多態(tài)性的分析結(jié)果見表3。由表3可知，6個引物共擴增出52條，其中具有多態(tài)性的條帶有49條，無多態(tài)性的條帶有3條，多態(tài)性條帶比率(PPB)為94.23%，這表明供試黑麥草群體的多態(tài)性高。

表3 引物序列與擴增結(jié)果

注：M.DL 2000 Marker

2.5 遺傳多樣性分析將篩選出的6個引物擴增條帶按照從小片段到大片段依次進行統(tǒng)計，有條帶的記1，沒有條帶的記0。統(tǒng)計好的數(shù)據(jù)通過NTsys軟件進行相似系數(shù)的計算和聚類分析，結(jié)果見圖10。試驗結(jié)果分析表明，引種黑麥草個體間遺傳差異較大，引種品種種群遺傳差異具備一定遺傳可選性。由聚類分析結(jié)果可以看出，24個個體聚為5個分支，遺傳差異較大，因此群體具有較高的遺傳多樣性，種群多樣性可為開展物種群組選育研究奠定基礎(chǔ)。

圖10 黑麥草24個個體的聚類分析樹狀圖

3 結(jié)論

通過PCR條件優(yōu)化，其中RAPD引物最終獲得的最優(yōu)反應(yīng)條件為：Mg2+濃度2.6 mmol/L,dNTP濃度為0.55 mmol/L，引物濃度為0.4 mmol/L,Taq酶濃度為0.20 U，最佳退火溫度35 ℃，最佳循環(huán)數(shù)為40個，最適模板含量約為100 ng DNA。

對24個黑麥草個體進行了遺傳多樣性分析，共篩選出6個效果較好的引物可用于PCR擴增，總共獲得RAPD標(biāo)記譜帶52條，其中有多態(tài)性條帶49條，多態(tài)性條帶百分率為94.23%，其多態(tài)性較高。引種黑麥草的遺傳差異較大，對貴州省黔西南州地區(qū)的環(huán)境適應(yīng)性較高，具備一定的可選育性。種群多樣性為開展品種群組選育和遺傳選育研究奠定重要的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，也為培育符合地方需求的品系奠定基礎(chǔ)。