■潘 瓊 王余磊 宋春蓮 卜仕金 舒相華*

（1.云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201；2.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009）

中獸藥是中國傳統(tǒng)獸醫(yī)學的重要組成部分，歷史悠久[1]。在“限抗”與病毒性疫病肆虐的雙重壓力下，中獸藥作為新興產業(yè)受到越來越多的重視，主要是因為中藥具有多方位調節(jié)和治療作用，可提高動物機體的免疫力和抗應激能力，中長期使用僅有低毒副作用，藥物殘留少，能促進生產性能發(fā)揮的同時滿足日益嚴格的食品安全需求[2]。

巖陀為虎耳草科鬼燈檠屬植物羽葉鬼燈檠（Rodgersia pinnata franch.）或西南鬼燈檠（Rodgersia sumbucifolia hemsl.）的干燥根莖[3]，用于治療骨折、風濕痛、消化不良等疾病[4]。黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[5]。已有研究表明巖陀黃酮對大鼠的免疫功能有促進作用[6]。黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）為唇形科植物黃芩的干燥根，黃芩多糖是黃芩黃酮提取過程中的副產物，比較容易獲得，具有抗腫瘤、調節(jié)血糖和血脂、抗氧化性、抑菌抗炎和調節(jié)免疫等作用[7]。本試驗通過急性經口毒性試驗、遺傳毒性試驗對巖陀黃酮和黃芩多糖復合物的毒性進行了初步研究，為巖陀黃酮和黃芩多糖聯(lián)用在中獸醫(yī)藥領域的應用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

清潔級健康Wistar 大鼠，體重180～200 g；ICR 小鼠雄性，體重18～20 g，均由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，試驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2017-0007，試驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0044。試驗期間大、小鼠自由采食和飲水。試驗前適應性飼養(yǎng)7 d，灌胃前12 h禁食不禁水。

1.1.2 受試藥物

巖陀黃酮與黃芩多糖復合物：巖陀粗黃酮含量為41.1%；黃芩粗多糖含量為40.3%，兩者按1∶1混合制成淡黃色粉末復合物，由云南農業(yè)大學中獸醫(yī)實驗室提供，4 ℃保存。

1.1.3 試驗菌株

細菌回復突變試驗（Ames text）選用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100 和TA102，由MOLTOX 公司提供。菌株儲存于-80 ℃。試驗菌于37 ℃水浴振蕩培養(yǎng)24 h，4 ℃保存。菌株均經過生物學鑒定合格后進行試驗。

1.1.4 試驗試劑

標準誘變劑：疊氮化鈉、2-乙酰氨基芴、敵克松、甲基磺酸甲酯均為分析純；環(huán)磷酰胺（20110703），山西普德藥業(yè)有限公司生產，國藥準字H14023686；多氯聯(lián)苯（20150404），山西普德藥業(yè)有限公司生產，國藥準字H14023686。

其他試劑：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基、1%羧甲基纖維素鈉、二甲基亞砜、1%伊紅染色液、氯化鉀、甲醇（分析純）、PBS緩沖溶液等。

1.1.5 試驗儀器

D98-9052B-2 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、Centrifuge 5415R 高速冷凍離心機、電熱恒溫水浴箱、菌落計數(shù)器、萬分之一電子天平、CX2型OLYMPUS顯微鏡及灌胃針頭等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠經口急性毒性試驗

試驗分組：2 個試驗組，分別選擇Wistar 大鼠雌、雄各10 只，雌雄分籠飼養(yǎng)。大鼠禁食12 h 后分別稱體重、編號。

染毒和觀察：在4 h內經口灌服巖陀黃酮與黃芩多糖復合物溶液數(shù)次進行染毒，染毒劑量達到9 g∕kg·BW。攻毒后分別在30 min、2 h、4 h進行觀察，之后每天觀察1 次，連續(xù)14 d。主要觀察大鼠采食飲水情況、有無中毒癥狀及毒性反應出現(xiàn)和消失的時間、中毒表現(xiàn)和死亡時間。14 d結束后處死存活大鼠，進行病理變化檢查。

1.2.2 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗

增菌培養(yǎng)及生物學特性鑒定：將冷凍保存的TA97、TA98、TA100 和TA102 菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃，100 r∕min 培養(yǎng)10 h。細菌濃度大于2×109CFU∕mL。試驗前采用鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗標準判斷法[8]進行菌株的生物學特性和自發(fā)回變菌落數(shù)的檢測，符合標準進行后續(xù)試驗。

大鼠肝微粒體酶的誘導和S9 的制備：150～200 g Wistar 大鼠3 只，采用多氯聯(lián)苯作為誘導劑，按500 mg∕kg·BW劑量腹腔注射后第5天脫頸處死，處死前12 h 禁食。無菌操作取出肝臟，除去結締組織，預冷無菌0.15 mol∕L 氯化鉀溶液潤洗肝臟后，每克肝臟加入0.15 mol∕L 氯化鉀溶液3 mL。冰浴勻漿后4 ℃，9 000 g 離心10 min，取上清液分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?，即為S9。

陽性對照設定：（+S9 組別）TA97、TA98、TA100、TA102菌株陽性對照均為2-乙酰氨基芴（2-AF）；（-S9組）TA97、TA98 菌株為5 mg∕mL 敵克松，TA100 菌株為疊氮鈉，TA102菌株為甲基磺酸甲酯。

受試藥物的配制：采用平板摻入法。準確稱取受試藥物1.000 g，高壓滅菌后加無菌二甲基亞砜（DMSO）配制為濃度100 mg∕mL 的母液，取適量分別稀釋為10.000、2.000、0.400、0.080、0.016 mg∕皿。

試驗步驟：取2 mL 45 ℃水浴保溫的頂層培養(yǎng)基，依次加入受試藥物溶液0.1 mL，測試菌液0.1 mL（+S9 組同時加入10% S9 混合液0.5 mL），迅速混勻，倒在底層培養(yǎng)基上，輕柔晃動使頂層培養(yǎng)基均勻分布，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察結果，每組8個重復。若第一次平板摻入法結果為陰性，重復一次試驗；若第一次平板摻入法結果為陽性，重復兩次試驗。

1.2.3 小鼠精子畸形試驗

動物分組及染毒：將50 只雄性小鼠隨機均分為高（2 500 mg∕kg·BW）、中（1 250 mg∕kg·BW）、低（625 mg∕kg·BW）復合物劑量組、陽性對照組（環(huán)磷酰胺40 mg∕kg·BW）和陰性對照組（純化水），5 個處理組。使用1%羧甲基纖維素鈉對復合物和環(huán)磷酰胺進行梯度稀釋，按相同體積不同劑量進行灌胃，陰性對照給予相同體積純化水。連續(xù)染毒5 d，第35天取材[9]。

染毒后取材：脫頸法處死小鼠，取出兩側副睪，在無菌PBS中用眼科剪將副睪縱向剪2刀，靜止3 min，輕輕搖動，用4層擦鏡紙過濾去除組織碎片，吸濾液至載玻片涂片，自然風干后用甲醇固定10 min，待干燥后用1%伊紅染色1 h，以常水沖洗干凈，自然風干后鏡檢[10]。

1.2.4 小鼠骨髓細胞微核試驗

分組：50只小鼠隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。復合藥物組設高、中、低三個劑量組，即2 500 mg∕kg·BW、1 250 mg∕kg·BW、625mg∕kg·BW，陽性對照組（環(huán)磷酰胺）和陰性對照組（1%羧甲基纖維素鈉）。

染毒[11]：1%羧甲基纖維素鈉梯度稀釋受試復合物，按不同濃度、相同體積灌胃，現(xiàn)用現(xiàn)配。陽性對照按0.01 mL∕g·BW 腹腔注射環(huán)磷酰胺，陰性對照按0.01 mL∕g·BW口服1%羧甲基纖維素鈉。30 h內給藥兩次，每次給藥間隔24 h，第36 h取胸骨骨髓進行制片。

觀察：每只小鼠制2 張片，雙盲法在油鏡下選擇細胞分散好、形態(tài)完整及染色良好的部位，進行計數(shù)。計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞（PCE）含微核嗜多染紅細胞數(shù)（MN）及成熟紅細胞（RBC）數(shù)，求出PCE∕RBC、MN∕PCE[12]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用GraphPad Prism 8.0.1軟件進行分析統(tǒng)計。

鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗：菌株回變菌落數(shù)表述為“（）∕皿”，受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對照組的2 倍以上，且具有劑量反應關系的判為陽性，達不到2倍以上則判定為合格。

小鼠精子畸形試驗精子畸形率按X2檢驗（α=0.05）作統(tǒng)計學處理，評價精子畸形陽性的標準為畸形率至少為陰性對照組的倍量或經統(tǒng)計有顯著意義，并有劑量反應關系。

精子畸形率（%）=[畸形精子數(shù)∕（正常精子檢測數(shù)+畸形精子數(shù)）×100

小鼠骨髓細胞微核試驗：每一試驗動物作為一個觀察組，每一組動物雌雄合并計算該組微核數(shù)的均值，如一組動物內雌雄之間微核有明顯的性別差異時，則分別計算。分析測試結果用“”表示，微核發(fā)生率按X2檢驗（α=0.05）作統(tǒng)計學處理。

2 結果與分析

2.1 大鼠經口急性毒性試驗（見表1）

由表1可知，觀察期內所有大鼠臨床表現(xiàn)正常，無明顯神經癥狀，皮膚和被毛無異常，且采食、飲水和排便等正常，未表現(xiàn)中毒反應，第15天所有大鼠均存活。試驗結束后剖檢20只大鼠，眼觀病理學檢查均未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化。結果表明，巖陀黃酮與黃芩多糖復合物對大鼠的經口染毒半致死量（LD50）大于5 g∕kg·BW，依據(jù)國標GB 15193.3—2014劑量分類表，屬于實際無毒。

表1 大鼠急性毒性試驗結果

2.2 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗[13]（見表2）

由表2可知，兩次鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果基本一致。巖陀黃酮與黃芩多糖復合物每皿劑量在10～0.016 mg范圍內，4種試驗用鼠傷寒沙門氏菌株菌苔生長正常，各菌株反應均為合格；有或無代謝活化系統(tǒng)（S9）時，每皿平均回變菌落數(shù)與陽性誘變劑組比較差異顯著，與對照（DMSO）比較無統(tǒng)計學意義，未見劑量反應關系，結果為合格。

表2 巖陀黃酮與黃芩多糖復合物的鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果（）

表2 巖陀黃酮與黃芩多糖復合物的鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果（）

項目第1次第2次組別(mg∕皿)10.000 2.000 0.400 0.080 0.016 DMSO陽性10.000 2.000 0.400 0.080 0.016 DMSO陽性TA97-S9 109.67±13.58 116.33±32.93 130.67±39.80 104.67±18.18 105.67±15.57 125.00±28.58 2 121.67±59.48**102.00±7.81 125.67±36.00 106.00±26.00 131.67±37.11 106.33±14.01 106.00±10.82 2 039.67±37.55**敵克松（50 μg）+S9 148.67±19.14 115.67±13.43 118.67±15.04 165.00±25.98 147.00±10.00 117.33±33.47 1 329.33±171.16**134.67±41.67 145.00±40.63 105.67±15.04 120.00±38.57 119.00±8.72 125.00±29.14 1 280.33±31.90**2-AF（10 μg）TA98-S9 40.00±9.17 42.00±7.55 40.00±8.89 42.67±8.39 37.67±6.66 40.00±7.00 1 074.67±33.01**44.00±7.21 39.00±3.00 42.67±11.02 35.00±6.25 44.33±4.04 37.33±3.06 1 125.67±139.89**敵克松（50 μg）+S9 43.00±2.65 34.00±2.65 41.33±10.02 33.67±4.04 43.67±7.77 38.33±7.37 5 101.33±119.78**38.00±6.93 31.67±1.53 45.00±5.57 37.67±7.51 37.00±9.54 40.00±8.54 5 036.67±187.03**2-AF（10 μg）

結果表明：受試藥物對TA97、TA98、TA100 和TA102 四種試驗用鼠傷寒沙門氏菌株在加S9 和不加S9試驗中結果均為陰性，可見本試驗條件下巖陀黃酮與黃芩多糖復合物對鼠傷寒沙門氏菌無致突變性。

2.3 小鼠精子畸形試驗（見表3）

由表3 可知，巖陀黃酮與黃芩多糖復合物3 個劑量組的精子畸形率經統(tǒng)計學處理與陰性對照組比較差異不顯著性（P＞0.05），陽性對照組與3 個給藥劑量組、陰性對照組比較差異均極顯著（P＜0.01）。巖陀黃酮與黃芩多糖復合物致小鼠精子畸形試驗結果為陰性，可判斷該復合物不具有生殖遺傳毒性。

表3 巖陀黃酮與黃芩多糖復合物對小鼠精子畸形發(fā)生率影響(n=10）

2.4 小鼠骨髓細胞微核試驗分析（見表4）

表2（續(xù)） 巖陀黃酮與黃芩多糖復合物的鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果（）

表2（續(xù)） 巖陀黃酮與黃芩多糖復合物的鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果（）

注：“**”表示各試驗組與陽性對照組比較P＜0.01，差異極顯著。

項目第1次第2次組別(mg∕皿)10.000 2.000 0.400 0.080 0.016 DMSO陽性10.000 2.000 0.400 0.080 0.016 DMSO陽性TA100-S9 121.33±2.31 140.33±34.36 131.33±7.51 122.67±3.79 147.33±35.73 144.67±35.22 2 657.67±82.28**162.33±27.61 145.33±30.83 125.67±6.03 172.67±14.74 168.33±41.93 162.00±24.98 2 652.00±189.90**疊氮鈉（1.5 μg）+S9 177.00±21.70 149.67±5.86 166.33±16.92 162.00±11.14 151.00±26.51 177.33±7.37 2 579.33±98.72**158.33±30.66 150.00±34.66 167.00±32.51 147.67±14.98 161.00±34.22 163.67±36.00 2 678.00±23.52**2-AF（10 μg）TA102-S9 258.67±20.13 276.00±34.18 277.67±38.73 285.00±37.80 277.33±9.45 264.33±16.01 5 540.00±84.93**264.33±18.88 286.33±16.50 263.33±19.43 266.67±23.09 283.00±16.09 273.33±23.18 5 594.00±17.52**甲基磺酸甲酯（1.0 μL）+S9 270.00±30.27 281.33±17.62 275.33±32.62 303.33±20.82 244.67±2.31 270.33±26.51 551.33±44.38**278.67±22.05 275.00±28.58 261.00±30.51 260.67±9.02 265.00±22.65 273.00±7.00 557.33±21.73**2-AF（10 μg）

由表4可知，巖陀黃酮與黃芩多糖復合物高、中、低三個劑量組致小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率與陰性對照組相比，差異無顯著性（P＞0.05），與陽性對照組相比差異有顯著性（P＜0.01），可判斷巖陀黃酮與黃芩多糖復合物不具有遺傳毒性。

表4 巖陀黃酮與黃芩多糖復合物對動物骨髓嗜多染紅細胞微核發(fā)生率（n=10）

3 討論

中獸藥是我國傳統(tǒng)獸醫(yī)學重要組成部分，被廣泛應用于預防和治療畜禽疾病、促進動物生長、提高飼料報酬。巖陀富含黃酮類成分，可通過乙醇提取。研究表明巖陀乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌等多種細菌有良好抑制效果[13-14]；巖陀乙醇浸膏在抑制病毒試驗中不僅能抑滅DNA 病毒，而且能抑制RNA病毒[15]；巖陀黃酮在大鼠試驗中能夠顯著緩解由環(huán)磷酰胺導致的免疫抑制情況[6]。黃芩多糖是提取黃芩苷的副產物，比較容易獲得[16]。黃芩多糖具有抗氧化、抗炎活性，飼料中添加一定比例的黃芩多糖能夠顯著提升肉仔雞的體重、降低料重比、提高仔雞生長性能，還能提高仔雞免疫功能[17]。中藥的聯(lián)用可以提高藥效并提升動物綜合免疫力。劉偉等[18]研究表明益母草、野菊花復方水煎液的降壓作用比單方水煎液降壓作用明顯。張雪等[19]研究表明燈盞花黃酮和馬蹄香多糖復合物可刺激仔豬淋巴細胞增殖，調節(jié)免疫抑制大鼠的免疫功能。所以本試驗認為巖陀黃酮和黃芩多糖提取復合物具有獸藥開發(fā)利用價值。

前人對巖陀黃酮和黃芩多糖的功效研究已經非常深入，但缺乏巖陀黃酮和黃芩多糖提取復合物的安全性研究。為了確定在飼料中添加藥用植物產品的安全性，必須利用各種試驗模型進行系統(tǒng)的毒理學研究，以預測其毒性，并為選擇動物安全劑量設定標準。

急性毒性試驗主要測定LD50，觀察急性中毒表現(xiàn)并初步估計試驗藥物對人類或動物的危害性。鄢鵬飛等[20]通過急性毒性試驗確定富硒油菜粉LD50為11.75 g∕kg·BW，確定其為實際無毒物質。本試驗通過巖陀黃酮與黃芩多糖復合物LD50大于10 g∕kg·BW，判定其為實際無毒物質，但未確定實際LD50，應在急性毒性試驗中設置不同濃度，為巖陀黃酮與黃芩多糖復合物的安全劑量范圍提供有效參考數(shù)據(jù)。

細菌回復突變試驗用于鑒定可產生基因損傷導致基因突變的物質，其敏感性、特異性、準確性較高[21]；精子畸形試驗可識別誘發(fā)精子致病功能障礙的化學物質，靈敏可靠；微核試驗可檢測到誘變物質改變細胞分裂過程中染色體的分布[22]?；貜屯蛔冊囼?、小鼠骨髓細胞微核試驗和精子畸形試驗結果陰性，表明巖陀黃酮與黃芩多糖復合物在本試驗條件下無遺傳毒性。

4 結論

在本試驗條件下，巖陀黃酮與黃芩多糖復合物屬實際無毒物質，在2 500 mg∕kg·BW 內試驗動物未出現(xiàn)急性毒性和遺傳毒性反應，可初步推斷中藥巖陀黃酮與黃芩多糖復合物在2 500 mg∕kg·BW范圍內作為中獸藥安全性較好。