徐佳杰,張 妮,,謝周云,徐伊漪,唐 力,夏靜芬,楊國靖,*

好氧顆粒污泥耐受PFOS的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及微生物響應(yīng)

徐佳杰1,張 妮1,2,謝周云1,徐伊漪2,唐 力1,夏靜芬1,楊國靖1,2*

(1.浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院,浙江 寧波 315100；2.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410082)

以好氧顆粒污泥為接種污泥,通過全氟辛烷磺酸(PFOS)長期馴化實(shí)現(xiàn)耐PFOS顆粒的培養(yǎng),考察不同馴化時期的污泥基本特性,并結(jié)合微生物群落演替過程、微生物表型分布以及功能途徑的變化情況,以揭示其耐受機(jī)制.結(jié)果表明,好氧顆粒污泥經(jīng)歷解體、再形成和成熟3個階段后可在PFOS暴露下穩(wěn)定維持.馴化成熟后的好氧顆粒污泥表面絲狀菌減少,并且被大量胞外聚合物(EPS)所包裹,結(jié)構(gòu)更加致密.馴化期間顆粒污泥中存在大量抗性細(xì)菌以及維持顆粒穩(wěn)定相關(guān)細(xì)菌,主要包括unclassified、、、、、、、、和A4b,且部分菌屬間存在顯著的正相關(guān)性.群體感應(yīng)途徑和細(xì)菌趨化途徑相關(guān)基因豐度在解體期上調(diào),在顆粒形成和成熟期恢復(fù)至初始水平,說明細(xì)菌的群體感應(yīng)效應(yīng)和趨化性能夠在顆粒應(yīng)激過程中起重要作用.因此,好氧顆粒污泥可以通過特定菌群積極響應(yīng)、促進(jìn)細(xì)菌趨化作用和群體感應(yīng)作用、提高EPS分泌量、增強(qiáng)系統(tǒng)抗氧化脅迫能力等多種方式耐受PFOS.采用菌膠團(tuán)型好氧顆粒污泥以及向好氧顆粒污泥系統(tǒng)中投加上述菌劑或添加信號分子有利于處理含PFOS廢水.

全氟辛烷磺酸；好氧顆粒污泥；馴化；微生物群落；耐受

近幾十年來,全氟辛烷磺酸(PFOS)成為污水處理廠中普遍存在的一種新興持久性有機(jī)污染物[1].據(jù)報(bào)道,中國市政污水處理廠進(jìn)水中的PFOS水平為1.8～176.0ng/L[2],工業(yè)廢水處理廠進(jìn)水中的PFOS濃度則達(dá)到了5.0mg/L以上[3],當(dāng)下越來越多的污水處理廠傾向于將生活污水和工業(yè)廢水進(jìn)行混合處理.由于PFOS的生物蓄積性,污泥中的PFOS濃度可高達(dá)5383ng/g(干重)[4].好氧顆粒污泥是微生物在好氧條件下相互作用形成的生物聚合體,具有優(yōu)良的沉降性能以及生物活性,是一種極具潛力的生物處理技術(shù)[5].PFOS能夠與生物分子相互作用并產(chǎn)生生物毒性,如誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激,增加其膜損傷和遺傳損傷等[6],PFOS的長期濃集必然會對好氧顆粒污泥微生物乃至整個污泥系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行產(chǎn)生不利影響.

馴化是強(qiáng)化污泥耐受能力的一種主要方式.相關(guān)研究表明,鹽度、低溫、酸性等條件的馴化均能使污泥產(chǎn)生耐性從而維持較好的性能[7-9].迄今PFOS馴化下的好氧顆粒污泥研究較少.微生物群落調(diào)控著好氧顆粒污泥的形成、發(fā)育、功能及其穩(wěn)定性.例如,絲狀菌的過度增殖容易引起顆粒強(qiáng)度下降乃至解體;介導(dǎo)群體淬滅細(xì)菌的生長則會導(dǎo)致群體感應(yīng)活性下降,影響胞外聚合物以及ATP的合成代謝,進(jìn)而影響顆粒污泥的穩(wěn)定性[10].微生物16S rRNA基因測序可以較為準(zhǔn)確的提供好氧顆粒污泥群落的完整圖像,是研究微生物多樣性及功能的主要方法.目前的研究往往只關(guān)注PFOS對微生物氮代謝的影響而不是其耐性行為[11-12].

本研究以好氧顆粒污泥為對象,采用PFOS長期脅迫的方式定向馴化耐PFOS的好氧顆粒污泥.考察不同濃度PFOS馴化期間好氧顆粒污泥特性的變化情況,并采用高通量測序技術(shù),探討PFOS馴化過程中污泥微生物群落的演替過程,從分子生物學(xué)角度揭示好氧顆粒污泥對PFOS的耐受機(jī)制,提供PFOS廢水處理過程中優(yōu)化顆粒穩(wěn)定性的調(diào)控策略,以期為未來處理含PFOS廢水提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 合成廢水

合成廢水中進(jìn)水組成如表1所示,其中CH3COONa·3H2O、NH4Cl和KH2PO4分別作為微生物所需碳源、氮源和磷源,添加NaHCO3用于調(diào)整廢水pH值.

表1 合成廢水組成

1.2 接種污泥及裝置運(yùn)行

試驗(yàn)在3個內(nèi)徑為140mm、高為1100mm、有效容積為13L的序批式反應(yīng)器中進(jìn)行(對照組不添加PFOS,試驗(yàn)組分別添加0.1,0.5mg/L PFOS).接種好氧顆粒污泥由本課題組實(shí)驗(yàn)室培育,各反應(yīng)器初始污泥濃度(MLVSS)為7500mg/L左右,污泥體積指數(shù)(SVI)約30mL/g.反應(yīng)器在室溫環(huán)境(21±1)℃下以厭/好氧模式每天運(yùn)行3周期,具體運(yùn)行方式為:進(jìn)水5min、厭氧120min、好氧240min、沉降5min、出水5min、閑置45min.其中厭氧階段采用機(jī)械攪拌實(shí)現(xiàn),好氧階段控制溶解氧在4～5mg/L,出水體積交換比為60%,水力停留時間約360min.采集對照組及PFOS馴化50,150,350d后的好氧顆粒污泥,進(jìn)行外觀和微觀結(jié)構(gòu)分析、EPS含量測定以及高通量測序.樣品編號如下:A(對照組)、B和C(0.1,0.5mg/L PFOS馴化50d)、D和E(0.1,0.5mg/L PFOS馴化150d)、F和G(0.1,0.5mg/L PFOS馴化350d).

1.3 污泥特性檢測

分別利用相機(jī)和掃描電鏡(Hitachi S-4800,日本)對好氧顆粒污泥進(jìn)行外觀和微觀結(jié)構(gòu)分析.EPS采用改進(jìn)的熱提取法提取[13],EPS中蛋白質(zhì)(PN)含量采用改良型BCA試劑盒測定,多糖(PS)含量采用苯酚-硫酸法測定,EPS含量為PN和PS含量之和.

1.4 污泥樣品采集及微生物多樣性分析

取約2mL好氧顆粒污泥樣品,置于15mL無菌離心管中,在-80℃下保存至DNA提取.使用淤泥基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)對采集的污泥樣本DNA進(jìn)行提取,在后續(xù)分析前于-20℃保存.對細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物選取為:338F(5’-ACTCCTACGGGAGGC- AGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTC- TAAT-3’);PCR反應(yīng)參數(shù)為:95℃預(yù)變性3min,95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,循環(huán)數(shù)30,72℃后保溫10min,于10℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物;配制2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,當(dāng)PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確,濃度合適,可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).委托上海美吉生物科技有限公司,使用Illumina MiSeq系統(tǒng)進(jìn)行高通量測序.通過FLASH、Fastp對所測序列進(jìn)行優(yōu)化,然后按97%相似度劃分操作分類單元(OTU),并使用SILVA數(shù)據(jù)庫對OTU代表序列進(jìn)行注釋,最后采用BugBase和PICRUSt對微生物表型及基因功能預(yù)測.

2 結(jié)果與討論

2.1 顆粒馴化期間的污泥基本特性分析

由圖1a～圖1i可見,在PFOS馴化至50d時,大部分好氧顆粒污泥處于解體狀態(tài),小顆粒及絮體在系統(tǒng)中占據(jù)主導(dǎo)地位(粒徑由對照組的2～5mm縮減至0.5mm以下),導(dǎo)致混合液水體渾濁;當(dāng)馴化至150d時,系統(tǒng)內(nèi)已產(chǎn)生顆粒晶核,表明污泥再次顆?；?粒徑主要分布在0.5～1.5mm),但由于此時顆粒粒徑較小、致密性較低,仍會出現(xiàn)粘連現(xiàn)象,因此泥水分離效果不理想;將馴化時間繼續(xù)延長至350d時,好氧顆粒污泥結(jié)構(gòu)基本達(dá)到穩(wěn)定,粒徑不再增加(此時粒徑分布在1～3mm,較對照組減小),且顆粒外部輪廓清晰,泥水分離現(xiàn)象明顯.因此,根據(jù)不同時間顆粒形態(tài)的差異,將整個馴化過程依次分為解體期(0～50d)、形成期(51～150d)和成熟期(151～350d)3個階段.

從圖1j可以看出,對照組好氧顆粒污泥表面生物相豐富,外部主要由絲狀細(xì)菌包裹,且絲狀菌骨架上附著生長著大量球狀和桿狀微生物.然而經(jīng)PFOS馴化之后,顆粒原有結(jié)構(gòu)遭到破壞并發(fā)生重塑.由圖1k和圖1l可見,馴化成熟后的好氧顆粒污泥表面被膜狀物質(zhì)覆蓋,并粘連球狀和桿狀細(xì)菌.同時研究過程中發(fā)現(xiàn),好氧顆粒污泥對0.1,0.5mg/L PFOS的去除率在70%以上,質(zhì)量平衡分析表明該過程主要以吸附為主而非微生物代謝,吸附的PFOS則能夠誘使微生物產(chǎn)生應(yīng)激行為.據(jù)此推斷,該膜狀物可能由PFOS刺激微生物分泌EPS所致.從圖1m中可以看出,EPS分泌量在顆粒形成期上升最為顯著,最高可達(dá)到(740.31±10.63)mg/g VSS,顆粒成熟后EPS含量下降至(458.62±5.16)～(528.37±4.49)mg/g VSS,但仍顯著高于對照組的(269.12±3.68)mg/g VSS.EPS中含有大量羥基、羧基等帶電官能團(tuán)以及疏水官能團(tuán),這些官能團(tuán)能夠減少細(xì)胞間的排斥力,使得EPS成為一種極好的聚合物,對于細(xì)菌的附著和顆粒的形成必不可少,可見EPS的大量分泌是PFOS馴化過程中污泥再次顆?；闹匾疤醄14-15].

好氧顆粒污泥在污水處理中的風(fēng)險(xiǎn)往往來源于其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性,通過掃描電鏡(SEM)分析可知,PFOS暴露下絲狀菌減少可能是導(dǎo)致顆粒失穩(wěn)的關(guān)鍵因素.但經(jīng)PFOS長期馴化后的好氧顆粒污泥EPS含量顯著增加,同時粒徑減小,表明其結(jié)構(gòu)更加密實(shí),更易于抵抗環(huán)境沖擊.陳穎等[16]根據(jù)顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)組成的差異性將其劃分為絲狀菌型、菌膠團(tuán)型以及綜合型好氧顆粒污泥.因此綜合分析認(rèn)為,采用菌膠團(tuán)型好氧顆粒污泥能夠減少污泥解體的風(fēng)險(xiǎn),更適用于處理含PFOS廢水.

2.2 不同馴化時期的微生物多樣性分析

表2 Alpha多樣性指數(shù)表

按97%相似性對各污泥樣品有效序列進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì),共獲得OTU數(shù)1243個,分屬于31個門和442個屬.在OTU水平上對各樣本的Alpha多樣性進(jìn)行比較,結(jié)果如表2所示.其中各樣本文庫的覆蓋率均高于0.994,這可以代表樣本測序數(shù)據(jù)的充分性和真實(shí)性.根據(jù)污泥樣品序列豐度,對樣品OTU多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)以及豐富度指數(shù)(Ace、Chao)進(jìn)行計(jì)算可知,不同馴化階段好氧顆粒污泥微生物的多樣性和豐富度存在一定差異.但總體而言,相比對照組A樣品,0.1,0.5mg/L PFOS馴化后的群落多樣性和豐富度隨馴化時間延長均呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢,表明PFOS馴化初期好氧顆粒污泥內(nèi)部微生態(tài)失穩(wěn).這主要是由于PFOS能夠破壞細(xì)菌的氧化平衡體系,無法適應(yīng)PFOS壓力的生物體往往處于死亡或進(jìn)入休眠狀態(tài).而PFOS馴化后期多樣性和豐富度上升主要是由于抗性物種的富集,并且好氧顆粒污泥逐漸成熟,能夠營造相對更加穩(wěn)固的環(huán)境供菌群生長.

2.3 不同馴化時期的微生物群落差異分析

為揭示PFOS長期馴化下好氧顆粒污泥微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的差異變化,通過Venn圖考察OTU在各樣品中的分布特征,并將各樣品在OTU水平上進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA).

對各組樣品的獨(dú)特OTU以及組間樣品的重疊OTU進(jìn)行Venn圖可視化分析發(fā)現(xiàn)(圖2a),7個樣品間的OTU種類存在顯著差異,獨(dú)有OTU由對照組的306降至40以下,共有OTU數(shù)僅為113個,約占總數(shù)的9.09%,相似度較低,表明大部分微生物難以適應(yīng)PFOS環(huán)境.通過將不同濃度PFOS馴化50,150,350d的污泥樣品分別與對照組進(jìn)行Venn分析,進(jìn)而得出OTU在不同馴化時間下的重疊狀況.對照組樣品中共檢測到OTU 908個,在0.1,0.5mg/L PFOS馴化50d后,OTU數(shù)量分別降至372和529個,且對照組與試驗(yàn)組共有物種僅為262.當(dāng)PFOS馴化至150d時,試驗(yàn)組OTU分別為391和410,對照組與試驗(yàn)組共有物種從262降至246,相較50d變化較小.而350d時,其共有OTU數(shù)仍為246個,且重疊及特有部分變化不顯著,這表明隨著馴化時間延長,存留的微生物已逐漸適應(yīng)PFOS的毒性作用.

圖2 基于維恩圖(a)和PCoA(b)的好氧顆粒污泥微生物群落差異分析

由圖2b可見,第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的差異解釋率分別為48.18%和29.58%.整體上,對照組與PFOS試驗(yàn)組樣品點(diǎn)分布較為離散,空間距離較大,表明PFOS的投加使細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化.然而B和C、D和E、F和G樣品傾向于各自聚為一類,表明0.1,0.5mg/L PFOS在相同馴化時間下的細(xì)菌群落具有很強(qiáng)的相似性,但不同時間樣品在空間上呈現(xiàn)出顯著的分異特征,這說明馴化時間對微生物菌群結(jié)構(gòu)同樣有著較為直接的影響,使得微生物種類發(fā)生了較大差異,同時這也意味著不同馴化時期所起耐受作用的微生物種類可能不同.這主要是受污泥解體后外界環(huán)境的影響以及顆粒在形成和成熟過程中內(nèi)環(huán)境變化,微生物種群之間產(chǎn)生競爭造成的.

2.4 顆粒馴化過程中的優(yōu)勢群落組成及演替

如圖3a和圖3b所示,度和加權(quán)度排序越靠前的微生物,其位置越靠近網(wǎng)絡(luò)圖的中心,共現(xiàn)性和魯棒性越好.Proteobacteria、Bacteroidota、Chloroflexi度和加權(quán)度最高,為PFOS馴化期間主要的微生物菌門.有96類菌屬共同存在于7個樣品中,其中加權(quán)度最高的10種菌屬分別為、、、OLB12、unclassified、、A4b、、env.OPS_17和,表明這些菌屬在PFOS賦存環(huán)境下具有較好的生存能力.

為了繼續(xù)尋找各樣品之間優(yōu)勢物種的差異,分別對各系統(tǒng)不同馴化時期門、屬水平上總豐度前5和前10的物種進(jìn)行篩選.由于PCoA結(jié)果顯示,在相同時間下,各濃度PFOS馴化的好氧顆粒污泥微生物群落組成相似.因此,將空白樣品分別與不同時期0.1,0.5mg/L PFOS馴化后的污泥樣品進(jìn)行比較,生成三元相圖.由圖3c可見,PFOS馴化期間Proteobacteria始終維持在一個較高的比例,但在0.1mg/L PFOS馴化50d后,Bacteroidota和Chloroflexi相對比例由對照組的77.88%和71.71%顯著下降至10.74%和10.78%.當(dāng)馴化至150,350d時,Bacteroidota再次富集,Chloroflexi相對比例雖有所上升,但仍低于對照組.由圖3d可見,、、unclassified在0.1,0.5mg/L PFOS馴化50d時有著較大程度的富集,、、相比對照組也有一定增長;但在150d時,、、、、逐漸成長為優(yōu)勢菌屬,相對比例相比50d下降顯著,但仍稍高于對照組;當(dāng)PFOS繼續(xù)馴化至350d,即好氧顆粒污泥成熟時,依舊維持著較高的相對比例,但系統(tǒng)中也富集了新的優(yōu)勢菌屬,主要包括、NS9group和OLB12.

從圖3e可以看出,在門水平上,不同程度PFOS污染下好氧顆粒污泥群落組成基本相似,但在相對豐度上表現(xiàn)出差異性.馴化后的好氧顆粒污泥仍以Proteobacteria、Bacteroidota和Chloroflexi為主,三者的總豐度在各樣品內(nèi)始終維持在80%以上.其中對照組內(nèi)三者的關(guān)系表現(xiàn)為Proteobacteria (43.05%)>Chloroflexi(32.09%)>Bacteroidota(10.82%),在成熟的好氧顆粒污泥中則演變?yōu)镻roteobacteria (34.91%～35.66%)>Bacteroidota(26.61%～30.80%)>Chloroflexi(18.18%～21.37%),可見Chloroflexi中的部分菌屬對PFOS的耐受性較低.Chloroflexi門內(nèi)細(xì)菌多為絲狀菌,主要起骨架和載體作用[17-18],這也與前述SEM中絲狀菌減少引起顆粒解體的結(jié)論一致.然而,屬水平上的微生物群落組成在不同馴化時期發(fā)生重塑(圖3f).和unclassified初始豐度分別為2.24%和0.58%,在顆粒解體后快速增至22.18%和27.09%,但在顆粒重構(gòu)過程中逐漸下降至初始水平.、、和相對豐度呈現(xiàn)同樣的變化趨勢.、、、、在顆粒解體期相對豐度基本接近于0,但在形成期快速上升.其中、被認(rèn)為與EPS分泌相關(guān)[19-21],也被認(rèn)為是菌膠團(tuán)形成菌[22].當(dāng)馴化至350d時,這些菌屬豐度又下降至較低水平,這與EPS含量先上升后下降的現(xiàn)象相呼應(yīng).NS9group和則是顆粒污泥在成熟過程中逐漸富集的優(yōu)勢細(xì)菌,、A4b也在顆粒成熟期恢復(fù)至初始水平.再一次證明不同時期起維持顆粒穩(wěn)定作用的微生物是不同的.

圖3 不同馴化時期門和屬水平下微生物種群共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析(a,b)、優(yōu)勢物種分析(c,d)以及微生物群落演替分析(e,f)

Fig.3 The co-occurrence network analysis (a, b), dominant species analysis (c, d), and microbial community succession analysis (e, f) at phylum and genus levels in different domestication periods

2.5 PFOS賦存環(huán)境下的微生物群落間相互作用

通過Spearman相關(guān)性分析(圖4)可知,PFOS賦存環(huán)境下菌屬間的正相關(guān)關(guān)系比例約占50%.其中unclassified、、、、之間呈顯著正相關(guān)(<0.05). unclassified被報(bào)道能夠產(chǎn)生菌膠團(tuán)[23],則可以降解糖類和蛋白質(zhì)[24],提供更多可利用的有機(jī)碳源,這有利于[25]、[26]、[27]等反硝化細(xì)菌進(jìn)行生命活動,可見它們之間可能存在偏利共生的關(guān)系.3種菌膠團(tuán)形成菌、、之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系.是一種群體感應(yīng)細(xì)菌[28],雖不能合成N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL),但其含有AHL受體蛋白從而可以參與AHL調(diào)控作用[29],的富集則可以促進(jìn)環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)的產(chǎn)生[30],這表明三者可能通過群體感應(yīng)促進(jìn)EPS分泌來相互輔助生長.Weber等[31]利用一對“sender”和“receiver”的模塊,實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌、真菌和哺乳動物細(xì)胞間的跨界交流,成功模擬出存在共生、寄生以及捕食等不同相互作用的合成群落,證實(shí)了通過信號傳導(dǎo)進(jìn)行共生的可能性.另外相互間有著顯著正相關(guān)性的還包括A4b、、NS9group和,表明這些菌屬間同樣可能為共生關(guān)系而非競爭.這些菌屬大多是各馴化時期富集的優(yōu)勢菌屬,據(jù)報(bào)道,細(xì)菌間的共生效應(yīng)能夠提高它們對污染物的耐受性[32-33],因此上述優(yōu)勢菌屬間的相互作用或許是提高好氧顆粒污泥對PFOS耐受的一種潛在方式.

圖4 PFOS賦存環(huán)境下的微生物群落相關(guān)性

2.6 微生物表型分布對顆粒耐受性的影響

由圖5a可見,厭氧表型相對豐度在0.1,0.5mg/L PFOS馴化至150d時由對照組的28.40%大幅度降至3.55%和4.03%,在350d時又逐漸上升至36.06%和33.87%.這是因?yàn)樽畛躅w粒污泥的解體破壞了厭氧細(xì)菌的定殖區(qū)域,而成熟后的好氧顆粒污泥內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,為厭氧細(xì)菌重新提供了厭氧環(huán)境,這也再一次反映了馴化后的好氧顆粒污泥中不同生境的恢復(fù)和穩(wěn)定.與此同時,革蘭氏陽性表型豐度在PFOS馴化后同樣出現(xiàn)降低,這主要是由于革蘭氏陰性菌的外膜比革蘭氏陽性菌更能抵抗膜損傷[34].此外, PFOS可以通過破壞氧化平衡體系的方式使微生物細(xì)胞受損,因此PFOS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激增加了耐脅迫的表型[35],其相對豐度在馴化50d時由對照組的32.63%最高升至63.27%,在后續(xù)馴化過程中該表型豐度雖然有所下降,但仍高于對照組.生物膜形成表型表現(xiàn)出與耐脅迫表型相似的趨勢,在0.1,0.5mg/L PFOS馴化至50d時,其相對豐度由81.56%分別升至82.76%和88.35%,但隨著馴化時間延長豐度逐漸下降.這主要是由于50d時顆粒仍處于解體階段,微生物表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激反應(yīng).微生物表型的轉(zhuǎn)變使好氧顆粒污泥更能適應(yīng)不利的生態(tài)環(huán)境.

由圖5b～圖5e可見,不同馴化時期的主要貢獻(xiàn)細(xì)菌有著極大差異.門水平上,均以Proteobacteria為主要貢獻(xiàn)菌,尤其在耐脅迫表型中.屬水平上,經(jīng)PFOS馴化50d后,生物膜形成表型中當(dāng)屬unclassified、、、和貢獻(xiàn)度最高,在耐脅迫表型中則以、unclassified和為主要貢獻(xiàn)細(xì)菌;當(dāng)馴化至150d時,生物膜形成表型中的貢獻(xiàn)細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)橐?、、、unclassified、、、為主,在耐脅迫表型中則以、unclassified、、、為主;而經(jīng)PFOS馴化350d后可見,、、、、A4b在生物膜形成表型中的貢獻(xiàn)最高,其中、、在耐脅迫表型中也有著較高的貢獻(xiàn)度.

綜合考慮章節(jié)2.4優(yōu)勢群落組成分析認(rèn)為,解體期以、unclassified、、為主要生物膜形成和抗氧化脅迫細(xì)菌,形成期則以、、、為主,而成熟期以、A4b為主.生物強(qiáng)化相關(guān)研究表明,外來菌群的投加或許不能定殖成為污泥體系中的優(yōu)勢群落,但依舊能夠提高污泥系統(tǒng)對環(huán)境壓力的適應(yīng)性[36-37].因此通過對上述菌群進(jìn)行篩選和培養(yǎng),以添加外源菌劑的方式強(qiáng)化顆粒污泥系統(tǒng),對顆粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及處理含PFOS廢水均具有建設(shè)意義.

2.7 優(yōu)勢功能基因在顆粒耐性馴化中的作用

由圖6a可見,優(yōu)勢基因總豐度在馴化50d時出現(xiàn)上升,但在后續(xù)馴化過程中逐漸降低.其中(K03088)、(K01990)、(K01992)、(K02004)、(K02003)、(K06147)等基因相對豐度在解體期出現(xiàn)下降,但在顆粒成熟時期逐漸增長至初始水平,這些基因多與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān),這也再一次證實(shí)重塑后的好氧顆粒污泥已基本適應(yīng)PFOS,各項(xiàng)功能有所恢復(fù).

圖6 PFOS馴化過程中微生物功能基因的變化

群體感應(yīng)是由細(xì)菌釋放信號分子進(jìn)行種內(nèi)和種間交流的過程,能夠調(diào)控細(xì)菌的生物行為,如EPS的合成與代謝、生物膜的形成等,因此群體感應(yīng)與好氧顆粒污泥的形成及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定密切相關(guān)[38].由圖5a可見,(K01999)、(K01996)、(K01998)、(K01997)、(K02035)、(K02034)、(K02033)、(K02032)等基因均來源于群體感應(yīng)途徑(ko02024),與耐脅迫表型和生物膜形成表型變化過程一致的是,這些基因豐度均在馴化50d時顯著上調(diào),而此時顆粒的解體程度基本達(dá)到最高,表明群體感應(yīng)在微生物應(yīng)激過程中起著關(guān)鍵性作用.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),(K02035)、(K02034)、(K02033)、(K02032)等基因編碼Dpp受體蛋白,其所在通路與生物膜的形成有著間接關(guān)系,然而該通路中的信號分子類型尚未明確(圖6b),明確該信號分子的類型對好氧顆粒污泥的形成和穩(wěn)定具有重要意義.

趨化性是微生物細(xì)胞感知外在環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)從而產(chǎn)生趨向的運(yùn)動,其價值在于尋找食源并遠(yuǎn)離有害環(huán)境[39],該途徑中豐富的基因有助于闡釋長期暴露于PFOS環(huán)境下微生物的耐性機(jī)制.由圖6a和圖6c可以看出,細(xì)菌趨化途徑(ko02030)以及該途徑中的優(yōu)勢基因(K03406)相對豐度同樣在PFOS馴化50d時大幅度上升,但在150d和350d時有所下降,逐漸接近于于對照組.據(jù)報(bào)道,細(xì)菌可以利用群體感應(yīng)機(jī)制,根據(jù)細(xì)胞密度控制基因表達(dá),從而調(diào)控其生物過程,趨化性則為群體感應(yīng)行為提供了協(xié)作機(jī)制,其可以通過增加細(xì)菌種群密度,從而達(dá)到細(xì)胞對信號分子的感應(yīng)閾值[40].因此,污泥細(xì)菌可能在PFOS誘導(dǎo)下通過執(zhí)行適宜的趨化運(yùn)動從而促進(jìn)種間群體感應(yīng)作用,這或許是好氧顆粒污泥適應(yīng)PFOS的一種有效應(yīng)激途徑.

3 結(jié)論

3.1 PFOS馴化期間好氧顆粒污泥主要經(jīng)歷解體期,形成期和成熟期3個階段,馴化成熟后的好氧顆粒污泥在含PFOS的廢水處理中能夠維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu).

3.2 掃描電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)顯示,顆粒表面絲狀菌數(shù)量減少,覆蓋著大量膜狀EPS,使顆粒結(jié)構(gòu)更加致密穩(wěn)定.

3.3 群落組成及表型預(yù)測顯示,不同馴化時期維持顆粒穩(wěn)定的微生物群落組成存在顯著差異,解體期以、unclassified、、為主,形成期以、、、為主,成熟期以、A4b為主.

3.4 基因預(yù)測結(jié)果顯示,(K01999)、(K02035)等8種群體感應(yīng)相關(guān)基因,以及細(xì)菌趨化途徑中的(K03406)基因在解體期上調(diào).

[1] Gao X Y, Liu Z T, Li J, et al. Ecological and health risk assessment of perfluorooctane sulfonate in surface and drinking water resources in China [J]. Science of The Total Environment, 2020,738:139914.

[2] Chen H, Zhang C, Han J B, et al. PFOS and PFOA in influents, effluents, and biosolids of Chinese wastewater treatment plants and effluent-receiving marine environments [J]. Environment Pollution, 2012,170:26-31.

[3] Qu Y X, Huang J, Willand W, et al. Occurrence,removal and emission of per- and polyfluorinated alkyl substances (PFASs) from chrome plating industry:A case study in Southeast China [J]. Emerging Contaminants, 2020,6:376-384.

[4] Guo R, Zhou Q F, Cai Y Q, et al. Determination of perfluorooctanesulfonate and perfluorooctanoic acid in sewage sludge samples using liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry [J]. Talanta, 2008,75(5):1394-1399.

[5] 王建龍,張子健,吳偉偉.好氧顆粒污泥的研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2009,29(3):449-473.

Wang J L, Zhang Z J, Wu W W. Research advances in aerobic granular sludge [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2009,29(3):449-473.

[6] Liu G S, Zhang S, Yang K, et al. Toxicity of perfluorooctane sulfonate and perfluorooctanoic acid to Escherichia coli: Membrane disruption, oxidative stress, and DNA damage induced cell inactivation and/or death [J]. Environmental Pollution, 2016,214:806-815.

[7] He Q L, Wang H Y, Chen L, et al. Robustness of an aerobic granular sludge sequencing batch reactor for low strength and salinity wastewater treatment at ambient to winter temperatures [J]. Journal of Hazardous Materials, 2019,384:121454.

[8] 陸 玉,鐘 慧,丑三濤,等.乙酸馴化對厭氧污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及發(fā)酵特性的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2018,38(5):1835-1842.

Lu Y, Zhong H, Chou S T, et al. Effects of acid-tolerant acclimation on microbial community structure and fermentation performance of anaerobic sludge [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2018,38(5):1835- 1842.

[9] Li W, Yao J C, Zhuang J L, et al. Metagenomics revealed the phase-related characteristics during rapid development of halotolerant aerobic granular sludge [J]. Environment International, 2020,137: 105548.

[10] 鄭婧婧,張智明,徐向陽,等.污水處理好氧顆粒污泥生產(chǎn)運(yùn)行中的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2021,27(6):1672-1685.

Zheng J J, Zhang Z M, Xu X Y, et al. Structure and sability of aerobic granular sludge during operation in wastewater treatment [J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2021,27(6):1672- 1685.

[11] Ji J, Peng L, Redina M M, et al. Perfluorooctane sulfonate decreases the performance of a sequencing batch reactor system and changes the sludge microbial community [J]. Chemosphere, 2021,279:130596.

[12] 唐琳欽,宿程遠(yuǎn),黃 嫻,等.PFOA與PFOS對厭氧氨氧化污泥特性和微生物群落的影響[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2022,42(1):194-202.

Tang L Q, Su C Y, Huang X, et al. Evaluation of sludge characteristics and microbial community of anammox sludge during exposure to perfluorooctane acid and perfluorooctane sulfonate [J]. Chinese Environmental Science, 2022,42(1):194-202.

[13] Yang G J, Zhang N, Yang J N, et al. Interaction between perfluorooctanoic acid and aerobic granular sludge [J]. Water Research, 2020,169:115249.

[14] Sheng G P, Yu H Q, Li X Y. Extracellular polymeric substances (EPS) of microbial aggregates in biological wastewater treatment systems: A review [J]. Biotechnology Advances, 2010,28(6):882-894.

[15] Chen H, Li A, Cui C W, et al. AHL-mediated quorum sensing regulates the variations of microbial community and sludge properties of aerobic granular sludge under low organic loading [J]. Environment International, 2019,130:104946.

[16] 陳 穎,陳 垚,李 聰,等.好氧顆粒污泥結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及穩(wěn)定性研究進(jìn)展[J]. 工業(yè)水處理, 2021,41(10):28-35.

Chen Y, Chen Y, Li C, et al. Research pogess on the sutural cacerists and sbili of arbie granular sludge [J]. Industrial Water Treatment, 2021, 41(10):28-35.

[17] Bj?rnsson L, Hugenholtz P, Tyson G W, et al. Filamentous Chloroflexi (green non-sulfur bacteria) are abundant in wastewater treatment processes with biological nutrient removal [J]. Microbiology, 2002, 148(8):2309-2318.

[18] 鮮文東,張瀟橦,李文均.綠彎菌的研究現(xiàn)狀及展望 [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2020,60(9):1801-1820.

Xian W D, Zhang X T, Li W J. Research status and prospect on bacterial phylum Chloroflexi [J]. Acta Microbiologica Sinica, 2020, 60(9):1801-1820.

[19] Lv Y, Wan C L, Lee D J, et al. Microbial communities of aerobic granules: Granulation mechanisms [J]. Bioresource Technology, 2014, 169:344-351.

[20] Fra-Vázquez A, Morales N, Figueroa M, et al. Bacterial community dynamics in long-term operation of a pilot plant using aerobic granular sludge to treat pig slurry [J]. Biotechnology Progress, 2016, 32(5):1212-1221.

[21] 郭海娟,顧一寧,馬 放,等.好氧顆粒污泥處理市政污水性能與微生物特性研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2020,40(10):3688-3695.

Guo H J, Gu Y N, Ma F, et al. Performances and microbial properties of aerobic granular sludge treating municipal wastewater treatment [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2020,40(10):3688-3695.

[22] 邱東茹,高 娜,安衛(wèi)星,等.活性污泥微生物胞外多聚物生物合成途徑與菌膠團(tuán)形成的調(diào)控機(jī)制 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2019,46(8):2080- 2089.

Qiu D R, Gao N, An W X, et al. Biosynthesis pathway of extracellular polymeric substance and regulatory mechanism underlying floc frmation of acivated sludge bacteria [J]. Microbiology China, 2019, 46(8):2080-2089.

[23] 張曉紅,姜 博,張文武,等.京津冀區(qū)域市政污水廠活性污泥種群結(jié)構(gòu)的多樣性及差異 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2019,46(8):1896-1906.

Zhang X H, Jiang B, Zhang W W, et al. Microbial community diversity of activated sludge from municipal wastewater treatment plants in Bejjing-Tianjin-Hebei region [J]. Microbiology China, 2019, 46(8):1896-1906.

[24] 肖才林,沈建華,楊 洋,等.三段A/O工藝處理發(fā)制品產(chǎn)業(yè)集聚區(qū)綜合廢水 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2018,38(4):1304-1311.

Xiao C L, Shen J H, Yang Y, et al. Utilizing three step feed A/O process to treate comprehensive wastewater from hair product production cluster area [J]. Chinese Environmental Science, 2018, 38(4):1304-1311.

[25] Maszenan A M, Seviour R J, Patel B K C, et al. Defluvicoccus vanus gen. nov., sp. nov., a novel Gram-negative coccus/coccobacillus in the 'Alphaproteobacteria' from activated sludge [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2005,55:2105-2111.

[26] Liu Y, Jin J H, Liu Y H, et al. Dongia mobilis gen. nov., sp. nov., a new member of the family Rhodospirillaceae isolated from a sequencing batch reactor for treatment of malachite green effluent [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2010,60:2780-2785.

[27] Gao G F, Li P F, Zhong J X, et al. Spartina alterniflora invasion alters soil bacterial communities and enhances soil N2O emissions by stimulating soil denitrification in mangrove wetland [J]. Science of The Total Environment, 2019,653:231-240.

[28] Güne? G, Ta?kan E. Quorum quenching strategy for biofouling control in membrane photobioreactor [J]. Chemosphere, 2022,288:132667.

[29] Jiang K, Sanseverino J, Chauhan A, et al. Complete genome sequence of Thauera aminoaromatica strain MZ1T [J]. Standards in Genomic Sciences, 2012,6(3):325-335.

[30] Wan C L, Lee D J, Yang X, et al. Calcium precipitate induced aerobic granulation [J]. Bioresource Technology, 2015,176:32-37.

[31] Weber W, Daoud-El Baba M, Fussenegger M. Synthetic ecosystems based on airborne inter-and intrakingdom communication [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007,104(25): 10435-10440.

[32] Sheng Z Y, Liu Y. Effects of silver nanoparticles on wastewater biofilms [J]. Water Research, 2011,45(18):6039-6050.

[33] Quan X C, Cen Y, Lu F, et al. Response of aerobic granular sludge to the long-term presence to nanosilver in sequencing batch reactors: Reactor performance, sludge property, microbial activity and community [J]. Science of The Total Environment, 2015,506-507: 226-233.

[34] Akhavan O, Ghaderi E. Toxicity of graphene and graphene oxide nanowalls against bacteria [J]. ACS Nano, 2010,4(10): 5731-5736.

[35] Du J J, Wang T, Zhou Q X, et al. Graphene oxide enters the rice roots and disturbs the endophytic bacterial communities [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2020,192:110304.

[36] Ramos C, Amorim C L, Mesquita D P, et al. Simultaneous partial nitrification and 2-fluorophenol biodegradation with aerobic granular biomass: reactor performance and microbialcommunities [J]. Bioresource Technology, 2017,238:232-240.

[37] Amorim C L, Duque A F, Afonso C M, et al. Bioaugmentation for treating transient 4-fluorocinnamic acid shock loads in a rotating biological contactor [J]. Bioresource Technology, 2013,144:554-562.

[38] Tan C H, Koh K S, Xie C, et al. The role of quorum sensing signalling in EPS production and the assembly of a sludge community into aerobic granules [J]. The ISME Journal, 2014,8(6):1186-1197.

[39] Adler J. Chemotaxis in bacteria [J]. Science, 1966,153(3737):708- 716.

[40] Wong-Ng J, Celani A, Vergassola M. Exploring the function of bacterial chemotaxis [J]. Current Opinion in Microbiology, 2018,45: 16-21.

Structural stability and microbial response mechanism of aerobic granular sludge exposed to perfluorooctane sulfonate.

XU Jia-jie1, ZHANG Ni1,2, XIE Zhou-yun1, XU Yi-yi2, TANG Li1, XIA Jing-fen1, YANG Guo-jing1,2*

(1.College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China；2.College of Environmental Science and Engineering, Hunan University, Changsha 410082, China)., 2022,42(11)：5117～5127

The aerobic granular sludge that can tolerate perfluorooctane sulfonate (PFOS) was successfully cultivated in a lab-scale sequence batch reactor system. The tolerance mechanism of aerobic granular sludge to PFOS was discovered by examining the sludge characteristics, microbial communities, microbial phenotypes, and functional pathways in various domestication periods. In the presence of PFOS, the granular sludge maintained good stability through the disintegration, formation and maturation phases. PFOS reduced the filamentous bacteria, but promoted EPS secretion. The aforementioned phenomena were beneficial for the formation of compact structure of granules. During the whole domestication stage, a significant number of resistant bacteria and bacteria associated with the maintenance of granule stability emerged in granules, mainly including unclassified,,,,,,,,, andA4b, and there were significant positive correlations among some genera. In addition, the abundance of genes related to the quorum sensing pathway and the bacterial chemotaxis pathway up-regulated in the disintegration period, but returned to the initial level in the formation and maturation periods. It suggested that the bacterial quorum sensing system and chemotactic ability could play important roles in the process of granular stress. Therefore, aerobic granular sludge could tolerate PFOS in various ways such as positive response of specific bacterial communities, promotion of bacterial chemotaxis and quorum sensing, enhancement of EPS secretion, and enhancement of antioxidant stress capacity of the system. The application of EPS-based aerobic granular sludge, microbial agents, and signal molecules was conducive to the treatment of wastewater containing PFOS.

perfluorooctane sulfonate；aerobic granular sludge；domestication；microbial community；tolerance

X703.1

A

1000-6923(2022)11-5117-11

徐佳杰(1997-),男,浙江杭州人,浙江萬里學(xué)院碩士研究生,主要從事污水處理及資源化研究.發(fā)表論文2篇.

2022-04-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51408551);浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY21E080028);浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃(LGF22E090008);浙江省一流學(xué)科課題(CX2020025);浙江萬里學(xué)院科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助

* 責(zé)任作者, 教授, guojing_yang@163.com