杜金龍，劉振東，馬 佳，劉淑梅，杜海燕，唐春燕，董一紅，李卓敏，田 野，譚延國(guó)△

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100038；2.北京梅斯質(zhì)譜生物科技有限責(zé)任公司，北京102629；3.首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，北京100038

膽汁酸是膽汁的主要成分，由膽固醇代謝產(chǎn)生，在肝臟合成初級(jí)膽汁酸，經(jīng)腸道微生物分解為次級(jí)膽汁酸后由小腸重吸收，經(jīng)門靜脈入血回肝，再由肝細(xì)胞攝取，少量進(jìn)入血液循環(huán)，形成肝腸循環(huán)[1-2]。膽汁酸是敏感的肝細(xì)胞損傷診斷指標(biāo)，也是腸道、膽道病變的評(píng)估指標(biāo)?？偰懼嵩缫殉Ｒ?guī)應(yīng)用于肝膽疾病的診斷，但目前對(duì)于膽汁酸亞組分卻少有研究。膽汁酸亞組分的水平與比例的改變與膽固醇代謝關(guān)系密切，其可影響膽固醇代謝[3-4]。有研究顯示，脂肪性肝病、酒精性肝病、原發(fā)性肝癌等肝膽疾病患者血清膽汁酸亞組分譜與健康人群有所差異[5-7]。本研究對(duì)健康成年人膽汁酸亞組分的水平分布特征和參考區(qū)間進(jìn)行了探討，以期為肝膽疾病中膽汁酸亞組分變化情況的相關(guān)研究及臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集在首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院健康管理中心體檢的250例表觀健康成年人為研究對(duì)象，其中男155例，女95例；年齡27～96歲，中位年齡62歲。依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI) C28-A3文件中參考個(gè)體的選擇要求，研究與年齡相關(guān)的參考區(qū)間范圍應(yīng)按年齡進(jìn)行分組，本研究中27～60歲(共124例，其中男88例，女36例)為中青年組，>60歲(共126例，其中男67例，女59例)為老年組。依據(jù)CLSI C28-A3文件關(guān)于健康者的要求，具有下述任意一項(xiàng)者將被排除在參考人群之外:患有自身免疫性疾病者；吸煙、飲酒、藥物濫用者；妊娠期、哺乳期女性；有家族遺傳病史者；近期有手術(shù)史及因疾病住院治療者；肝、腎、心、肺功能不全者；收集的血清標(biāo)本量不足以完成檢測(cè)或者出現(xiàn)嚴(yán)重溶血或脂血者。

1.2儀器與試劑 Waters ACQUITY UPLC I-Class液相系統(tǒng)/Waters Xevo TQ-S三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀[沃特世科技(上海)有限公司],LC-MS級(jí)甲醇[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司],蒸餾水(北京屈臣氏蒸餾水有限公司),普通離心機(jī)(北京白洋離心機(jī)廠),高速離心機(jī)[艾本德(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司],7600-110全自動(dòng)生化分析儀[日立(中國(guó))有限公司]。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 采集研究對(duì)象空腹靜脈血后靜置30 min，待血液凝固后以3 000 r/min離心，分離血清，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2膽汁酸亞組分檢測(cè) 本研究檢測(cè)的22種膽汁酸亞組分按結(jié)構(gòu)主要分為游離型與結(jié)合型膽汁酸兩大類，其中游離型膽汁酸包括膽酸(CA)、脫氧膽酸(DCA)、鵝去氧膽酸(CDCA)、豬去氧膽酸(HDCA)、γ-鼠膽酸(γ-MCA)、β-鼠膽酸(β-MCA)、α-鼠膽酸(α-MCA)、熊去氧膽酸(UDCA)、12-酮基石膽酸(12-ketoLCA)、3-脫氫膽酸-1(3-DHCA-1)、石膽酸(LCA)、23-脫甲膽酸(23-Norcholic Acid)、異石膽酸(IsoLCA)；甘氨酸結(jié)合型膽汁酸包括甘氨鵝脫氧膽酸鈉鹽(GCDCA)、甘氨脫氧膽酸鈉鹽(GDCA)、甘氨石膽酸(GLCA)、甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)；?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸包括?；悄懰?TCA)、?；秦i脫氧膽酸鈉鹽(THDCA)、?；敲撗跄懰徕c鹽(TDCA-1)、牛磺豬膽酸鈉鹽(THCA-1)、牛磺熊脫氧膽酸二水合物(TDAD-1)。經(jīng)反復(fù)的條件優(yōu)化，確定質(zhì)譜儀測(cè)定參數(shù)設(shè)置如表1所示。具體操作如下：依次吸取50 μL血清、20 μL內(nèi)標(biāo)液、150 μL甲醇沉淀劑于刻度離心管中，振蕩混勻10 min后，19 852×g 離心15 min，取上清液100 μL，加入150 μL超純水稀釋，混勻后上機(jī)檢測(cè)。工作曲線的溶液配制：吸取10 μL標(biāo)準(zhǔn)品工作液(L1～L8)、40 μL空白基質(zhì)加入離心管中渦旋混勻，后續(xù)操作同血清的處理過(guò)程。液相條件：色譜柱為Shim-pack Velox SP-C18，2.7 μm，2.1 mm×100 mm，流動(dòng)相A相為0.01%甲酸水，B相為乙腈，柱溫50 ℃，流速0.25 mL/min。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，負(fù)離子電離模式；脫溶劑500 ℃,毛細(xì)管電壓3 000 V，錐孔氣150 L/H，脫溶劑氣1 000 L/H，采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)進(jìn)行掃描。根據(jù)CLSI C62-A和《液相色譜-質(zhì)譜臨床應(yīng)用建議》，本實(shí)驗(yàn)批間精密度、批內(nèi)精密度、準(zhǔn)確度、線性、攜帶污染率等均已通過(guò)性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。

表1 質(zhì)譜儀檢測(cè)22種膽汁酸亞組分的參數(shù)設(shè)置

1.3.3總膽汁酸檢測(cè) 使用7600-110全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽汁酸，方法為循環(huán)酶法。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布以M(P25，P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；以P2.5～P97.5作為參考區(qū)間；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同性別健康成年人總膽汁酸及膽汁酸亞組分水平比較 不同性別健康成年人總膽汁酸及膽汁酸亞組分水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2中青年組與老年組膽汁酸亞組分構(gòu)成比較 中青年組、老年組膽汁酸亞組分構(gòu)成均以甘氨酸結(jié)合型膽汁酸為主，分別占49.47%和46.65%，其次為游離型膽汁酸，分別占43.32%和45.74%，以?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸占比最低，分別占7.21%和7.61%，兩組間甘氨酸結(jié)合型膽汁酸、游離型膽汁酸、?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸占比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 不同性別健康成年人總膽汁酸及膽汁酸亞組分水平比較[M(P25，P75),ng/mL]

性別nGUDCAGCDCAGLCAγ-MCAβ-MCAα-MCA男15534.00(14.01,98.35)295.25(154.92,655.52)2.94(1.44,7.37)3.97(1.41,8.53)0.24(0.16,0.46)0.86(0.16,3.52)女9545.72(13.47,103.93)279.86(120.91,540.14)2.59(1.68,7.28)3.07(1.38,8.15)0.21(0.15,0.53)1.08(0.16,3.27)P>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

性別nCA3-DHCA-1CDCAHDCAUDCADCA男15532.80(15.12,91.76)0.76(0.34,1.97)134.16(46.01,271.82)2.96(1.13,11.25)23.44(5.16,69.01)45.93(4.75,109.42)女9538.45(16.29,85.05)0.94(0.43,2.99)115.46(38.96,317.20)2.21(0.81,10.50)21.93(5.37,83.93)34.99(0.51,122.42)P>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

性別n12-ketoLCALCATHCA-123-NorcholicAcidIsoLCA男1552.16(0.47,5.03)2.08(0.48,5.79)0.25(0.02,0.62)2.51(1.26,5.62)3.21(1.14,6.84)女952.19(0.44,5.48)1.41(0.00,4.49)0.18(0.00,0.61)3.47(1.60,8.75)2.64(0.91,5.05)P>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

2.3中青年組與老年組膽汁酸亞組分參考區(qū)間的建立 中青年組血清THDCA、GDCA、GLCA、γ-MCA、β-MCA、CDCA、HDCA、UDCA、12-ketoLCA、LCA和THCA-1水平分別為0.00(0.00，0.51)、54.50(16.14，112.69)、2.57(1.16，7.21)、3.08(1.39，7.39)、0.21(0.07，0.35)、114.88(36.92，229.68)、2.56(1.25，6.65)、21.61(5.41，56.15)、2.35(0.47，5.55)、2.56(0.69，5.74)、0.32(0.15，0.70)ng/mL；老年組分別為0.02(0.00，1.18)、42.82(10.27，90.55)、2.99(2.05，7.38)、3.93(1.39，10.66)、0.27(0.11，0.74)、134.05(46.29，359.79)、2.48(0.81，18.83)、24.30(4.24，97.41)、1.81(0.45，4.63)、1.42(0.05，4.72)、0.42(0.15，0.89)ng/mL，兩組上述各項(xiàng)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。故兩年齡組上述各項(xiàng)可使用統(tǒng)一的參考區(qū)間。中青年組與老年組血清TCA、TDCA-1、TDAD-1、GUDCA、GCDCA、α-MCA、CA、3-DHCA-1、DCA、23-Norcholic Acid和IsoLCA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[TCA(P=0.032)、TDCA-1(P=0.001)、TDAD-1(P=0.003)、GUDCA(P=0.008)、GCDCA(P=0.011)、α-MCA(P=0.034)、CA(P=0.041)、3-DHCA-1(P<0.001)、DCA(P=0.044)、23-Norcholic Acid(P<0.001)和IsoLCA(P=0.003)]，故兩年齡組上述各項(xiàng)應(yīng)建立各自的參考區(qū)間。膽汁酸亞組分?jǐn)?shù)據(jù)均為非正態(tài)分布，參考區(qū)間見表3～5。

表3 部分膽汁酸亞組分參考區(qū)間(中青年組、老年組共用,ng/mL)

表4 中青年組部分膽汁酸亞組分參考區(qū)間(ng/mL)

表5 老年組部分膽汁酸亞組分參考區(qū)間(ng/mL)

2.4總膽汁酸與22種膽汁酸亞組分水平的相關(guān)性分析 總膽汁酸與22種膽汁酸亞組分水平均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；THDCA與TCA、TDCA-1、TDAD-1、THCA-1水平呈正相關(guān)(r=0.649、0.619、0.671、0.691，P<0.001)，UDCA與TDAD-1、GUDCA、CDCA、HDCA水平呈正相關(guān)(r=0.656、0.655、0.605、0.633，P<0.001)，CA與CDCA、HDCA水平呈正相關(guān)(r=0.603、0.628，P<0.001)，LCA與GLCA、12-ketoLCA水平呈正相關(guān)(r=0.678、0.636，P<0.001)，DCA與12-ketoLCA水平呈正相關(guān)(r=0.661，P<0.001)。

3 討 論

總膽汁酸及膽汁酸亞組分水平的細(xì)微變化在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、葡萄糖代謝以及能量平衡中所起的重要作用已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[8]。此外，肝膽、胃腸、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等也與患者體內(nèi)膽汁酸亞組分水平與比例的變化有關(guān)[9-10]。膽汁酸膜受體G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)與核受體法尼酯衍生物X受體(FXR)-α不僅是膽汁酸合成和運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)因子，也是膽汁酸調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子和保護(hù)傳感器，故肝臟的代謝變化可以體現(xiàn)在膽汁酸亞組分的水平或比例變化中[11]。有研究分析了70例慢性淺表性胃炎、腸化生和胃癌患者的胃液標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)CA和DCA的代謝變化與胃癌的進(jìn)展有關(guān)[12]；還有研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇穩(wěn)態(tài)的破壞與肝性腦病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)，且腦積累的膽固醇通過(guò)膽汁酸介導(dǎo)的FXR作用促進(jìn)肝性腦病的進(jìn)展，故以腸道微生物-膽汁酸-腦軸為靶點(diǎn)可能是治療肝性腦病的新策略[13]。

近年來(lái)，科研和臨床工作者已陸續(xù)使用酶法、免疫層析法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等開展了對(duì)膽汁酸亞組分的研究。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法逐漸成為主流方法，因?yàn)槠鋵?duì)血清膽汁酸亞組分的區(qū)分和定量能力較強(qiáng)，可迅速、準(zhǔn)確地獲得膽汁酸亞組分的代謝信息[12-13]。目前，膽汁酸亞組分與疾病關(guān)系的研究仍未被廣泛開展，對(duì)膽汁酸亞組分譜的廣泛研究有望為相關(guān)疾病的診斷、發(fā)病機(jī)制、預(yù)后、療效觀察研究等提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn)，中青年組與老年組表觀健康成年人中，部分血清膽汁酸亞組分(TCA、TDCA-1、TDAD-1、GUDCA、GCDCA、α-MCA、CA、3-DHCA-1、DCA、23-Norcholic Acid和IsoLCA)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?，F(xiàn)有膽汁酸亞組分的研究主要集中于孕婦與新生兒，對(duì)中青年與老年人群的研究很少[14-16]，本研究發(fā)現(xiàn)的部分膽汁酸亞組分水平在中青年與老年人群間存在差異的原因尚不明確，有待進(jìn)一步深入探討。相比其他研究所得的孕婦的參考區(qū)間而言[17-18]，本研究所得的中青年、老年人群膽汁酸亞組分參考區(qū)間上限值更高，可能與孕婦年齡分布窄(多為20～30歲)以及其特殊的生理狀態(tài)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，血清總膽汁酸與膽汁酸亞組分水平間無(wú)相關(guān)性，故對(duì)于總膽汁酸水平大致正常者，膽汁酸亞組分水平可能存在偏離正常的情況，檢測(cè)膽汁酸亞組分可能對(duì)某些疾病具有一定的診斷價(jià)值。本研究中，老年人群血清膽汁酸亞組分水平整體偏高，可能與其膳食纖維攝入減少及膽汁酸的代謝穩(wěn)態(tài)改變有關(guān)[19-20]，但具體原因尚待進(jìn)一步研究。

本研究尚存在不足之處，表觀健康人群未納入未成年人，因此參考區(qū)間的年齡適用范圍仍需進(jìn)一步優(yōu)化。在后續(xù)研究中除了將表觀健康人群作為參考標(biāo)準(zhǔn)外，也會(huì)前瞻性收集膽汁酸及其他肝膽功能指標(biāo)異常的標(biāo)本進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，這將有助于探索膽汁酸代謝在多種疾病早期診斷中的作用及與疾病發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，有較高的臨床研究?jī)r(jià)值。