王成虎，楊衛(wèi)華，周晨晨，盧睿，姚愛霞，臧曉，姚進

先天性全色盲是一種罕見的常染色體隱性遺傳視錐細胞功能障礙的疾病，臨床特征主要表現(xiàn)為視力低下、眼球震顫、畏光和色覺異常。該病的發(fā)病率約為1∶50,000～1∶30,000[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)6 個與全色盲相關(guān)的致病基因，分別為CNGB3 基因、CNGA3 基因、GNAT2 基因、PDE6C 基因、PDE6H 基因和ATF6 基因[2]。除了目前已知的6 個基因外，仍有10%～25%的全色盲先證者的致病基因是未知的。本研究通過對我國1個常染色體隱性遺傳先天性全色盲家系進行基因突變位點的篩查和遺傳分析，發(fā)現(xiàn)了PDE6C 基因的1 個新的復(fù)合雜合突變組合，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

王某，男，12 歲，因“雙眼視物模糊、眼球顫動10 年”于2018 年2 月3 日就診于南京醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院。家屬代訴，10 年前無明顯誘因出現(xiàn)雙眼視物模糊，伴眼球顫動、畏光，無眼紅眼痛。發(fā)病以來，當(dāng)?shù)囟嗉裔t(yī)院就診，具體治療措施不詳，治療后眼部癥狀無明顯改善。查視力：雙眼0.12（矯正）。雙眼前節(jié)及眼底照相均未見明顯異常。光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）示：雙眼黃斑區(qū)視網(wǎng)膜厚度變薄，橢圓體帶欠連續(xù)（圖1A、1B）。色覺檢查示：色覺分辨能力完全喪失。視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）示：明視反應(yīng)中視錐細胞反應(yīng)重度降低（圖1C、1D），30 Hz 閃爍ERG 中P1 波振幅重度降低，波形接近熄滅（圖1E、1F），暗視反應(yīng)中視桿細胞反應(yīng)輕中度降低（圖1G、1H）。中醫(yī)四診：咽燥，耳鳴，多夢盜汗，二便調(diào)。舌紅少苔，脈細。西醫(yī)診斷：（1）雙眼全色盲，（2）雙眼眼球震顫。中醫(yī)診斷：視赤如白癥（肝腎虧虛證）。建議其家庭成員進行基因檢測。

圖1 患者王某初診時OCT及ERG圖

二診（2018 年7 月16 日）：眼科各項檢查結(jié)果同前。其10 名家庭成員參加基因檢測，包括2 名患者（Ⅲ-1 為先證者王某，男，12 歲；Ⅲ-2 為先證者之妹王某，女，7 歲）、3名攜帶者（Ⅰ-1、Ⅱ-3、Ⅱ-6）和5名正常者（Ⅰ-2、Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-4、Ⅱ-5）（圖2）。基因檢測結(jié)果顯示，先證者王某III-1 及先證者之妹Ⅲ-2 的PDE6C 基因存在2 個雜合突變，即c.1771G＞A，p.E591K 和c.939+5G＞A，splicing（圖3A、3B）。先證者之父Ⅱ-3 的PDE6C 基因存在c.1771G＞A 位點雜合變異（圖3C）。先證者之母Ⅱ-6 的PDE6C 基因存在c.939+5G＞A 位點雜合變異（圖3D）。該家系中男女患病機會均等?；颊叩碾p親表型正常，但都是攜帶者。系譜中無連續(xù)傳遞現(xiàn)象。囑患兒補肝腎對癥治療，并定期復(fù)診。

圖2 王某全色盲家系圖

圖3 先證者及其父母樣本的PDE6C基因Sanger測序分析圖

2 討論

本研究對此全色盲家系進行基因檢測結(jié)果顯示，先證者編碼區(qū)第1771號核苷酸由鳥嘌呤變異為腺嘌呤，導(dǎo)致第591 號氨基酸由谷氨酸變異為賴氨酸，為錯義突變。此突變在正常人數(shù)據(jù)庫中的頻率較低，REVEL 軟件預(yù)測為有害。編碼區(qū)第939 號核苷酸下游第5位內(nèi)含子核苷酸由鳥嘌呤變異為腺嘌呤，為剪接位點突變。經(jīng)Human Splicing Finder 3.1軟件分析得到野生型守恒值（conserved value，CV）為85.39，突變后CV 值變?yōu)?3.22，兩者差值變化為12.17，低于10%，提示該突變破壞了野生型PDE6C基因的剪接供體位點，可能產(chǎn)生新的剪接供體，導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變，使蛋白結(jié)構(gòu)和功能受到破壞。Sanger 測序驗證顯示，先證者Ⅲ-1 和先證者之妹III-2 為復(fù)合雜合變異，分別遺傳自其父親和母親。該復(fù)合雜合變異在該家系中突變與疾病表型共分離，是該家系致病突變位點。雖然這2 個突變國外已有報道[3]，但該復(fù)合雜合突變組合在國內(nèi)外尚未見報道。

PDE6C 基因位于人類10 號染色體10q24，由22 個外顯子組成。PDE6C 基因是在視錐細胞中編碼環(huán)鳥苷酸（cyclicguanosinemonophosphate，cGMP）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）6C 的α 亞基，該亞基包含858 個氨基酸[4]。PDE6C 是存在于視網(wǎng)膜視錐細胞中的特異性cGMP 水解酶，在光刺激下催化cGMP 水解，cGMP 水平的降低可導(dǎo)致cGMP 門控通道關(guān)閉和膜的超極化[5]。在視錐細胞的視覺傳導(dǎo)方面起重要作用，而PDE6C 的α 亞基對決定PDE6C 的特點及其整體的三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定至關(guān)重要[6]。PDE6C 基因突變包括錯義突變、無義突變、剪切突變、插入或缺失突變等，可導(dǎo)致全色盲、視錐-視桿細胞營養(yǎng)不良、先天性黑朦、高度近視、自閉癥等。

CHANG 等[4]在全色盲家系中發(fā)現(xiàn)PDE6C 基因編碼區(qū)第2368 號堿基由鳥嘌呤變異為腺嘌呤，導(dǎo)致第790 號氨基酸由谷氨酸變異為賴氨酸，使得PDE6C 的催化活性降低到野生型水平的40%左右，這種錯義突變的致病性源于轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的附加效應(yīng)。GRAU 等[7]的研究表明，突變p.E790K和p.Y323N 顯著降低了PDE 活性，突變p.Y323N 位于GAF 結(jié)構(gòu)域上游的N 端，影響了一個非常保守的氨基酸，而這個氨基酸對于脊椎動物的感光系統(tǒng)非常重要。THIADENS 等[8]在2 個全色盲家系中發(fā)現(xiàn)了PDE6C 基因p.R29W 和p.Y323N 純合突變。在本研究中，發(fā)現(xiàn)的PDE6C 基因突變位點（c.1771G＞A，p.E591K）導(dǎo)致591 號谷氨基酸被替代，可能破壞該位置蛋白質(zhì)的α螺旋結(jié)構(gòu)，使其不能與PDE6C 的活性位點相結(jié)合，此基因位點的錯義突變與NICOLE 等[9]的發(fā)現(xiàn)一致。除此之外，PDE6C基因剪切位點c.939+5G＞A發(fā)生突變，可能導(dǎo)致產(chǎn)生新的氨基酸序列，使編碼的蛋白剪接供體不能發(fā)揮正常功能。

本研究中發(fā)現(xiàn)了PDE6C 基因，它是一個新的復(fù)合雜合突變組合（c.1771G＞A，p.E591K；c.939+5G＞A，splicing），再次驗證了PDE6C 基因復(fù)合雜合突變導(dǎo)致視錐細胞功能障礙，對此位點的深入研究將有助于從分子層面揭示PDE6C 基因突變導(dǎo)致的的全色盲的發(fā)病機制及開展靶向基因治療。