王 蕊，劉 穎，郝佳璇，李 典，趙銀環(huán)，王 珩，杜 蕓

針對PD-1/PD-L1免疫調(diào)節(jié)軸的抗體在幾種惡性腫瘤治療中療效顯著，其中包括非小細胞肺癌[1]。腺癌是非小細胞肺癌最常見的組織病理類型，惡性胸水是晚期肺腺癌患者最常見的并發(fā)癥，因此，胸水細胞學(xué)標(biāo)本的合理使用在臨床工作中意義重大。腫瘤細胞的PD-L1表達水平可用于預(yù)測免疫治療療效[2-4]，而PD-L1的免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)檢測是目前最經(jīng)濟且實用的方法。PD-L1檢測大多數(shù)集中在肺組織石蠟標(biāo)本中，胸水細胞學(xué)標(biāo)本行免疫細胞化學(xué)(immunocytochemistry, ICC)檢測的應(yīng)用研究較少，且研究結(jié)果因?qū)嶒炇也煌嬖诓町怺5]。本實驗分別對胸水細胞學(xué)標(biāo)本及配對組織學(xué)標(biāo)本中PD-L1表達進行檢測，探討胸水細胞學(xué)標(biāo)本ICC法檢測PD-L1的可行性，此外，本實驗進一步評估了胸水細胞學(xué)標(biāo)本中PD-L1表達與臨床病理特征和基因突變的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月～2021年10月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院診治的晚期肺腺癌患者63例，其中男性36例，女性27例；中位年齡60歲；影像學(xué)檢查排除其它部位病變轉(zhuǎn)移。收集的患者均未行放、化療、靶向治療或免疫抑制劑治療。此外，病例納入需符合：(1)細胞學(xué)標(biāo)本的腫瘤細胞量滿足常規(guī)細胞學(xué)診斷及ICC和分子檢測；(2)具備組織病理標(biāo)本，且腫瘤細胞數(shù)量滿足PD-L1檢測需要(>100個)，包括手術(shù)肺葉或楔形切除19例、咬檢25例、經(jīng)支氣管超聲引導(dǎo)針吸活檢(endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration, EBUS-TBNA)組織19例；(3)患者或其家屬均簽署知情同意書。本實驗獲得河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細胞學(xué)標(biāo)本采集及胸水處理將>100 mL的胸水標(biāo)本分為兩部分，一部分使用一次性過濾膜將胸水全部過濾，涂片8～10張(2張用于HE染色，常規(guī)觀察，6～8張直接置于-20 ℃冰箱，用于RNA和DNA的提取)；一部分分次以2 500 r離心2 min，去除上清。將剩余的沉渣用10%中性福爾馬林固定4～12 h，取出后石蠟包埋，切片，用于ICC檢測。

1.3 細胞學(xué)標(biāo)本的ICC檢測及組織標(biāo)本的IHC檢測細胞學(xué)標(biāo)本常規(guī)染色組合：TTF-1、Napsin A、p40、p63、Syn、CD56、WT-1、calretinin、CEA、PD-L1。PD-L1檢測使用羅氏Ventana PD-L1(SP263)兔單克隆抗體，操作在羅氏全自動免疫組化儀(BENCHMARK?GX，羅氏)上進行。根據(jù)FDA陽性定義為：任何強度的全部胞膜或部分胞膜著色[6]。PD-L1表達按腫瘤比例評分(tumor proportion score, TPS)進行判讀，TPS分為三類：<1%為不表達，1%～49%為低表達，TPS≥50%為高表達[7-8]。由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師獨立判斷，結(jié)果不一致時重新判讀。

1.4 新鮮細胞學(xué)標(biāo)本的多基因檢測刮取腫瘤細胞到EP管中，按照DNA/RNA雙提試劑盒說明書進行DNA、RNA提取。分光光度計檢測濃度及純度。OD260/OD280DNA濃度為1～2 ng/μL(說明書1.5～3 ng/μL)。RNA原濃度上機檢測。用5種突變基因檢測試劑盒(廈門艾德公司)檢測ALK、ROS1、EGFR、KRAS、BRAF等基因突變，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。使用ABI7500全自動定量PCR儀檢測。根據(jù)說明書的判斷標(biāo)準(zhǔn)對PCR反應(yīng)擴增曲線及CT值進行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用χ2檢驗及Fisher精確概率法，細胞學(xué)標(biāo)本和組織學(xué)標(biāo)本中PD-L1 TPS的一致性使用Kappa系數(shù)評估，兩組之間的標(biāo)本比較采用McNemar-Bowker檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胸水細胞學(xué)標(biāo)本中PD-L1的表達及與臨床特征的相關(guān)性63例胸水細胞學(xué)標(biāo)本均診斷為肺腺癌轉(zhuǎn)移，其中TTF-1和CEA的陽性率為100%(63/63)，Napsin A陽性率為98.4%(62/63)。22.2%(14/63)胸水細胞學(xué)標(biāo)本標(biāo)本PD-L1 TPS≥50%，36.5%(23/63)1%～49%，41.3%(26/63)TPS<1%(圖1～3)。其余抗體未見腫瘤細胞的特異性著色。最終病理結(jié)果均為腺癌。PD-L1表達與患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P>0.05)，而與患者吸煙史有關(guān)(P<0.05，表1)，尤其在PD-L1高表達(TPS≥50%)患者中吸煙比非吸煙患者的比例更高(44%vs14.8%)。

圖1 例1：A.細胞學(xué)涂片HE染色；B.TTF-1陽性，Ventana法；C.PD-L1陰性，Ventana法 圖2 例2：A.細胞學(xué)涂片HE染色；B.TTF-1陽性，Ventana法；C.PD-L1弱陽性，Ventana法 圖3 例3：A.細胞學(xué)涂片HE染色；B.TTF-1陽性，Ventana法；C.PD-L1強陽性，Ventana法

2.2 胸水細胞學(xué)標(biāo)本與配對組織學(xué)標(biāo)本中PD-L1的表達63例組織學(xué)標(biāo)本PD-L1表達：9例TPS≥50%，27例1%～49%，27例TPS<1%。細胞學(xué)標(biāo)本與組織學(xué)標(biāo)本PD-L1表達的符合率為77.8%，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。其中19例組織學(xué)標(biāo)本與細胞學(xué)標(biāo)本的符合率為89.5%，25例活檢標(biāo)本的符合率為84.0%，EBUS-TBNA標(biāo)本的符合率為57.9%，三種組織學(xué)標(biāo)本與細胞學(xué)標(biāo)本的PD-L1表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。胸水細胞學(xué)標(biāo)本與配對組織學(xué)標(biāo)本之間PD-L1表達具有高度一致性(Kappa=0.650，P<0.01)。此外，與組織學(xué)標(biāo)本相比，胸水細胞學(xué)標(biāo)本在PD-L1高表達組(TPS≥50%)具有更高的陽性率(22.2%vs14.3%)。

2.3 胸水細胞學(xué)標(biāo)本基因突變狀態(tài)與PD-L1表達的關(guān)系63例胸水細胞學(xué)標(biāo)本基因突變狀態(tài)：EGFR突變31例(G719X+L861Q突變1例，19外顯子缺失17例，21號外顯子L858R突變12例，18號外顯子G719X突變1例)；BRAF突變1例；ALK融合2例；Ras突變4例(表3)。其中EGFR突變(31例)與無基因突變(25例)患者的PD-L1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 63例肺腺癌患者胸水細胞學(xué)標(biāo)本中PD-L1的表達與臨床特征、EGFR基因突變的關(guān)系

表2 63例肺腺癌胸水細胞學(xué)標(biāo)本與配對的肺組織學(xué)標(biāo)本中PD-L1表達對比分析[n(%)]

表3 少見基因突變病理胸水細胞學(xué)標(biāo)本PD-L1的表達

3 討論

在最新肺癌診療指南[9]中，專家組一致推薦對于晚期非小細胞肺癌，與驅(qū)動基因檢測同樣重要的是PD-L1表達情況。許多晚期肺腺癌患者失去最佳手術(shù)機會，而胸水細胞學(xué)標(biāo)本因其取材方便、可重復(fù)性高，具有較高的臨床應(yīng)用價值。國外有研究證實[10-12]，細胞學(xué)涂片同樣可以應(yīng)用于PD-L1檢測。然而，本組前期預(yù)實驗對胸水細胞涂片及細胞石蠟的ICC檢測進行對比分析發(fā)現(xiàn)，涂片細胞ICC有背景著色、染色不均、相對不穩(wěn)定等缺點，而細胞蠟塊切片相對彌補了上述缺點，且聯(lián)合TTF-1和Napsin A染色可對腫瘤細胞進行定位，更易于計數(shù)、TPS評分等。此外，有研究已經(jīng)證明蠟塊存放時間越長，PD-L1表達越弱[13]，本組所有蠟塊均未經(jīng)過存放，消除了這一影響。同時，根據(jù)本實驗室經(jīng)驗，采用新鮮細胞學(xué)標(biāo)本進行肺癌多基因檢測[14]。

本實驗嚴(yán)格控制入組條件，納入研究對象均滿足ICC、IHC及分子檢測的要求。本實驗結(jié)果表明，PD-L1胸水細胞學(xué)標(biāo)本ICC檢測與肺組織IHC檢測具有高度一致性。Heymann等[15]比較了細胞學(xué)標(biāo)本和石蠟標(biāo)本中PD-L1的表達，一致性達91%，證實了細胞學(xué)標(biāo)本同樣可用于PD-L1的檢測，但只有12例標(biāo)本來自胸腔積液和心包積液。Xu等[16]的研究結(jié)果表明，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間PD-L1表達的一致性較低(Kappa值=0.455)；Zou等[5]回顧性分析了胸水細胞學(xué)石蠟標(biāo)本與配對組織學(xué)石蠟標(biāo)本的PD-L1表達，表明胸水細胞學(xué)蠟塊中PD-L1表達明顯高于配對組織學(xué)石蠟標(biāo)本，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，盡管如此，在總的組織學(xué)標(biāo)本與細胞學(xué)標(biāo)本的一致性研究中，證明了兩者的高度一致性(Kappa值=0.774)。本實驗結(jié)果表明：在PD-L1表達上，胸水細胞學(xué)標(biāo)本與組織學(xué)標(biāo)本之間的符合率較高，尤其是在肺葉切除或楔形切除標(biāo)本中，雖然EBUS-TBNA標(biāo)本與細胞學(xué)標(biāo)本的符合率僅有57.9%，考慮病例數(shù)較少的原因，但兩者間差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義。有研究[17]證實免疫微環(huán)境中的巨噬細胞和T細胞的作用可以誘導(dǎo)腫瘤細胞表達PD-L1，本實驗結(jié)果顯示，胸水細胞學(xué)標(biāo)本在PD-L1高表達組(TPS≥50%)具有更高的陽性率。作者推測免疫微環(huán)境對結(jié)果的影響起關(guān)鍵作用。

許多研究涉及PD-L1表達與肺癌臨床特征的關(guān)系，但是與EGFR優(yōu)勢人群界定不同，目前對于PD-L1高表達人群的界定仍然未達成共識。本實驗結(jié)果表明，PD-L1表達與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無關(guān)，而與吸煙史有關(guān)，吸煙患者中PD-L1呈高表達。Montero等[18]的研究納入了482例非小細胞肺癌的福爾馬林石蠟包埋標(biāo)本，證實PD-L1表達與患者年齡和性別無關(guān)，但并未分析吸煙狀態(tài)與PD-L1表達的關(guān)系。Pan等[19]評估了108 例手術(shù)切除肺鱗狀細胞癌和221例肺腺癌組織中PD-L1的表達，證實PD-L1在男性、吸煙人群中高表達。一項多中心回顧性研究[20]對189例肺癌相關(guān)基因陽性患者進行分析，表明在這些患者的相關(guān)臨床特征中，吸煙狀態(tài)最為重要，是易獲得單一的免疫抑制劑療效的預(yù)測因子，該研究也證實了KRAS基因突變患者PD-L1表達更高。

有研究表明EGFR突變患者的PD-L1陽性率低[21]，也有研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者的PD-L1表達升高[22]。Kim等[23]的研究結(jié)果亦表明，EGFR突變與PD-L1表達無相關(guān)性。這些研究均采用的是肺組織石蠟標(biāo)本。Mei等[24]利用細胞學(xué)標(biāo)本研究PD-L1表達與EGFR突變無關(guān)，同時也發(fā)現(xiàn)KRAS突變與PD-L1表達相關(guān)，即PD-L1陽性和PD-L1強陽性(≥50%)標(biāo)本中KRAS突變率高。本實驗結(jié)果亦證明，EGFR突變與PD-L1表達無關(guān)，但本組KRAS基因突變僅4例，病例數(shù)太少未進行統(tǒng)計學(xué)分析。

肺癌組織學(xué)標(biāo)本PD-L1檢測具有異質(zhì)性，這種異質(zhì)性與組織學(xué)類型可能有關(guān)，有研究表明小細胞肺癌細胞中PD-L1表達普遍存在異質(zhì)性[6]，與肺鱗狀細胞癌相比，在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中，肺腺癌PD-L1表達顯示出更高的一致性[15]。本實驗的觀察對象均為形成大量胸水的肺腺癌患者，考慮可能這類患者普遍的異質(zhì)性較低，具有較高一致性，但這一想法需要更多、更大量數(shù)據(jù)的研究進行證明。

綜上所述，肺腺癌胸水細胞學(xué)標(biāo)本中PD-L1表達與肺組織學(xué)標(biāo)本具有較高的一致性，能夠較好的反應(yīng)肺組織學(xué)標(biāo)本的PD-L1表達狀態(tài)。此外，胸水細胞學(xué)標(biāo)本檢測具有簡單、省時、微創(chuàng)、可重復(fù)的優(yōu)點。對于晚期肺腺癌患者細胞學(xué)標(biāo)本合理、有效的應(yīng)用，除了能夠預(yù)測PD-1/PD-L1藥物的療效外，還可以動態(tài)檢測PD-L1表達，從而指導(dǎo)臨床個體化治療。