楊 煉，肖 明，李 嫻，唐 怡，王婭蘭

單ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶[mono(ADP-ribosyl) transferases, mARTs]催化ADP-核糖部分從NAD+轉(zhuǎn)移到靶蛋白的精氨酸殘基，該過程稱為單ADP-核糖基化(縮寫為MARylation)，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路、細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)及基因調(diào)控[1-2]。越來越多的研究表明MARylation與炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤免疫、浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-5]。本組前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)精氨酸特異性單ADP核糖轉(zhuǎn)移酶-1(ARTC1)不僅可以通過PI3K/Akt通路促進(jìn)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26的凋亡、增殖和遷移[6-7]，還能在小鼠結(jié)直腸癌移植瘤模型中增加腫瘤微血管密度(microvessel density, MVD)[8]，提示ARTC1可能參與結(jié)直腸癌的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化、免疫熒光雙標(biāo)法檢測80例結(jié)直腸癌組織中ARTC1、VEGF和bFGF的表達(dá)，并分析三者表達(dá)的相關(guān)性，使用ARTC1競爭性抑制劑間碘芐胍(metaiodoenzylguanidine, MIBG)處理人結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞，探究能否通過抑制ARTC1來影響結(jié)直腸癌血管的生成，并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本和細(xì)胞收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2008～2016年確診的80例人結(jié)直腸癌標(biāo)本。所有病例均嚴(yán)格按照WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。高分化腺癌20例(Ⅰ級(jí))，中分化腺癌(Ⅱ級(jí))24例，低分化腺癌和黏液腺癌(Ⅲ級(jí))36例，另選取20例正常腸黏膜組織作為對(duì)照。LOVO細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)系提供。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚切片。免疫組化染色采用EnVision法。一抗ARTC1(SC-20255)購自美國Santa Cruz公司，VEGF(sc-7269)，購自北京中杉金橋公司，bFGF和CD34(bs-0217R)購自北京博奧森公司。免疫組化操作步驟嚴(yán)格按照檢測試劑盒(上?；蚩萍脊?說明書進(jìn)行。每張切片觀察10個(gè)區(qū)域，中倍鏡下(200×)計(jì)數(shù)100～500個(gè)腫瘤細(xì)胞，取平均陽性細(xì)胞百分比作為該切片的陽性百分比：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。染色強(qiáng)度：未著色為0分，黃色為1分，棕色為2分，深棕色為3分；將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：0分為(-)，1～3分為(+)，4～5分為(2+)，6分為(3+)。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.2.2免疫熒光雙標(biāo) Cy3標(biāo)記的兔抗山羊IgG、FITc標(biāo)記的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG(北京博奧森公司)按1 ∶100比例稀釋，常規(guī)免疫熒光雙染后共聚焦激光掃描顯微鏡下觀測。FITc標(biāo)記抗體在525 nm光波下激發(fā)并示綠色熒光；Cy3標(biāo)記抗體在570 nm光波下激發(fā)并示紅色熒光，Emage-Pro Express軟件進(jìn)行圖像疊加處理。

1.2.3MVD評(píng)估 低倍鏡下(40×)選擇5個(gè)微血管數(shù)量最多區(qū)域，高倍鏡下(400×)每區(qū)域計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取每視野最大血管計(jì)數(shù)，取每個(gè)區(qū)域的平均血管數(shù)。

1.2.4流式細(xì)胞分析 RPEI-1640(Gibco公司)與10%胎牛血清按9 ∶1比例配置，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培育。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞加入終濃度為50 μmol/L的MIBG(Sigma公司)，對(duì)照組加入等體積生理鹽水。收集LOVO細(xì)胞，PBS洗滌3次，70%乙醇固定。常規(guī)細(xì)胞熒光染色步驟行熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)1×106個(gè)細(xì)胞中的抗體標(biāo)記陽性細(xì)胞，重復(fù)3次。

1.2.5Western blot法 LOVO細(xì)胞PBS洗滌離心。裂解緩沖液中冰上裂解10 min。BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF。5%牛奶室溫封閉2 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜，0.1%TEST洗膜后加入相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜后發(fā)光劑顯影(Chemilmager 5500成像系統(tǒng))。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中ARTC1、VEGF和bFGF的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，ARTC1、VEGF和bFGF表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜(圖1～3)。結(jié)直腸癌組織中ARTC1、VEGF、bFGF陽性率分別為71.3%(57/80)、85%(68/80)、65%(52/80)，陽性率和表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于正常腸黏膜組織(P<0.05，表1)。

表1 結(jié)直腸癌組織和正常腸黏膜組織中ARTC1、VEGF、bFGF的表達(dá)[n(%)]

圖1 A．ARTC1在正常腸黏膜組織中陰性；B．ARTC1在結(jié)直腸癌組織中陽性，陽性定位于包膜及胞質(zhì)，EnVision法 圖2 A．VEGF在正常腸黏膜組織中陰性；B．VEGF在結(jié)直腸癌組織中陽性，陽性定位于包膜及胞質(zhì)，EnVision法 圖3 A．bFGF在正常腸黏膜組織中陰性；B．bFGF在結(jié)直腸癌組織中陽性，陽性定位于包膜及胞質(zhì)，EnVision法

ARTC1、VEGF和bFGF表達(dá)在患者年齡、性別和病理分級(jí)上差異均無顯著性。有漿膜浸潤和(或)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組ARTC1的陽性率較高，但與無漿膜浸潤和(或)無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比差異無顯著性。有漿膜浸潤組中VEGF和bFGF陽性率較高，分別達(dá)93%和90%，與無漿膜浸潤組相比差異有顯著性(P<0.05，表2)。

表2 ARTC1、VEGF、bFGF表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性

2.2 免疫熒光雙標(biāo)檢測結(jié)果ARTC1顯示紅色熒光，位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜；VEGF和bFGF顯示綠色熒光，位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)；ARTC1+VEGF和ARTC1+bFGF共表達(dá)顯示橙色熒光(圖4)。ARTC1、VEGF、bFGF的陽性率分別為72.5%(58/80)、82.5%(66/80)、82.5%(66/80)。正常腸黏膜組織中幾乎無熒光顯示。ARTC1+VEGF共表達(dá)51例，ARTC1+bFGF共表達(dá)44例。相關(guān)性分析顯示，ARTC1與VEGF、bFGF的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05，表3)。

圖4 ARTC1、VEGF和bFGF免疫熒光染色顯示強(qiáng)表達(dá)，表達(dá)部位位于腫瘤細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)：A.ARTC1強(qiáng)表達(dá)；B.ARTC1+VEGF共表達(dá)；C.ARTC1+bFGF共表達(dá)

表3 結(jié)直腸癌中ARTC1與VEGF、bFGF表達(dá)的相關(guān)性分析

2.3 MVD評(píng)估高M(jìn)VD區(qū)域增生的微血管大多為實(shí)心的血管內(nèi)皮細(xì)胞條索，尚無明顯管腔形成。低MVD區(qū)域血管腔圓形或橢圓形，管壁薄，形狀較規(guī)則且數(shù)量少(圖5)。與正常腸黏膜組織相比，結(jié)直腸癌組織中MVD明顯增加(4.5±2.0，P<0.01)，并且在ARTC1+VEGF和ARTC1+bFGF共表達(dá)的情況下增加最明顯(25.4±8.3、22.3±5.9)，而ARTC1+VEGF及ARTC1+bFGF非共表達(dá)組(16.8±4.5、14.8±2.5)的MVD顯著低于共表達(dá)組(P<0.01)。

圖5 CD34在結(jié)直腸癌組織及正常腸黏膜組織中的表達(dá)：A.結(jié)直腸癌組織高M(jìn)VD；B.正常腸黏膜組織低MVD，EnVision法

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MIBG對(duì)ARTC1、VEGF和bFGF表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)組LOVO細(xì)胞中bFGF、VEGF陽性細(xì)胞分別占99.5%和91.38%，加入抑制劑MIBG(50 μmol/L)后，LOVO細(xì)胞中bFGF、VEGF陽性細(xì)胞比例分別下降為72.84%、33.45%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而ARTC1陽性細(xì)胞百分比無明顯變化(P>0.05，圖6)。

圖6 MIBG對(duì)ARTC1、VEGF和bFGF表達(dá)的影響：A.MIBG處理前后LOVO細(xì)胞ARTC1、VEGF和bFGF的熒光表達(dá)；B.用生理鹽水或MIBG(50 μmol/L)處理后LOVO細(xì)胞中陽性細(xì)胞百分比

2.5 Western blot法檢測MIBG對(duì)ARTC1、VEGF和bFGF表達(dá)的影響MIBG處理前的LOVO細(xì)胞VEGF(1.19±0.025)、bFGF(1.18±0.048)蛋白表達(dá)水平與MIBG處理后VEGF(0.71±0.053)、bFGF(0.58±0.033)相比，表達(dá)明顯減弱，差異有顯著性(P<0.01)，而ARTC1蛋白表達(dá)水平經(jīng)MIBG處理前后差異無顯著性(P>0.05，圖7)。

圖7 Western blot法檢測LOVO細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和LOVO細(xì)胞MIBG抑制組中ARTC1、VEGF和bFGF的表達(dá)

3 討論

眾所周知，結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌多種生長因子誘導(dǎo)血管生成，是其浸潤和轉(zhuǎn)移的重要原因。其中VEGF和bFGF是最有效的血管生成刺激劑，因此對(duì)VEGF及bFGF聯(lián)合靶向抑制有利于抗腫瘤血管生成的治療。VEGF的同種型和受體已被美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于腫瘤血管生成阻斷療法，但由于VEGF過表達(dá)驅(qū)動(dòng)的新生血管顯示出結(jié)構(gòu)和功能缺陷，導(dǎo)致灌注不良及腫瘤缺氧狀態(tài)，使抗腫瘤藥物作用受限[9-10]。bFGF與其內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合后，可直接促進(jìn)體外和體內(nèi)血管生成[11]。在體外實(shí)驗(yàn)中分離出結(jié)腸癌中的內(nèi)皮細(xì)胞，沉默或敲除內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF基因，下調(diào)VEGF的表達(dá)，導(dǎo)致bFGF的表達(dá)顯著上調(diào)，證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞存在bFGF依賴性補(bǔ)償分泌和潛在的自我調(diào)節(jié)機(jī)制，因此bFGF被認(rèn)為是抗腫瘤血管生成耐藥的重要原因[12]。

ARTC1可催化MARylation并通過不同的路徑參與和控制炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。ARTC1的靶蛋白包括integrinα7、αL(CD11a)、β2(CD18)、NP-1、bFGF、PDGF-BB及Grp78/Bi等[13-16]。ARTC1在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)并且可降低U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)長春新堿的敏感性[17]。在肺癌相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)肺癌A549細(xì)胞中存在ARTC1的高表達(dá)，并且當(dāng)該細(xì)胞受人Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)刺激時(shí)，ARTC1和ARTC4的表達(dá)上調(diào)，提示在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中MARylation可能具有重要作用[18]。本組前期實(shí)驗(yàn)顯示，結(jié)直腸腺癌和正常結(jié)直腸組織中均存在MARylation，但結(jié)直腸癌中MARylation的總體水平顯著高于正常結(jié)直腸組織，且其與腫瘤侵襲深度有關(guān)，表明MARylation參與結(jié)直腸癌的發(fā)展[19]。人結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞中H3R117的MARylation參與調(diào)控癌基因甲基化并促進(jìn)腫瘤生存，意味著MARylation可能通過影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展[20-21]。并且當(dāng)ARTC1基因沉默時(shí)，可通過RHOA/ROCK通路抑制小鼠腸癌細(xì)胞CT26的遷移，下調(diào)癌基因c-fos和c-myc等的表達(dá)從而抑制CT26細(xì)胞的增殖，也可能通過抑制PI3K/Akt/NF-κB通路促進(jìn)小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞的凋亡[6-7]。敲低ARTC1還可刺激饑餓誘導(dǎo)的自噬抑制CT26細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。本實(shí)驗(yàn)分析了結(jié)直腸癌組織中ARTC1的表達(dá)與腫瘤微血管形成的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ARTC1表達(dá)升高與VEGF和bFGF的高表達(dá)呈正相關(guān)，而ARTC1、VEGF和bFGF高表達(dá)伴腫瘤MVD增高，促進(jìn)了漿膜浸潤，提示MARylation可能參與調(diào)節(jié)VEGF和bFGF的翻譯后修飾，影響腫瘤血管生成，但其具體機(jī)制仍不清楚。

MIBG是一種小分子精氨酸的類似物，可競爭性地與ARTC1相結(jié)合抑制MARylation，能夠阻止人類骨骼肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和增殖，其機(jī)制可能是通過抑制MARylation，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響c-fos基因的轉(zhuǎn)錄[23-24]。在對(duì)腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)MIBG可呈劑量依賴性抑制胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤STC-1細(xì)胞株的增殖能力，通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位的變化、Caspase-3的活化及DNA片段誘導(dǎo)STC-1細(xì)胞毒性和生長抑制[25]。MIBG還能下調(diào)干擾素α7β1、FAK和PI3K的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的遷移和分裂[26]。這些研究結(jié)果也直接或間接地證實(shí)了MARylation可能作用于多種生長因子和信號(hào)通路蛋白，在炎癥和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測MIBG處理前后LOVO細(xì)胞中ARTC1、VEGF和bFGF的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)ARTC1抑制可下調(diào)VEGF和bFGF的合成與表達(dá)，提示ARTC1可能成為聯(lián)合抑制VEGF和bFGF的潛在靶點(diǎn)，為抑制結(jié)腸癌組織微血管生成藥物研究提供初步理論依據(jù)。