楊 煉，肖 明，李 嫻，唐 怡，王婭蘭

單ADP-核糖基轉移酶[mono(ADP-ribosyl) transferases, mARTs]催化ADP-核糖部分從NAD+轉移到靶蛋白的精氨酸殘基，該過程稱為單ADP-核糖基化(縮寫為MARylation)，參與細胞內信號通路、細胞增殖、DNA修復及基因調控[1-2]。越來越多的研究表明MARylation與炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤免疫、浸潤轉移密切相關[3-5]。本組前期實驗已發(fā)現精氨酸特異性單ADP核糖轉移酶-1(ARTC1)不僅可以通過PI3K/Akt通路促進小鼠結腸癌細胞CT26的凋亡、增殖和遷移[6-7]，還能在小鼠結直腸癌移植瘤模型中增加腫瘤微血管密度(microvessel density, MVD)[8]，提示ARTC1可能參與結直腸癌的生長、侵襲和轉移。

本實驗采用免疫組化、免疫熒光雙標法檢測80例結直腸癌組織中ARTC1、VEGF和bFGF的表達，并分析三者表達的相關性，使用ARTC1競爭性抑制劑間碘芐胍(metaiodoenzylguanidine, MIBG)處理人結直腸癌LOVO細胞，探究能否通過抑制ARTC1來影響結直腸癌血管的生成，并對其可能機制進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 標本和細胞收集重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科2008～2016年確診的80例人結直腸癌標本。所有病例均嚴格按照WHO標準進行分類。高分化腺癌20例(Ⅰ級)，中分化腺癌(Ⅱ級)24例，低分化腺癌和黏液腺癌(Ⅲ級)36例，另選取20例正常腸黏膜組織作為對照。LOVO細胞由重慶醫(yī)科大學病理生理學系提供。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚切片。免疫組化染色采用EnVision法。一抗ARTC1(SC-20255)購自美國Santa Cruz公司，VEGF(sc-7269)，購自北京中杉金橋公司，bFGF和CD34(bs-0217R)購自北京博奧森公司。免疫組化操作步驟嚴格按照檢測試劑盒(上?；蚩萍脊?說明書進行。每張切片觀察10個區(qū)域，中倍鏡下(200×)計數100～500個腫瘤細胞，取平均陽性細胞百分比作為該切片的陽性百分比：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。染色強度：未著色為0分，黃色為1分，棕色為2分，深棕色為3分；將兩項得分結果相加：0分為(-)，1～3分為(+)，4～5分為(2+)，6分為(3+)。用PBS代替一抗作為陰性對照，用陽性切片作為陽性對照。

1.2.2免疫熒光雙標 Cy3標記的兔抗山羊IgG、FITc標記的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG(北京博奧森公司)按1 ∶100比例稀釋，常規(guī)免疫熒光雙染后共聚焦激光掃描顯微鏡下觀測。FITc標記抗體在525 nm光波下激發(fā)并示綠色熒光；Cy3標記抗體在570 nm光波下激發(fā)并示紅色熒光，Emage-Pro Express軟件進行圖像疊加處理。

1.2.3MVD評估 低倍鏡下(40×)選擇5個微血管數量最多區(qū)域，高倍鏡下(400×)每區(qū)域計數5個視野，取每視野最大血管計數，取每個區(qū)域的平均血管數。

1.2.4流式細胞分析 RPEI-1640(Gibco公司)與10%胎牛血清按9 ∶1比例配置，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培育。取對數生長期細胞加入終濃度為50 μmol/L的MIBG(Sigma公司)，對照組加入等體積生理鹽水。收集LOVO細胞，PBS洗滌3次，70%乙醇固定。常規(guī)細胞熒光染色步驟行熒光標記，流式細胞儀計數1×106個細胞中的抗體標記陽性細胞，重復3次。

1.2.5Western blot法 LOVO細胞PBS洗滌離心。裂解緩沖液中冰上裂解10 min。BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白并轉移到PVDF。5%牛奶室溫封閉2 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜，0.1%TEST洗膜后加入相應的二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜后發(fā)光劑顯影(Chemilmager 5500成像系統(tǒng))。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件進行Wilcoxon秩和檢驗、χ2檢驗及Spearman相關性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織中ARTC1、VEGF和bFGF的表達免疫組化結果顯示，ARTC1、VEGF和bFGF表達定位于細胞質和細胞膜(圖1～3)。結直腸癌組織中ARTC1、VEGF、bFGF陽性率分別為71.3%(57/80)、85%(68/80)、65%(52/80)，陽性率和表達強度均明顯高于正常腸黏膜組織(P<0.05，表1)。

表1 結直腸癌組織和正常腸黏膜組織中ARTC1、VEGF、bFGF的表達[n(%)]

圖1 A．ARTC1在正常腸黏膜組織中陰性；B．ARTC1在結直腸癌組織中陽性，陽性定位于包膜及胞質，EnVision法 圖2 A．VEGF在正常腸黏膜組織中陰性；B．VEGF在結直腸癌組織中陽性，陽性定位于包膜及胞質，EnVision法 圖3 A．bFGF在正常腸黏膜組織中陰性；B．bFGF在結直腸癌組織中陽性，陽性定位于包膜及胞質，EnVision法

ARTC1、VEGF和bFGF表達在患者年齡、性別和病理分級上差異均無顯著性。有漿膜浸潤和(或)淋巴結轉移組ARTC1的陽性率較高，但與無漿膜浸潤和(或)無淋巴結轉移組相比差異無顯著性。有漿膜浸潤組中VEGF和bFGF陽性率較高，分別達93%和90%，與無漿膜浸潤組相比差異有顯著性(P<0.05，表2)。

表2 ARTC1、VEGF、bFGF表達與結直腸癌臨床病理特征的相關性

2.2 免疫熒光雙標檢測結果ARTC1顯示紅色熒光，位于腫瘤細胞胞質和胞膜；VEGF和bFGF顯示綠色熒光，位于腫瘤細胞胞質；ARTC1+VEGF和ARTC1+bFGF共表達顯示橙色熒光(圖4)。ARTC1、VEGF、bFGF的陽性率分別為72.5%(58/80)、82.5%(66/80)、82.5%(66/80)。正常腸黏膜組織中幾乎無熒光顯示。ARTC1+VEGF共表達51例，ARTC1+bFGF共表達44例。相關性分析顯示，ARTC1與VEGF、bFGF的表達呈正相關(P<0.05，表3)。

圖4 ARTC1、VEGF和bFGF免疫熒光染色顯示強表達，表達部位位于腫瘤細胞胞膜及胞質：A.ARTC1強表達；B.ARTC1+VEGF共表達；C.ARTC1+bFGF共表達

表3 結直腸癌中ARTC1與VEGF、bFGF表達的相關性分析

2.3 MVD評估高MVD區(qū)域增生的微血管大多為實心的血管內皮細胞條索，尚無明顯管腔形成。低MVD區(qū)域血管腔圓形或橢圓形，管壁薄，形狀較規(guī)則且數量少(圖5)。與正常腸黏膜組織相比，結直腸癌組織中MVD明顯增加(4.5±2.0，P<0.01)，并且在ARTC1+VEGF和ARTC1+bFGF共表達的情況下增加最明顯(25.4±8.3、22.3±5.9)，而ARTC1+VEGF及ARTC1+bFGF非共表達組(16.8±4.5、14.8±2.5)的MVD顯著低于共表達組(P<0.01)。

圖5 CD34在結直腸癌組織及正常腸黏膜組織中的表達：A.結直腸癌組織高MVD；B.正常腸黏膜組織低MVD，EnVision法

2.4 流式細胞術檢測MIBG對ARTC1、VEGF和bFGF表達的影響實驗組LOVO細胞中bFGF、VEGF陽性細胞分別占99.5%和91.38%，加入抑制劑MIBG(50 μmol/L)后，LOVO細胞中bFGF、VEGF陽性細胞比例分別下降為72.84%、33.45%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而ARTC1陽性細胞百分比無明顯變化(P>0.05，圖6)。

圖6 MIBG對ARTC1、VEGF和bFGF表達的影響：A.MIBG處理前后LOVO細胞ARTC1、VEGF和bFGF的熒光表達；B.用生理鹽水或MIBG(50 μmol/L)處理后LOVO細胞中陽性細胞百分比

2.5 Western blot法檢測MIBG對ARTC1、VEGF和bFGF表達的影響MIBG處理前的LOVO細胞VEGF(1.19±0.025)、bFGF(1.18±0.048)蛋白表達水平與MIBG處理后VEGF(0.71±0.053)、bFGF(0.58±0.033)相比，表達明顯減弱，差異有顯著性(P<0.01)，而ARTC1蛋白表達水平經MIBG處理前后差異無顯著性(P>0.05，圖7)。

圖7 Western blot法檢測LOVO細胞實驗組和LOVO細胞MIBG抑制組中ARTC1、VEGF和bFGF的表達

3 討論

眾所周知，結直腸癌細胞分泌多種生長因子誘導血管生成，是其浸潤和轉移的重要原因。其中VEGF和bFGF是最有效的血管生成刺激劑，因此對VEGF及bFGF聯(lián)合靶向抑制有利于抗腫瘤血管生成的治療。VEGF的同種型和受體已被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于腫瘤血管生成阻斷療法，但由于VEGF過表達驅動的新生血管顯示出結構和功能缺陷，導致灌注不良及腫瘤缺氧狀態(tài)，使抗腫瘤藥物作用受限[9-10]。bFGF與其內皮細胞上的受體結合后，可直接促進體外和體內血管生成[11]。在體外實驗中分離出結腸癌中的內皮細胞，沉默或敲除內皮細胞的VEGF基因，下調VEGF的表達，導致bFGF的表達顯著上調，證實血管內皮細胞存在bFGF依賴性補償分泌和潛在的自我調節(jié)機制，因此bFGF被認為是抗腫瘤血管生成耐藥的重要原因[12]。

ARTC1可催化MARylation并通過不同的路徑參與和控制炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。ARTC1的靶蛋白包括integrinα7、αL(CD11a)、β2(CD18)、NP-1、bFGF、PDGF-BB及Grp78/Bi等[13-16]。ARTC1在膠質瘤中高表達并且可降低U251膠質母細胞瘤細胞對長春新堿的敏感性[17]。在肺癌相關研究中發(fā)現肺癌A549細胞中存在ARTC1的高表達，并且當該細胞受人Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)刺激時，ARTC1和ARTC4的表達上調，提示在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中MARylation可能具有重要作用[18]。本組前期實驗顯示，結直腸腺癌和正常結直腸組織中均存在MARylation，但結直腸癌中MARylation的總體水平顯著高于正常結直腸組織，且其與腫瘤侵襲深度有關，表明MARylation參與結直腸癌的發(fā)展[19]。人結直腸癌LOVO細胞中H3R117的MARylation參與調控癌基因甲基化并促進腫瘤生存，意味著MARylation可能通過影響染色質的結構和動態(tài)促進結直腸癌的發(fā)展[20-21]。并且當ARTC1基因沉默時，可通過RHOA/ROCK通路抑制小鼠腸癌細胞CT26的遷移，下調癌基因c-fos和c-myc等的表達從而抑制CT26細胞的增殖，也可能通過抑制PI3K/Akt/NF-κB通路促進小鼠結直腸癌CT26細胞的凋亡[6-7]。敲低ARTC1還可刺激饑餓誘導的自噬抑制CT26細胞生長并促進細胞凋亡[22]。本實驗分析了結直腸癌組織中ARTC1的表達與腫瘤微血管形成的關系，發(fā)現ARTC1表達升高與VEGF和bFGF的高表達呈正相關，而ARTC1、VEGF和bFGF高表達伴腫瘤MVD增高，促進了漿膜浸潤，提示MARylation可能參與調節(jié)VEGF和bFGF的翻譯后修飾，影響腫瘤血管生成，但其具體機制仍不清楚。

MIBG是一種小分子精氨酸的類似物，可競爭性地與ARTC1相結合抑制MARylation，能夠阻止人類骨骼肌細胞、血管平滑肌細胞和子宮內膜細胞的遷移和增殖，其機制可能是通過抑制MARylation，調節(jié)細胞信號轉導通路，影響c-fos基因的轉錄[23-24]。在對腫瘤的研究中發(fā)現MIBG可呈劑量依賴性抑制胃腸道神經內分泌腫瘤STC-1細胞株的增殖能力，通過調節(jié)線粒體膜電位的變化、Caspase-3的活化及DNA片段誘導STC-1細胞毒性和生長抑制[25]。MIBG還能下調干擾素α7β1、FAK和PI3K的表達抑制肝癌細胞株HepG2細胞的遷移和分裂[26]。這些研究結果也直接或間接地證實了MARylation可能作用于多種生長因子和信號通路蛋白，在炎癥和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

本實驗通過檢測MIBG處理前后LOVO細胞中ARTC1、VEGF和bFGF的表達變化，發(fā)現ARTC1抑制可下調VEGF和bFGF的合成與表達，提示ARTC1可能成為聯(lián)合抑制VEGF和bFGF的潛在靶點，為抑制結腸癌組織微血管生成藥物研究提供初步理論依據。