賈 茹，王 理

胃癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤。2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，病死率居第3位[1]。缺氧是典型的實(shí)體瘤微環(huán)境，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。含有內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域的蛋白1(endothelial PAS domain protein 1, EPAS1)，又稱為缺氧誘導(dǎo)因子2-α(hypoxia-inducible factor-2α, HIF-2α)，HIF的α亞基，可介導(dǎo)細(xì)胞和全身對(duì)缺氧的反應(yīng)[3]。EPAS1在許多缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄中具有重要作用，研究顯示EPAS1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。因此，本文采用免疫組化法檢測胃癌組織中EPAS1的表達(dá)，探討其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系及意義。

1 材料與方法

1.1 材料從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取375例胃癌患者的臨床數(shù)據(jù)，其中男性241例，女性134例；年齡58～74歲，平均(69.54±5.42)歲；腫瘤TNM分期：Ⅰ期76例，Ⅱ期111例，Ⅲ期150例，Ⅳ期38例。

選取2019年1月～2020年1月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院收治的95例經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的胃癌標(biāo)本。所有患者通過電話或門診隨訪，截至日期2022年1月30日。其中男性67例，女性28例；年齡28～94歲，平均(62.62±10.23)歲。同時(shí)收集上述病例的癌旁組織和50例內(nèi)鏡下腺瘤組織作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)合術(shù)后病理明確診斷為原發(fā)性胃癌。(2)行ESD手術(shù)或D2胃癌根治術(shù)。(3)術(shù)后生存時(shí)間≥3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他類型惡性腫瘤。(2)既往罹患腫瘤或自身免疫系統(tǒng)疾病。(3)術(shù)前接受新輔助化療。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核，患者均知情同意。

1.2 主要試劑與儀器10%中性福爾馬林、蘇木精購自寧波同盛公司，DAB購自北京中杉金橋公司，anti-EPAS1抗體購自賽默飛世爾公司，生物組織包埋機(jī)及熒光倒置生物顯微鏡購自徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析 (1)下載后的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，使用經(jīng)Toil流程統(tǒng)一處理的FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)log2轉(zhuǎn)化后獲得。(2)臨床相關(guān)性及預(yù)后分析：將數(shù)據(jù)庫中HTSeq-FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成TPM格式，并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后獲得。(3)從數(shù)據(jù)庫中獲取腫瘤分期、轉(zhuǎn)移及生存情況等臨床信息，使用R語言(http://www.r-project.org/)進(jìn)行操作。

1.3.2臨床數(shù)據(jù)收集 收集患者年齡、性別、體重指數(shù)(body mass index, BMI)、基礎(chǔ)疾病、HP感染、腫瘤位置、浸潤深度、脈管侵犯、N分期、M分期、TNM分期、組織學(xué)類型、分化程度、手術(shù)方式、住院時(shí)間、總生存期(overall survival, OS)、無進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)。其中TNM分期依據(jù)AJCC分期手冊(cè)(第8版)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[5]，OS是指患者從術(shù)后開始至死亡或失訪時(shí)間。

1.3.3免疫組化 免疫組化染色使用SP法。將5 μm厚石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10 min，置于100%、95%、90%、80%、70%乙醇中各5 min進(jìn)行脫水，在煮沸的蒸餾水中加熱15 min。室溫下用含10%血清的封閉溶液封閉1 h，加入EPAS1抗體，4 ℃ 孵育過夜。滴加二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后脫水封固，顯微鏡下觀察。

標(biāo)本由2名病理醫(yī)師對(duì)染色強(qiáng)度和染色范圍進(jìn)行半定量評(píng)分，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無著色為0分、弱著色為1分、中度著色為2分、強(qiáng)著色為3分；根據(jù)細(xì)胞核陽性染色百分比進(jìn)行評(píng)分：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>76%為4分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘作為最終評(píng)分：0～6分為低表達(dá)組；>6分為高表達(dá)組[6]。

1.3.4細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞AGS、HGC-27、MGC-803、SGC-7901和人正常胃黏膜GES-1細(xì)胞系均由消化腫瘤中心贈(zèng)送，并儲(chǔ)存在我院臨床實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)均使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3.5qRT-PCR法 按照qRT-PCR試劑盒操作說明書配置PCR反應(yīng)體系。使用HiScript III RT SuperMix將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)，所有引物均由北京擎科生物公司設(shè)計(jì)和合成。通過定量實(shí)時(shí)RCR擴(kuò)增目標(biāo)cDNA，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。循環(huán)條件：95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。用actin作為內(nèi)參。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)mRNA表達(dá)。EPAS1引物序列：上游5′-CGGAGGTGTTCTA TGAGCTGG-3′；下游5′-AGCTTGTGTGTTCGCAGG AA-3′；actin引物序列：上游5′-CATGTACGTTGCT ATCCAGGC-3′；下游5′-CTCCTTAATGTCACGCAC GAT-3′

1.3.6Western blot法 將組織加入含1%蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液，冰上裂解30 min，在4 ℃ 下12 000g離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新1.5 mL EP管中；將20 μg的待測蛋白和10 μL蛋白marker加入上樣孔，在配置好的10%SDS PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離，隨后在200 mA、1 h條件下，冰盒內(nèi)將蛋白樣品電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，Western blot封閉液室溫下?lián)u床封閉1 h，4 ℃下anti-EPAS1抗體孵育過夜，IgG二抗在室溫下?lián)u床上孵育1 h，使用敏感的ECL試劑盒測量免疫反應(yīng)條帶。

2 結(jié)果

2.1 胃癌中EPAS1的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示：胃癌組織中EPAS1 mRNA表達(dá)顯著高于正常胃黏膜組織(P<0.05，圖1A)，EPAS1 mRNA低表達(dá)組患者的OS和PFS均高于EPAS1高表達(dá)組，表明患者預(yù)后較好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B、C)。

圖1 胃癌中EPAS1的表達(dá)以及預(yù)后分析：A.TCGA數(shù)據(jù)庫分析胃癌組織中EPAS1 mRNA的表達(dá)，*P<0.05；B.TCGA數(shù)據(jù)庫分析EPAS1表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系；C.TCGA數(shù)據(jù)庫分析EPAS1表達(dá)與患者無進(jìn)展生存期的關(guān)系

2.2 胃癌和癌旁組織中EPAS1的表達(dá)免疫組化及免疫熒光結(jié)果顯示：EPAS1主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，胃癌組織中EPAS1的免疫組化表達(dá)得分顯著高于癌旁、腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.213、10.691，P<0.05)。癌旁組織中EPAS1的免疫組化表達(dá)得分亦顯著高于腺瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.187，P<0.05，表1，圖2)。通過qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞中EPAS1 mRNA和蛋白表達(dá)也證明，胃癌細(xì)胞系中EPAS1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著高于正常胃黏膜細(xì)胞GSE-1(圖3)。

圖2 胃癌、癌旁和腺瘤組織中EPAS1的表達(dá)：A.腺瘤組織中EPAS1不表達(dá)；B.癌旁組織中EPAS1不表達(dá)；C.胃癌組織中EPAS1高表達(dá)；D.胃癌組織中EPAS1低表達(dá)，SP法

圖3 轉(zhuǎn)錄(A)和翻譯(B)水平驗(yàn)證EPAS1在不同胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平：**P<0.01；***P<0.001

表1 胃癌、癌旁、腺瘤組織中EPAS1的表達(dá)

與癌旁組織、腺瘤組織相比，*P<0.001

2.3 胃癌組織中EPAS1表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系胃癌中EPAS1高表達(dá)58例，低表達(dá)37例，分析EPAS1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系顯示：EPAS1表達(dá)與患者年齡、性別、BMI、基礎(chǔ)疾病、腫瘤位置、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織學(xué)類型、手術(shù)方式無關(guān)(P均>0.05，表2)。浸潤深度T3、T4以及低分化組EPAS1的表達(dá)水平顯著增高(t=3.138、2.275，P<0.05，圖4)。高表達(dá)組侵犯漿膜及漿膜下結(jié)締組織的比例顯著高于低表達(dá)組(χ2=9.63，P=0.022)，且低分化的比例顯著高于低表達(dá)組(χ2=4.25，P=0.039)，且EPAS1高表達(dá)組的OS均顯著低于EPAS1低表達(dá)組(t=7.149，P<0.001，圖5)。Cox單因素及多因素分析結(jié)果顯示：EPAS1表達(dá)(HR：2.095，95%CI：1.019～4.307，P<0.001)是OS的獨(dú)立預(yù)測因子(表3)。

圖4 EPAS1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性：A.不同T分期胃癌中EPAS1的表達(dá)，**P<0.01；B.不同分化程度胃癌中EPAS1的表達(dá),***P<0.001

圖5 EPAS1不同表達(dá)組胃癌患者的預(yù)后分析

表2 EPAS1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表3 Cox單因素及多因素回歸分析

3 討論

轉(zhuǎn)錄復(fù)合物HIF作為氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)器，不同靶點(diǎn)的HIF-α異構(gòu)體可以通過多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)節(jié)腫瘤對(duì)缺氧的反應(yīng)[7]。其中EPAS1在細(xì)胞對(duì)長時(shí)間低氧的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，不僅可以參與鐵代謝，還通過對(duì)糖酵解酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)降低耗氧量[8]。盡管最近研究發(fā)現(xiàn)EPAS1在消化道腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮作用[9]，但在胃癌中的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過TCGA數(shù)據(jù)庫和臨床標(biāo)本分析EPAS1表達(dá)以及與預(yù)后和臨床病理特征的相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫和臨床樣本的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，與腺瘤組織相比，胃癌組織中EPAS1顯著高表達(dá)，并且表達(dá)多位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中。與HIF-1α在所有細(xì)胞中普遍表達(dá)不同，EPAS1具有一定的組織特異性，僅在特定組織類型中表達(dá)，如內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中[10-11]。當(dāng)發(fā)生缺氧時(shí)，EPAS1的α亞基穩(wěn)定并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與HIF-1β形成異源二聚體，并結(jié)合靶基因調(diào)控元件內(nèi)的缺氧反應(yīng)元件識(shí)別缺氧反應(yīng)。因此，既往研究也證實(shí)EPAS1在缺氧誘導(dǎo)時(shí)主要位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中[12]。

為進(jìn)一步探索EPAS1與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性，本組分析TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示：EPAS1表達(dá)上調(diào)與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)，臨床數(shù)據(jù)也進(jìn)一步證實(shí)EPAS1高表達(dá)胃癌患者的總生存率顯著低于EPAS1低表達(dá)組，這些結(jié)果均表明EPAS1可能是胃癌患者的預(yù)后標(biāo)志物。多項(xiàng)研究報(bào)道腫瘤組織中EPAS1的mRNA和蛋白質(zhì)水平均高表達(dá)，并且與不同腫瘤類型的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[13-14]。在腫瘤微環(huán)境中，由于不規(guī)則毛細(xì)血管的形成，血流緩慢，但由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖，腫瘤細(xì)胞需氧量增加導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部缺氧，通過激活基因表達(dá)程序，誘發(fā)EPAS1啟動(dòng)細(xì)胞對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)[15]。此外，EPAS1可能會(huì)招募SP1轉(zhuǎn)錄因子和其他輔因子形成“EPAS1增強(qiáng)分子”，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄發(fā)生[16]。EPAS1表達(dá)與胃癌臨床病理特征相關(guān)性分析顯示：EPAS1高表達(dá)與原發(fā)灶深度浸潤和低分化程度顯著相關(guān)。

綜上，EPAS1可能是胃癌患者的預(yù)后標(biāo)志物，并且與原發(fā)灶浸潤和分化程度顯著相關(guān)。同時(shí)本研究存在一些局限性：首先，本實(shí)驗(yàn)為單中心回顧性研究，樣本量相對(duì)較少，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大研究證實(shí)該結(jié)論。其次，本研究中僅使用了石蠟切片，檢測EPAS1 mRNA表達(dá)水平的能力有限，仍需收集新鮮組織標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。