陳 靜，曹立宇，白真真，溫奕巽，王 玥

結(jié)直腸腺癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤的第3位和第2位[1]。目前，結(jié)直腸腺癌的治療首選手術(shù)切除并輔以化療、放療、靶向治療和免疫治療等，部分患者行規(guī)范化治療后仍會(huì)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移可能與多倍體腫瘤巨細(xì)胞(polyploid giant cancer cells, PGCCs)的形成有關(guān)[3]。PGCCs是指細(xì)胞核大小至少是常規(guī)癌細(xì)胞的3倍或至少有3個(gè)核的細(xì)胞[4]。應(yīng)用結(jié)直腸腺癌一線化療藥奧沙利鉑誘導(dǎo)PGCCs并研究其分子機(jī)制有望突破結(jié)直腸腺癌的臨床治療難題。βⅡ-血影蛋白1(spectrin beta chain, non-erythrocytic 1, SPTBN1)是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，研究發(fā)現(xiàn)SPTBN1與多種癌癥相關(guān)，并且SPRBN1的表達(dá)和功能在不同腫瘤階段或類型之間存在差異[5]。SPTBN1在肝細(xì)胞癌、肺癌和胰腺癌中的表達(dá)下降，SPTBN1表達(dá)降低可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-8]。然而，SPTBN1是否調(diào)控結(jié)直腸腺癌的惡性進(jìn)展，目前尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)著重探討SPTBN1對(duì)結(jié)直腸腺癌細(xì)胞及其PGCCs生物學(xué)行為的影響，期望為臨床治療結(jié)直腸腺癌提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年12月～2022年3月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽(yáng)醫(yī)院存檔的結(jié)直腸腺癌組織及配對(duì)癌旁正常組織樣本(距癌組織>2 cm)10例，樣本均經(jīng)病理檢查確診。其中男性6例，女性4例?；颊咝g(shù)前均未接受放療、化療及其他治療。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)信息應(yīng)用UALCAN、GEPIA、TCGA portal和CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)分析SPTBN1在泛癌和結(jié)直腸腺癌中mRNA及蛋白的表達(dá)；應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter、PrognoScan和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)探索SPTBN1與結(jié)直腸腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.3 試劑SPTBN1(DF8341)、PTPRN2(AF9171)、E-cadherin(AF0131)及β-actin抗體，均購(gòu)自Affinity公司。Western blot試劑盒購(gòu)自武漢碧云天生物公司。PTPRN2-siRNA序列及SPTBN1-siRNA序列由上海吉瑪生物公司合成。奧沙利鉑由MedChemExpress公司提供。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及PGCCs的誘導(dǎo)HCT116和LOVO細(xì)胞均購(gòu)自American Tissue Culture Collection公司。HCT116和LOVO細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度約70%時(shí)，分別在HCT116和LOVO細(xì)胞中加入10 μmol/L和25 μmol/L奧沙利鉑繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每天更換培養(yǎng)基直至出現(xiàn)含多核或巨大胞核的細(xì)胞即為PGCCs，即為處理組細(xì)胞HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs。

1.5 Western blot法收集結(jié)直腸腺癌組織標(biāo)本、結(jié)直腸腺癌細(xì)胞及PGCCs，加入RIPA裂解液提取總蛋白，用6%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。加入一抗SPTBN1(稀釋比1 ∶2 000)、PTPRN2(稀釋比1 ∶2 000)和β-actin(稀釋比1 ∶10 000)4 ℃冰箱過(guò)夜，再加入HRP標(biāo)記的兔二抗(稀釋比1 ∶10 000)室溫孵育2 h，利用凝膠成像儀曝光并記錄。

1.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)細(xì)胞達(dá)70%～80%融合度時(shí)，消化獲得單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并將細(xì)胞稀釋成每毫升30、60、120個(gè)細(xì)胞加入到12孔板中，培養(yǎng)1～2周直至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞團(tuán)。用無(wú)水甲醇固定30 min，加入0.1%結(jié)晶紫室溫染色30 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞消化后平鋪于6孔板上，待細(xì)胞均勻、單層鋪滿整個(gè)孔后，用無(wú)菌槍頭垂直均勻的劃出劃痕，分別在0、12、24 h于同一位置拍照，用Image J軟件測(cè)量?jī)山M細(xì)胞的劃痕面積。劃痕指數(shù)=(0 h的劃痕面積-指定時(shí)間點(diǎn)的劃痕面積)/0 h的劃痕面積。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)選處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)50%～60%開(kāi)始轉(zhuǎn)染。具體操作流程參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染48 h檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)狀況。PTPRN2-siRNA序列：5′-GAACGAUGGAGUG UUUGGATTUCCAAACACUCCAUCGUUCTT-3′；SPTBN1-siRNA序列：5′-ACCUUCGAGAUGGACGGAUGC UCAU-3′。

2 結(jié)果

2.1 SPTBN1在泛癌和結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，在包含結(jié)直腸腺癌在內(nèi)的大部分癌癥中SPTBN1的蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織(圖1A、B)。進(jìn)一步分析SPTBN1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，其與結(jié)直腸腺癌臨床分期密切相關(guān)。與癌旁正常組織相比，SPTBN1蛋白在不同分期結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)均顯著降低，且隨著臨床分期的增高SPTBN1蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)(圖1C)。

圖1 CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)分析SPTBN1蛋白在泛癌及結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)：A.SPTBN1蛋白在泛癌和癌旁正常組織中的表達(dá)(藍(lán)色柱表示正常組織，紅色柱表示癌組織)；B.SPTBN1蛋白在結(jié)直腸腺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)；C.結(jié)直腸腺癌臨床分期與SPTBN1蛋白表達(dá)的關(guān)系；*P<0.05，***P<0.001

2.2 SPTBN1表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者預(yù)后的關(guān)系PrognoScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，在GSE17537和GSE17536數(shù)據(jù)集中SPTBN1低表達(dá)患者的總生存率(圖2A)、無(wú)瘤生存率(圖2B)和疾病特異生存率(圖2C)明顯短于高表達(dá)患者。此外，Kaplan-Meierplotter(圖2D)、UALCAN(圖2E)和Oncolnc(圖2F)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步證實(shí)了SPTBN1高表達(dá)患者的總生存率明顯高于低表達(dá)患者。結(jié)果提示，SPTBN1低表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)。

圖2 SPTBN1表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者的預(yù)后關(guān)系：PrognoScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析SPTBN1表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者總生存率(A)、無(wú)瘤生存率(B)和疾病特異生存率(C)的關(guān)系；Kaplan-Meierplotter數(shù)據(jù)庫(kù)(D)、UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(E)、Oncolnc數(shù)據(jù)庫(kù)(F)分析SPTBN1表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者總生存率的關(guān)系

2.3 PGCCs中SPTBN1的表達(dá)水平及其增殖、遷移能力的變化Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SPTBN1蛋白在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織(圖3A)。此外，Western blot實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示SPTBN1在HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細(xì)胞中的表達(dá)量均明顯低于HCT116及LOVO細(xì)胞(圖3B)。平板克隆實(shí)驗(yàn)表明：與HCT116及LOVO細(xì)胞相比，HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細(xì)胞的增殖能力更強(qiáng)(圖3C)；劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力(圖3D)。

圖3 SPTBN1在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)及PGCCs的功能實(shí)驗(yàn)：A.Western blot法檢測(cè)SPTBN1蛋白在結(jié)直腸腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)；B.Western blot法檢測(cè)SPTBN1在對(duì)照組HCT116和LOVO細(xì)胞和處理組HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs中的表達(dá)；C.平板克隆實(shí)驗(yàn)比較奧沙利鉑處理前后細(xì)胞的增殖能力；D.劃痕實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)奧沙利鉑處理前后細(xì)胞的遷移能力

2.4 敲低SPTBN1對(duì)結(jié)直腸腺癌PGCCs細(xì)胞增殖和遷移的影響應(yīng)用siRNA敲低結(jié)直腸腺癌細(xì)胞中SPTBN1的表達(dá)水平后進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。平板克隆實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用siRNA敲低SPTBN1表達(dá)后HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細(xì)胞克隆數(shù)明顯高于陰性對(duì)照組(圖4A)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPTBN1敲低組HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細(xì)胞劃痕愈合度明顯高于陰性對(duì)照組(圖4B)。

圖4 敲低SPTBN1對(duì)HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細(xì)胞增殖和遷移的影響：A.平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低SPTBN1后HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs的增殖能力；B.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)比較敲低SPTBN1后HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs的遷移能力

2.5 PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin軸的調(diào)控機(jī)制GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸腺癌中SPTBN1表達(dá)與E-cadherin、PTPRN2表達(dá)呈顯著正相關(guān)(圖5A、B)。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，SPTBN1敲低組HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs中E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯下降(圖5C)；PTPRN2敲低組HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs中SPTBN1、E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組(圖5D)。

圖5 SPTBN1可能的調(diào)控機(jī)制：A、B.GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析在結(jié)直腸腺癌中SPTBN1與E-cadherin、PTPRN2之間的關(guān)系；C.Western blot法檢測(cè)在結(jié)直腸腺癌PGCCs中敲低SPTBN1前、后E-cadherin的表達(dá)變化；D.Western blot法檢測(cè)在結(jié)直腸腺癌PGCCs中敲低PTPRN2前、后SPTBN1和E-cadherin的表達(dá)變化

3 討論

近年，結(jié)直腸腺癌的發(fā)病率和病死率逐年增加。隨著治療方法的改進(jìn)，結(jié)直腸腺癌的總體生存率有所提高，但化療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是患者主要的死亡原因[9]。研究發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑誘導(dǎo)的PGCCs的增殖和遷移能力強(qiáng)于未處理的癌細(xì)胞[10]。因此，探究化療藥誘導(dǎo)PGCCs的具體作用及分子機(jī)制對(duì)結(jié)直腸腺癌的治療具有指導(dǎo)意義。

SPTBN1是血影蛋白家族中最常見(jiàn)的非紅細(xì)胞亞型[11]，在胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥和聽(tīng)力喪失中發(fā)揮重要作用[12-14]。

SPTBN1通過(guò)參與Notch、NF-κB和Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5,8]。在乳腺癌和卵巢癌中SPTBN1低表達(dá)通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)促進(jìn)腫瘤的遷移[15-17]。本實(shí)驗(yàn)中，CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)和Western blot法檢測(cè)結(jié)果均顯示，SPTBN1蛋白在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織。生物信息數(shù)據(jù)分析顯示，SPTBN1低表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用奧沙利鉑誘導(dǎo)的HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細(xì)胞的增殖和遷移能力高于未處理的HCT116和LOVO細(xì)胞，而且SPTBN1蛋白在PGCCs中的表達(dá)量明顯低于HCT116和LOVO細(xì)胞。因此，作者推測(cè)SPTBN1可能在抑制結(jié)直腸腺癌的惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。

PTPRN2屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，參與胰島素和神經(jīng)內(nèi)分泌遞質(zhì)的胞吞過(guò)程[18-19]。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-425通過(guò)下調(diào)PTPRN2促進(jìn)肝癌的增殖、遷移和侵襲[20-21]。E-cadherin是EMT中重要的上皮標(biāo)志物蛋白，其表達(dá)下降是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲的前提條件[22]。本實(shí)驗(yàn)中，GSEA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)SPTBN1蛋白表達(dá)與E-cadherin、PTPRN2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。敲低HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細(xì)胞中的SPTBN1后，E-cadherin蛋白表達(dá)下降；在上述細(xì)胞中敲低PTPRN2后，SPTBN1蛋白和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯降低。結(jié)果提示，PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin通路可能共同參與抑制結(jié)直腸腺癌的增殖和遷移。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SPTBN1在結(jié)直腸腺癌中發(fā)揮抑癌作用，提示SPTBN1可能是結(jié)直腸腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。但本實(shí)驗(yàn)對(duì)于PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin通路在調(diào)控結(jié)直腸腺癌增殖與遷移能力方面的研究尚存在不足，SPTBN1在結(jié)直腸腺癌中的分子機(jī)制尚未完全驗(yàn)證。本課題組將進(jìn)一步對(duì)PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin通路進(jìn)行深入探究，為治療結(jié)直腸腺癌提供新的分子靶點(diǎn)。