朱 昱，張軍霞，周繼春，李 展，李振國

(1. 河南省中醫(yī)院藥學部，河南 鄭州 450053；2.河南省食品藥品檢驗所藥理室，河南 鄭州 450003)

茵梔黃注射液是由傳統(tǒng)中藥名方茵陳蒿湯經(jīng)現(xiàn)代工藝提取精制而成的中藥注射劑，療效確切，隨著臨床應用的增多，不良反應報道也不斷增加，不良反應以過敏反應最多，也最嚴重。2016年9月1日國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《總局關于修訂茵梔黃注射液說明書的公告(2016年第140號)》，修訂公告第一條就要求“增加警示語：本品不良反應包括過敏性休克，應在有搶救條件的醫(yī)療機構(gòu)使用”，但本品的現(xiàn)行標準為《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑(第14冊)[1]，標準中無過敏反應檢查項目，本課題擬參照《藥物刺激、過敏反應和溶血性研究技術指導原則》要求，通過主動全身過敏試驗(active systemic anaphylaxis，ASA)[2]對茵梔黃注射液進行過敏性考察?，F(xiàn)過敏反應檢查法規(guī)定的受試對象為豚鼠[3]，據(jù)文獻報道，目前國內(nèi)外均把BN大鼠作為常規(guī)食物過敏動物模型優(yōu)選鼠系來進行進一步的免疫學研究[4，5]，因此，對于中藥注射劑的過敏反應，BN大鼠很可能是較豚鼠更為敏感的動物模型。已有學者[6-7]采用BN大鼠動物模型對雙黃連注射液、清開靈注射液等中藥注射劑展開研究，而對于過敏反應嚴重的茵梔黃注射液未見相關研究報道。茵梔黃注射液引起的過敏反應多為首次用藥后即產(chǎn)生過敏反應癥狀，推測與類過敏反應有關，致敏機制可能主要為非IgE介導。我國目前尚無中藥注射劑類過敏檢測模型和指導原則，根據(jù)類過敏反應發(fā)生的機制，體外細胞模型需模擬肥大細胞(mast cell，MC)釋放過敏介質(zhì)，RBL-2H3大鼠嗜堿細胞性白血病細胞具有肥大細胞的許多生物學特性，是MC的理想替代模型，且可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)，現(xiàn)已廣泛用于過敏反應、免疫反應等方面的研究[8-11 ]。本課題選擇BN大鼠和RBL-2H3細胞進行茵梔黃注射液過敏反應的研究，并通過檢測RBL-2H3細胞脫顆粒過程與Ca2+的相關性，從細胞脫顆粒的信號轉(zhuǎn)導通路進一步闡明茵梔黃注射液可能的類過敏反應發(fā)生機制。

1 材料

1.1 儀器和主要試劑6470 Triple Quad LC/MS(Agilent Technologies公司)；酶標儀(Molecular Devices公司，型號：FexStation3)(SoftMax Pro v5.2軟件)；電子天平(Mettler Toledo公司，型號：XPE205)；大型離心機(Sigma公司，型號：3-30KSD)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，型號：311)；Alrstream II級A2生物安全柜(ESCO公司，型號：AC2-6S1)；倒置顯微鏡(Olympus公司，型號：CKX41)；黑色透明平底96孔板(Corning公司，型號：3603)；Strata-X-C 33μm Polymeric Strong Cation固體萃取柱(phenomenex公司，60 mg/3 mL Tubes)；Guinea Pig IgE ELISA KIT(R&D Systems公司，進口分裝，雙抗體一步夾心法，96T)；RAT IgE ELISA KIT(R&D Systems公司，進口分裝，雙抗體一步夾心法，96T)；磷酸組胺標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：150410-201313)；乙腈(Merck公司，色譜級)；甲醇(Merck公司，色譜級)；氨水(煙臺市雙雙化工有限公司，含量25%～28%，分析純)；鹽酸(北京化工廠，含量36%～38%，分析純)；BSA(Solarbio公司，Cat.No.A8020，5 g/瓶)；葡萄糖注射液(信合援生制藥股份有限公司，批號：17010653，規(guī)格：100 mL:10 g)；MEM(Invitrogen公司，貨號：C11095500BT)；PBS(Hyclone公司，貨號：SH30256.01)；FBS(Biological Industries公司，貨號：06-002-1ACS)；Non-essential Amino Acids(Invitrogen公司，貨號：11140050，100×)；Sodium Pyruvate 100 mmol·L-1Solution(Invitrogen公司，貨號：11360070)；Fluo 3-AM(同仁公司，貨號：F026)；0.25%Trypsin-EDTA(Gibco公司，貨號：25200-056)；Pluronic?F-127(同仁公司，貨號：WPAI-5)；DMSO(Sigma公司，貨號：D2650)；CCK-8(同仁公司，貨號：CK04)；His-rat酶鼠試劑盒(南京森貝伽公司，貨號：SBJ-R0597)；C48/80(Sigma公司，貨號：C2313)；HBSS(Gibco公司，貨號：14025092)；茵梔黃注射液(某藥業(yè)集團有限公司，批號：170611D1，170612D2，170613D3，170613D2，170613D1，每支10 mL)。

1.2 實驗動物與分組SPF級BN大鼠，♂，體質(zhì)量(160±20)g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK (京)2016-0011；清潔級Hartley豚鼠，♂，體質(zhì)量(300±50)g，購自華蘭生物疫苗有限公司，許可證號：SCXK (豫)2015-0001。BN大鼠和Hartley豚鼠分別隨機分為陰性對照組(10%葡萄糖注射液)、陽性對照組(0.5%BSA)、茵梔黃注射液低劑量組(YZHL)和高劑量組(YZHH)，每組均12只，空白組6只。

1.3 細胞株RBL-2H3大鼠嗜堿細胞性白血病細胞株，購自中國科學院細胞庫。

2 方法

2.1 茵梔黃注射液對BN大鼠和豚鼠ASA試驗的比較研究

2.1.1ASA致敏試驗 設高、低致敏劑量組，分別為人臨床用量的2倍和等倍，依據(jù)《藥理實驗方法學》(第四版)不同種類受試對象劑量換算得出，BN大鼠高、低劑量分別為3.96 mL·kg-1和 1.98 mL·kg-1；豚鼠高、低劑量分別為3.38 mL·kg-1和1.69 mL·kg-1，腹腔注射，注射容積按《藥理實驗方法學》(第四版)動物體質(zhì)量與標準體質(zhì)量相差不到20%，按同一公斤體質(zhì)量劑量用藥，隔日1次，連續(xù)3次。致敏期間每日觀察各組動物反應，與空白組比較。

2.1.2ASA攻擊試驗 BN大鼠和豚鼠各組動物均采用2倍致敏劑量進行攻擊，BN大鼠采用尾靜脈快速推注，豚鼠為耳緣靜脈快速推注，除空白組外每組6只分別于致敏后d 14和d 21攻擊1次，攻擊后即刻觀察各組動物過敏反應30 min，按主動全身過敏試驗評價標準分級(同時出現(xiàn)多種反應的動物以最強的過敏反應級別計)。主動全身過敏試驗評價標準為“-”：過敏反應陰性(正常)；“+”：過敏反應弱陽性(躁動、豎毛、顫抖、搔鼻)；“”：過敏反應陽性(噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排糞、流淚)；“”：過敏反應強陽性(呼吸困難、哮鳴音、紫癜、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、喘息、痙攣、旋轉(zhuǎn)、潮式呼吸)；“”：過敏反應極強陽性(死亡)。

2.1.3血清制備 于觀察過敏反應癥狀30 min后采血(死亡動物除外，即刻釆血)，BN大鼠眼眶采血，豚鼠心包取血，靜置3 h左右，將全血于3 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，取血清，分裝，-80 ℃凍存。

2.1.4ELISA法血清IgE水平測定 用方法2.1.3項中的動物血清，采用IgE ELISA試劑盒(雙抗體一步夾心法)進行血清IgE水平測定。

2.1.5LC/MS法測定血清組胺水平測定 用方法2.1.3項中的動物血清，采用建立的LC/MS法進行血清組胺水平測定。

2.1.5.1檢測條件 色譜條件：Agilent C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水(30 ∶70)為流動相，流速：0.4 mL·min-1，柱溫：35.0 ℃，進樣量：10 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式掃描，質(zhì)譜多反應檢測(MRM)定量，干燥氣溫度為340 ℃，干燥氣流速10 L·min-1，霧化器壓力45 psi，鞘氣溫380 ℃，鞘氣流速12 L·min-1，毛細管電壓4 000 V(+)3 500 V(-)，噴嘴電壓500 V(+)500 V(-)，室電流0.41 μA，檢測離子對：m/z112.0>95.1，碰撞能量13 V，m/z112.0>68.0，碰撞能量23 V。

2.1.5.2樣品前處理 配制30%乙腈水(0.1%甲酸)為萃取液，配制1%NH4OH甲醇溶液為洗脫液。每個血清樣品取60 μL與3 mL萃取液混勻，10 000 r·min-1高速離心，取上清3 mL待過固體萃取柱，先用1 mL甲醇活化固體萃取柱，再1 mL 0.1%甲酸平衡萃取柱，然后將3 mL樣品上清每次1 mL分3次過柱，棄濾液，用1 mL 0.1 mol·L-1HCL水溶液淋洗，棄濾液，再用1 mL 0.1 mol·L-1HCL甲醇溶液淋洗，棄濾液，用6 mL洗脫液每次2 mL，分3次洗脫，收集每個血清樣品洗脫液，標記，室溫下進行氮吹，用2 mL 30%乙腈水復溶，過0.22 μm濾膜后供測定，每個血清樣品均照此處理。

2.2 茵梔黃注射液對RBL-2H3細胞類過敏反應的研究

2.2.1CCK-8法測定茵梔黃注射液對RBL-2H3細胞生長的影響 實驗分設溶劑空白組(無細胞，Ab)、正常細胞組(Ac)、陽性對照組(C48/80為30 mg·L-1)、藥物處理組(茵梔黃注射液濃度分別為4.16、8.33、16.67、33.33、66.67 mL·L-1)，各設5個復孔，將對數(shù)期生長的RBL-2H3細胞混懸液接種于培養(yǎng)板，接種濃度為1.0×108個·L-1，每孔接種100 μL。將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，次日實驗組(As)分別加入5個濃度的茵梔黃注射液和C48/80，Ab和Ac組加入同體積的完全培養(yǎng)液，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后取出培養(yǎng)板，小心吸棄孔內(nèi)用培養(yǎng)上清，并用PBS小心清洗，各孔換100 μL新鮮培養(yǎng)液，鏡下觀察不同濃度藥物刺激下細胞狀態(tài)的差異，每孔加10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標儀測定450 nm處各孔的吸光度，按以下公式計算細胞抑制率：抑制率/% =[(Ac-As)/(Ac-Ab)] ×100%。

2.2.2ELISA法測定細胞上清中組胺釋放量 根據(jù)2.2.1方法得到的IC50，用完全培養(yǎng)液稀釋成0.25倍IC50、0.5倍IC50和IC50三個加藥濃度作為實驗濃度。依次設陰性對照組、陽性對照組和3個濃度的藥物處理組，各組設5個復孔，將對數(shù)期生長的RBL-2H3細胞混懸液接種于96孔板中，接種密度為3×108個·L-1，每孔接種100 μL，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，次日陰性對照組加培養(yǎng)液，藥物處理組分別加3個濃度的茵梔黃注射液，陽性對照組加C48/80(30 mg·L-1)，各10 μL，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h后終止反應，小心吸取各孔反應液置1.5 mL離心管，4 ℃，3 000 r·min-1離心25 min，小心吸取離心后上清分裝200 μL離心管中，置4 ℃冰箱當天進行組胺檢測。按照大鼠組胺ELISA試劑盒的方法依法操作，測定450 nm處各孔吸光度，繪制標準曲線，計算細胞上清中組胺釋放量。

2.2.3細胞內(nèi)Ca2+熒光強度的測定 RBL-2H3細胞除去上清液，用HBSS液小心清洗細胞3次，每孔各加含0.5% Pluronic? F-127的Fluo 3-AM新鮮工作液80 μL，37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，小心吸棄Fluo 3-AM工作液，HBSS液小心清洗細胞3次，每孔各加HBSS溶液100 μL，37 ℃培養(yǎng)箱再孵育30 min。用多功能酶標儀終點法檢測各孔熒光值，讀板方式設為底讀，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

3 結(jié)果

3.1 茵梔黃注射液攻擊后，BN大鼠和豚鼠過敏反應分級比較茵梔黃注射液攻擊后，BN大鼠過敏反應癥狀主要包括搔鼻、躁動、排尿、步態(tài)不穩(wěn)、靜臥等，多發(fā)生在攻擊10 min之內(nèi)，數(shù)分鐘后緩解；BSA攻擊后，BN大鼠和豚鼠均出現(xiàn)不同數(shù)量的死亡。過敏反應分級比較(見Tab 1～3)，兩次攻擊后，BN大鼠高劑量組較陰性對照組差異均有顯著性(P<0.05)，豚鼠高、低劑量組與陰性對照組差異均無顯著性，表明給與高劑量茵梔黃注射液時，BN大鼠較豚鼠更敏感。

Tab 1 ASA symptom rating of attacking BN rats and guinea pigs on day 14

*P<0.05vsguinea pig;△P<0.05,△△P<0.01vsnegative control

Tab 2 ASA symptom rating of attacking BN rats and guinea pigs on day 21

Tab 3 Total symptom rating of BN rats and guinea pigs after two attacks

3.2 BN大鼠和豚鼠血清中IgE、組胺水平

3.2.1血清IgE水平比較(ELISA法) 對檢測的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計分析(見Tab 4)，兩次攻擊后同種屬動物各劑量組血清IgE水平差異無顯著性。

3.2.2血清組胺水平比較(LC/MS法)

3.2.2.1組胺標準品及典型血清樣品中組胺的色譜圖，見Fig 1。

3.2.2.2組胺的特征質(zhì)譜圖，見Fig 2。

3.2.2.3線性關系與定量下限 精密稱取組胺標準品，以BN大鼠陰性對照組血清配制濃度分別為10、50、100、250、500 μg·L-1，按2.1.5.2方法處理后以2.1.5.1檢測條件檢測，以組胺的濃度(X，μg·L-1)對其峰面積Y進行線性回歸分析，得組胺的標準曲線方程為Y=2 980.73X-23 452.46，r=0.997 7，表明組胺的濃度在10 ～500 μg·L-1范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關系，定量下限為10 μg·L-1(S/N>10)。

Tab 4 IgE levels in serum after attacking in each group of animals n=6)

Fig 1 Typical chromatogram of histamine standard and serum sample

Fig 2 Mass spectrum of histamine in positive ion modeA: Characteristic ion pair; B: Relative abundance

3.2.2.4回收率、準確度、精密度及血清樣本的穩(wěn)定性考察 以標準曲線方程計算實測血清樣本組胺的質(zhì)量濃度，得到50、250、500 μg·L-13個加標水平的提取回收率在51.72%～64.33%范圍內(nèi)，方法的日內(nèi)和日間的精密度的RSD值均小于6.4%，表明本方法符合生物樣品的分析要求；將上述樣本于-80 ℃冰箱冷凍3 d，常溫解凍后，再次檢測，冷凍前后色譜峰面積的RSD值分別為4.6%、3.7%、3.2%，表明-80 ℃的存放條件穩(wěn)定性良好。

3.2.2.5BN大鼠和豚鼠血清組胺水平及增長率比較 經(jīng)統(tǒng)計分析(見Fig 3)，兩次攻擊后，BN大鼠的高、低劑量組均較陰性對照組的血清組胺水平差異具有顯著性(P<0.01，P<0.05)，而豚鼠僅高劑量組血清組胺水平較陰性對照組差異有顯著性(P<0.05)，進一步從血清學指標反映BN大鼠較豚鼠對茵梔黃注射液更敏感。

Fig 3 Serum histamine levels and growth rates n=6)

3.3 茵梔黃注射液對RBL-2H3細胞類過敏反應的影響

3.3.1CCK-8法對RBL-2H3細胞生長的影響 根據(jù)各孔所測吸光度，按公式[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%計算細胞抑制率(%)，以加藥濃度為自變量X，細胞抑制率為因變量Y，擬合回歸曲線，得茵梔黃注射液對RBL-2H3細胞的IC50為21.02 mL·L-1，見Fig 4。

3.3.2RBL-2H3細胞上清組胺釋放量 根據(jù)各孔所測吸光度，以組胺濃度為橫坐標X，OD值為縱坐標Y，繪制組胺的標準曲線，得到直線回歸方程Y=0.221 9X-0.005 3，r=0.995 4，計算組胺釋放量，經(jīng)統(tǒng)計學分析，陽性對照組、藥物處理組組胺含量與陰性對照組相比較差異均呈顯著性(P<0.01)，且藥物處理組組胺釋放量與加藥濃度呈正相關趨勢，見Fig 5。

3.3.3細胞Ca2+熒光強度測定 經(jīng)統(tǒng)計學分析(見Fig 6～7)，陽性對照組和各濃度藥物處理組的細胞Ca2+熒光強度均與陰性對照組差異具有顯著性(P<0.01)；各濃度藥物作用RBL-2H3細胞后Ca2+熒光強度的對數(shù)與加藥濃度的對數(shù)呈正相關，同組胺釋放量與加藥濃度正相關的趨勢相一致，考慮茵梔黃注射液致RBL-2H3細胞脫顆粒的過程與細胞內(nèi)Ca2+具有相關性，發(fā)生機制可能是依賴Ca2+的顆粒與質(zhì)膜融合釋放過程。

Fig 4 Relationship between dosing concentration and inhibitory rate

Fig 5 Histamine release level in RBL-2H3 cell

Fig 6 RBL-2H3 cells Ca2+ fluorescence intensity n=5)

Fig 7 Relationship between Fluorescence intensity logarithm and dosing concentration logarithm

4 討論

中藥注射液用現(xiàn)行的過敏反應動物模型評價致敏性常為陰性，但臨床上卻仍有較多的過敏反應病例發(fā)生，本研究試圖尋找更敏感的評價中藥注射液過敏反應的動物模型和體外細胞模型，為臨床安全用藥提供臨床前的數(shù)據(jù)支撐。

本研究進行的ASA試驗，以茵梔黃注射液為致敏原，同等試驗條件下BN大鼠反應相較于豚鼠更為敏感。在過敏反應癥狀分級時發(fā)現(xiàn)，BN大鼠過敏反應中出現(xiàn)了癱軟無力和靜臥癥狀，這些癥狀在豚鼠癥狀評級中并未出現(xiàn)，豚鼠過敏反應出現(xiàn)的紫癜癥狀對BN大鼠而言因其毛色呈黑褐色而無法觀察，因此，建立BN大鼠過敏模型時，需要進一步制定針對BN大鼠特征過敏反應癥狀的評價標準。

本試驗條件下，兩種動物模型的血清IgE水平存在明顯的種間差異，但每次攻擊給藥組IgE水平較陰性組均未出現(xiàn)顯著性差異，考慮茵梔黃注射液不需要免疫系統(tǒng)產(chǎn)生IgE即導致了過敏介質(zhì)的釋放，其過敏反應的機制可能與類過敏反應有關，正如易艷等[12-14]對舒血寧注射液、清開靈注射液、雙黃連注射液等中藥注射劑過敏反應的機制研究，認為這些中藥注射劑引起的過敏反應屬于類過敏反應。

血清組胺水平多作為判斷致敏原誘發(fā)過敏反應的直接依據(jù)，本研究建立了LC/MS檢測血清組胺的方法，該法靈敏度高、檢出限低，既能定性又能定量。該法檢測的血清組胺結(jié)果較動物體征的過敏反應分級更靈敏，檢測到BN大鼠的高、低劑量組和豚鼠的高劑量組血清組胺水平均較陰性組差異有顯著性，而動物體征的過敏反應分級判斷僅BN大鼠高劑量組較陰性組差異均有顯著性。

用藥物直接刺激RBL-2H3細胞進行類過敏研究發(fā)現(xiàn)，低于IC50的加藥濃度能明顯引起RBL-2H3細胞釋放組胺，可以看出RBL-2H3細胞釋放組胺等生物活性介質(zhì)并非茵梔黃注射液對細胞的毒性導致而是生物學效應引發(fā)。目前研究的觀點一致認為肥大細胞或嗜堿性細胞脫顆粒的過程主要分兩個過程[15-16]，(1)依賴鈣離子的顆粒與質(zhì)膜融合釋放過程；(2)非依賴鈣離子的顆粒遷移過程。茵梔黃注射液通過哪條途徑引起RBL-2H3細胞脫顆粒未見報道，本研究采用FexStation3多功能酶標儀測定RBL-2H3細胞內(nèi)Ca2+熒光強度，結(jié)果顯示茵梔黃注射液作用RBL-2H3細胞后Ca2+熒光強度增加，細胞脫顆粒的發(fā)生機制可能是依賴鈣離子的顆粒與質(zhì)膜融合釋放過程。

本研究的結(jié)果提示，從動物模型上，以BN大鼠替代豚鼠進行過敏反應檢查，以組胺血清學指標檢測能夠更靈敏的反映動物的過敏反應；從實驗動物保護的“3R”原則考慮，可選用RBL-2H3體外細胞模型替代動物試驗，由于茵梔黃注射液致RBL-2H3細胞脫顆粒與Ca2+的相關性，可考慮直接進行監(jiān)控Ca2+熒光信號作為檢查中藥注射劑過敏反應的檢測手段，該方法更為簡便、快捷，同時也省去動物和組胺試劑盒的檢測成本，要使方法標準化，還有很多工作要做，有待進一步研究。