牛肖飛,袁雪晶,馬鳳娟

(1.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

小兒哮喘是一種慢性氣道炎癥，反復發(fā)作，纏綿難愈，受遺傳、環(huán)境等多種因素的影響[1]，近年來，兒童哮喘的患病率仍呈上升趨勢。西醫(yī)主要通過擴張支氣管等達到止咳平喘的作用，但是難以達到有效且持久的效果。中醫(yī)認為，小兒先天稟賦不足，哮喘多以肺脾氣虛患兒為主[2]，中醫(yī)治療小兒哮喘貫穿“治病求本”理念，通過增強患兒體質，“扶正以祛邪”。近年來中醫(yī)藥治療哮喘的效果較佳，但相關作用機制并不明確。固本防哮飲具有補肺固表、健脾化痰的功效。前期臨床研究表明，固本防哮飲聯合穴位敷貼治療小兒哮喘的有效率明顯優(yōu)于西藥，且復發(fā)率普遍降低[3]。網絡藥理學是基因組學、蛋白質組學、代謝組學等學科的集合與發(fā)展，為新藥研發(fā)提供了重要思路[4]。因此，本研究擬通過網絡藥理學和分子對接術探討固本防哮飲治療小兒哮喘的作用機制，以有效指導臨床通過中醫(yī)藥對小兒哮喘的辯證施治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 15只健康SPF級雄性SD大鼠，7～8周齡，體質量(280～320) g，購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，許可證號: 202005A041，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學動物管理中心。將大鼠隨機分為3組:空白血清組4只，固本防哮飲血清組6只、孟魯司特鈉血清組5只。本實驗已通過南京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，倫理號為202005A041。

1.1.2細胞 人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)、人喉癌上皮細胞(Hep-2)由南京中醫(yī)藥大學兒科研究所藥學組饋贈，培養(yǎng)地點為南京中醫(yī)藥大學兒科研究所細胞培養(yǎng)房。將凍存BEAS-2B細胞復蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，采用傳第2～3代的對數分裂期細胞。Hep-2細胞培養(yǎng)方法同上。

1.1.3RSV病毒 呼吸道合胞病毒A亞型(Long株)，由南京中醫(yī)藥大學兒科研究所饋贈，保存于南京中醫(yī)藥大學兒科研究所。根據前期課題組研究[5]用Hep-2細胞復蘇擴增RSV，擴增效果最佳。因此，本實驗用Hep-2細胞擴增RSV后收集病毒，用于后續(xù)病毒毒力的測定及細胞的感染。

1.1.4藥物 孟魯司特鈉片：10 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司，產品批號：R033495。固本防哮飲每劑由以下藥物組成：炙黃芪、黨參、炒白術、茯苓、煅牡蠣、蟬蛻、陳皮、防風、辛夷、五味子、生甘草，按5 ∶3.33 ∶3.33 ∶3.33 ∶ 5 ∶2 ∶2 ∶1 ∶2 ∶2 ∶1的比例配制。實驗用固本防哮飲藥物配制：第1煎先加8倍量涼水浸泡30 min，煎煮30 min后濾過；第2煎加6倍量水煎煮30 min,將2次煎液過濾、蒸餾、濃縮至相當于生藥2 kg·L-1的濃縮液，密封保存于無菌50 mL離心管，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5試劑 人IL-4，IL-13,鼠抗SRC單克隆抗體(南京柏賽生物，批號：MFP06004-05、SRP3274、ET1609-65)，兔抗TP53多克隆抗體(深圳市文樂生物科技有限公司，批號：D220082-0100)，羊抗兔多克隆IgG-H&L二抗(美國Proteintech公司，批號：K1225)，人Tublin 內參引物(批號：232212)，細胞核蛋白質提取試劑盒(批號：C500009-0050)，RIPA(批號：RIPA-BL504A)，PMSF[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號：PMSF-BL507A]，特級胎牛血清(深圳百泰克科技有限公司，批號：10099-141)，賽默飛RPMI 1640培養(yǎng)基(廣州市魯誠生物科技有限公司，批號：C11875)，CCK-8細胞增殖計數試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：A311-01)，Human IL-6 ELISA試劑盒(廣州泰勒生物科技有限公司，批號：PI330)，糖原PAS染色液-細胞專用(北京索萊寶科技有限公司，批號：G1360)等。

1.1.6儀器 AF103型制冰機(美國Scotsman公司)；5810R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Power Pac Basic型垂直電泳儀，Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉印系統(tǒng)，Chemi-Doc型化學發(fā)光成像儀(美國Bio-Rad公司)；TCSSP5型倒置顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1網絡藥理學和分子對接

1.2.1.1固本防哮飲有效成分的篩選 通過TCMSP 2.3數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)及文獻檢索，整合固本防哮飲各個藥物有效活性成分。將類藥性(drug likeness，DL)≥0.18，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%作為數據庫ADME的篩選條件。

1.2.1.2有效成分相關靶點的收集 在TCMSP 2.3數據庫篩選藥物活性成分的相關靶點信息，并通過UniProt數據庫(http://www.uniprot.org)進行靶點蛋白與基因名稱的統(tǒng)一匹配。

1.2.1.3疾病相關靶點的篩選 以“children asthma”為關鍵詞，在GeneCard數據庫(https://www.genecards.org)、OMIM數據庫(http://www.omim.org)、Drugbank數據庫(https://www.drugbank.ca)進行檢索，收集相關靶點。篩選GeneCard數據庫中位數值，刪去重復值得到哮喘的潛在靶點信息。

1.2.1.4固本防哮飲“活性成分-靶點”網絡構建 采用Cytoscape 3.7.2軟件構建“中藥-成分-共同靶點”、“共同靶點互相作用”網絡圖，運用NetworkAnalyzer工具進行網絡參數分析。其中Degree為重要參數，數值越大代表該節(jié)點越重要。

1.2.1.5蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡構建 利用Venney 2.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線平臺對藥物與疾病靶點繪制韋恩圖，并提取交集基因。將交集基因上傳String 11.0數據庫，得到PPI網絡TSV文件，借助Cytoscape軟件進行節(jié)點網絡分析，得到蛋白質相互作用網絡圖。結合內置插件“cytoHubba”分析，篩選出關鍵靶點。

1.2.1.6基因本體(gene ontology，GO)功能及京都基因與基因組百科全書(kyotoen cyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 將固本防哮飲治療哮喘的潛在作用靶點導入輸入DAVID 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)，設置標識符為“OFFICIALGENESYMBOL”、物種選擇為“homo sapiens”，其余默認選擇，進行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.2.1.7分子對接 通過TCMSP數據庫及PubChem數據庫得到小分子mol2格式文件，通過String數據平臺(https://cn.string-db.org/)，PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載大分子靶蛋白的pdb格式文件。使用AutodockTool 4.0軟件分別對小分子和大分子進行加氫、去水，借助PyMOL 2.5軟件進行分子活性位點對接。

1.2.2實驗方法

1.2.2.2最大藥物無毒濃度的測定及RSV擴增最大藥物無毒濃度 將對數生長期的培養(yǎng)液調細胞數至1×108·L-1，加至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，BEAS-2B細胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，細胞長成單層后，吸棄各孔培養(yǎng)液，將固本防哮飲含藥血清按10倍梯度稀釋8個濃度(10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%),分別接種于96孔板，每個濃度設6個復孔，24 h后加入100 μL CCK-8溶液，同時設置空白組和對照組，避光孵育2 h，上機檢測每孔的吸光度并進行記錄,通過計算每個稀釋梯度的細胞存活率，存活率大于90%的稀釋濃度代表藥物最大無毒濃度。

RSV擴增 將Hep-2用如上方法接種于10 mL大皿中，將倍數生長期的細胞在10 mL無菌培養(yǎng)瓶中進行傳代，待細胞貼壁60%時，分別加入20%、50%、80%稀釋倍數的RSV病毒液，每天觀察合胞生長情況，合胞脫落后，用細胞刮將細胞從壁上刮落，連同培養(yǎng)液一起轉移至50 mL離心管，4 ℃，2 000 r·min-1離心10 min，將上清液進行分裝，-80 ℃ 進行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3固本防哮飲對哮喘模型細胞的影響 以杯狀細胞作為模型細胞觀察哮喘炎癥指標。參考文獻中白介素使用劑量，本實驗用IL-4、IL-13各取50 mg·L-1，加/不加RSV[6]病毒液4 μL進行造模。以下藥物組均為RSV+IL-4+IL-13造模。將細胞分為空白對照組(15%空白血清)、固本防哮飲組(10%，15%，20%固本防哮飲含藥血清)、孟魯司特鈉組(15%孟魯司特鈉含藥血清)，按照上述細胞培養(yǎng)方法，當細胞生長到60%～70%時，分別換成含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，各組細胞棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3遍后，參照PAS染色試劑盒說明書進行染色后，置于倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化。

1.2.2.4ABC-ELISA法測IL-6表達水平 ABC-ELISA稱為橋聯親和素-生物素法，是基于傳統(tǒng)ELISA法的升級。如上培養(yǎng)分組、造模、給藥的BEAS-2B(除去固本防哮飲高劑量組,只保留固本防哮飲低、中劑量組)，4 ℃、13 000 r·min-1離心30 min后取上清液，不加細胞裂解液，BCA法測定濃度并定量為等濃度。嚴格按ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.2.5Western blot法測SRC、TP53的表達水平 參照上述細胞分組培養(yǎng)方法，細胞裂解后提取的蛋白均置于4 ℃，14 000 r·min-1，離心15 min，BCA法測定蛋白濃度進行定量。變性后取10 μL的蛋白在8%的預制膠進行恒壓垂直電泳，用濕轉法將膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，加1×Tris-HCl緩沖鹽溶液(1×TBST)在搖床上清洗3次，每次10 min，用5%脫脂奶粉在搖床上封閉2 h，1×TBST再次清洗3遍后，4 ℃孵育SRC、TP53一抗過夜。TBST清洗后在搖床上室溫孵育二抗(1 ∶5 000) 1 h，孵育結束后再次TBST清洗3次，加ECL發(fā)光液于曝光機上掃描膠片，進行顯影、定影，采用Image Lab軟件進行結果分析。

2 結果

2.1 網絡藥理分析及分子對接結果

2.1.1固本防哮飲有效成分及靶點篩選結果 經過TCMSP數據庫、UniProt、化源網、SwissTargetPrediction及文獻檢索，收集整合，數據整理(排除檢索有效成分靶點信息無果的成分)，共得到231個成分，其中五味子8個、黃芪21個、黨參21個、白術7個、茯苓13個、煅牡蠣16個、蟬蛻15個、陳皮5個、防風18個、辛夷15、生甘草92個，1個成分為陳皮、防風、甘草共有，1個成分為陳皮、甘草共有，1個成分為黨參、甘草共有，1個成分為黨參、防風共有，1個成分為白術、黃芪共有，1個成分為茯苓、甘草共有，7個成分為黃芪、甘草共有。對篩選出的活性成分進行手動檢索相關靶點信息，剔除未查詢到相關靶點的成分，最終獲得23個活性成分。在UniProt數據庫、SwissTargetPrediction對以上活性成分進行檢索或預測，刪除無效值與重復值，共得到692個靶基因。

2.1.2小兒哮喘疾病靶點預測結果 將“children asthma”作為關鍵詞在多個疾病數據庫進行檢索，GeneCard數據庫獲得3 868個基因，根據經驗設定Relevancescore大于中位數的靶點為潛在作用靶點，Drugbank數據庫113個、OMIM數據庫38個靶基因，將以上靶基因進行整合、去重后，最終獲得1 052個有效靶基因。

2.1.3固本防哮飲“中藥-活性成分-靶點”網絡構建 將固本防哮飲的成分、作用靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，進行“中藥-活性成分-靶點”關系圖構建，見Fig 1。網絡中共912個節(jié)點，3 881條邊。

2.1.4固本防哮飲治療小兒哮喘的PPI網絡構建 將整理得到的疾病和藥物獨立靶點導入微生信作圖平臺，得到242個交集靶點，繪制韋恩圖，見Fig 1，將所得交集基因導入String數據庫進行PPI分析，通過調試，最終將互動分數設置為高可信度，結果輸出為TSV文件通過Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理，得到PPI網絡圖。共得到231個節(jié)點,1 948條關系路線，平均節(jié)點度值為16.866，平均局部聚類系數為0.422，節(jié)點圖形大小及顏色隨著Degree值增大而變大、加深，連接線段也相應增粗。通過cytohubba插件，使用MCC算法篩選出排名前10的關鍵基因，見Fig 2，顏色越深代表基因的重要性越高。

Fig 1 Gubenfangxiaoyin- pediatric asthma target Wayne diagram

2.1.5KEGG、GO通路富集分析

2.1.5.1GO功能與通路富集分析 運用Metascape數據平臺對242個共有靶點進行富集分析，以P值作為篩選條件，GO富集分析分別選取分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cell composition，CC)的前10條通路進行展示，見Fig 3。根據富集分析結果，共有靶點GO的MF包括：G蛋白偶聯胺受體活性(G protein couple damine receptor activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)等功能。GO-BP包括：細胞對有機氮化合物的反應(cellular response to organ onitrogen compound)、MAPK級聯調節(jié)(regulation of MAPK cascade)、對激素的反應(response to hormone)、炎癥反應(inflammatory response)等生物過程。GO-CC包括：膜筏(membraneraft)、膜側(side of membrane)、受體復合物(receptor complex)、囊泡腔(vesicle lumen)、突觸后(post synapse)等組分。

Fig 2 Key nodes of PPI network

Fig 3 GO analysis

2.1.5.2KEGG富集通路分析 以P值作為篩選條件，KEGG通路分析展示前20條通路，縱坐標代表富集通路名稱，橫坐標代表每條通路上的基因數占共有基因數的比例。由Fig 4可知，242個哮喘與固本防哮飲共有靶點主要富集在鈣信號通路(calcium signaling pathway)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、5-羥色胺能(serotonergic synapse)等多種通路上。

Fig 4 KEGG enrichment analysis

2.1.5.3分子對接結果 通過分子對接術對篩選出的度值較高的成分及靶點進行活性成分對接，根據網絡藥理學分析結果，篩選出5′-hydroxyiso-muronulatol-2′、5′-di-O-glucoside、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、木犀草素等小分子配體，STAT3、SRC、AKT1、TP53、TNF、MAPK3、IL-6等大分子受體，進行分子對接，其結合能見Fig 5。取結合能力最高的對接結果進行可視化處理，選取結合能分數最低的HQ19(5′-hydroxyiso-muronulatol-2′,5′-di-O-glucoside)與SRC、TP53作圖分析，結合模式如Fig 6、7。

Fig 5 Analysis of docking-binding energy

Fig 6 Figure between SRC and HQ19

Fig 7 TP53 and HQ19

2.2 實驗結果

2.2.1PAS染色法 見Fig 8，與正常組相比，IL-4+IL-13組，RSV+IL4+IL-13組杯狀細胞數量增多，并且RSV+IL4+IL-13組杯狀細胞數量比IL-4+IL-13組杯狀細胞數量稍多。與RSV+IL4+IL-13組相比，固本防哮飲中、高劑量組、孟魯司特鈉組杯狀細胞數量減少，并且固本防哮飲中劑量組杯狀細胞數量最少，固本防哮飲高劑量組與孟魯司特鈉組杯狀細胞數量相比差別不明顯。證明固本防哮飲可以降低炎癥反應。

2.2.2ELISA法檢測固本防哮飲對IL-6的影響 細胞培養(yǎng)上清IL-6的表達水平結果見Tab 1，與正常組相比，IL-4+IL-13組、RSV+IL-4+IL-13組IL-6的表達水平升高(P<0.05)。與RSV+IL-4+IL-13組相比，固本防哮飲組、孟魯司特鈉組IL-6的表達降低(P<0.05)。

Tab 1 Comparison of IL-6 protein expression levels

Fig 8 PAS staining of goblet

2.2.3Western blot檢測固本防哮飲對SRC、TP53的影響 結果見Fig 9。與空白組相比，IL-4+IL-13組、RSV+IL4+IL-13組SRC表達水平明顯升高(P<0.05)；與RSV+IL4+IL-13組相比，固本防哮飲組、孟魯司特鈉組SRC的表達均降低(P<0.05)。與空白組相比，IL-4+IL-13組、RSV+IL4+IL-13組TP53的表達均明顯升高(P<0.05)，與RSV+IL4+IL-13組相比，固本防哮飲組、孟魯司特鈉組、TP53的表達均降低(P<0.05)。

3 討論

小兒哮喘屬于中醫(yī)“哮病”范疇，哮喘論述首見于《黃帝內經》，散見于《玉機真藏論》、《藏氣法時論》、《咳論》等，奠定了后世防治哮喘的理論基礎。哮病常反復發(fā)作，責之于宿根不除，反復受外邪引觸之故。小兒哮喘以肺脾氣虛、痰濁內阻為主，因此補肺健脾、祛濁化痰為治療小兒哮喘的重要方法[7]。固本防哮飲是江蘇省中醫(yī)院經典方，具有補肺固表、健脾化痰的功效，對治療哮喘緩解期患兒有獨特功效。

根據網絡藥理學研究結果顯示，固本防哮飲防治小兒哮喘的主要成分可能是槲皮素、異鼠李素、山奈酚等。槲皮素能夠通過調節(jié)谷胱甘肽活性、清除活性氧，具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎和抗腫瘤等多種藥理作用[8]。異鼠李素可抑制支氣管上皮細胞炎癥模型釋放的大量促炎性因子、趨化因子，具有強抗氧化性，可抗炎、抗病毒、抗氧化和抗過敏，還可以調節(jié)免疫功能[9]。山奈酚具有抗炎、抗氧化以及抗癌活性，發(fā)揮抗氧化應激作用[10]。

本研究通過網絡拓撲分析中的Degree值以及MCC算法，篩選出較為重要的靶點，包括STAT3、SRC、AKT1、TP53、IL-6等。SRC在促進氣道平滑肌細胞生長和促進氣道重塑中的遷移方面發(fā)揮重要作用，可以介導表皮生長因子受體(EGFR)反式激活[11]，有研究表明，通過SRC(SU6656)或EGFR(AG1478)抑制劑減少EGFR磷酸化和下游信號傳導，從而抑制OVA誘導的支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞的募集，降低血管、支氣管周圍炎癥、纖維化、杯狀細胞化生和氣道高反應性[12]。且患兒外周血中TNF、IL-6的分泌增加[13]，降低其分泌水平可能會減輕哮喘癥狀。

GO富集、KEGG通路分析及分析對接結果顯示，STAT3、SRC、AKT1、TP53、TNF、IL-6等靶點，可能是固本防哮飲干預小兒哮喘的關鍵靶點，它們參與調控了鈣信號通道、cAMP信號通路，AGE-RAGE信號通路、cGMP-PKG信號通路等多種通路。目前已被證實鈣通道、cAMP通路信號傳導失調與哮喘的發(fā)生密切相關。鈣庫控制的鈣內流是介導細胞鈣信號的重要途徑之一，內質網上鈣缺乏時，內質網膜上的基質相互作用分子1蛋白傳遞鈣缺乏信號，激活細胞膜上的鈣通道，介導鈣離子進入胞質，參與氣管收縮、氣道炎癥等許多生物反應[14]。cAMP是參與細胞內信號轉導的第二信使，參與調控人類多種病理生理過程,如炎癥、細胞生長與分化、凋亡及代謝等。通過實驗對分子對接結合能力最強的蛋白進行驗證，發(fā)現RSV感染支氣管上皮細胞哮喘模型，SRC、TP53、IL-6的分泌水平均增高，且RSV感染后，杯狀細胞數目顯著增加，提示固本防哮飲可能通過以上信號通路來調節(jié)炎癥反應等病理反應，發(fā)揮防治哮喘作用，但是具體治療哮喘的機制，尚需更多深入研究。

Fig 9 SRC, TP53 protein expression levels in

綜上所述，本文借助網絡藥理學和分子對接初步分析發(fā)現，固本防哮飲可能通過槲皮素、異鼠李素、山奈酚等活性成分，作用于STAT3、SRC、AKT1、TP53、TNF、MAPK3、IL-6、JUN等靶點，調節(jié)鈣、cAMP、cGMP-PKG等信號通路，發(fā)揮降低炎癥反應，改善肺功能及微循環(huán)等作用，從而達到防治小兒哮喘的目的。本研究存在局限性，不論是中藥有效成分，還是疾病靶點信息，在不同數據庫之間存在差異，最終獲取的信息可能會導致結果出現差異性。但本文在一定程度上驗證了固本防哮飲作為臨床治療小兒哮喘常用藥的可用性，也為今后相關實驗研究、藥物開發(fā)提供了理論依據。