倫靜雯，盧宇靖，袁宇璽，黎秋茹，馮啟榮，趙海山

(廣東工業(yè)大學1.生物醫(yī)藥學院、2.輕工化工學院，廣東 廣州 510006；3.廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學科學院，廣東 廣州 510080)

迄今，癌癥治療的技術手段得到快速發(fā)展，全球大部分地區(qū)癌癥死亡率呈下降趨勢[1]。但多種化療藥物在治療腫瘤的同時，也會造成正常細胞的損傷，引起多種化療的不良反應，因此腫瘤治療的預后成為主要的關注點。目前，已報道的化療藥物引起的毒性有多種，其中腫瘤心臟病(onco-cardiology)，主要是指腫瘤診療過程中產(chǎn)生的心血管疾病[2]。腫瘤心臟病已成為影響腫瘤預后的因素，是癌癥幸存者的一個重要問題[3]，并且它導致的死亡風險已經(jīng)超過癌癥復發(fā)的風險[4-5]。因此，解決腫瘤心臟病的難題迫在眉睫。已知市面上有大量抗腫瘤藥物具有心臟毒性，包括蒽環(huán)類、烷基化劑類、鉑類、抗代謝類、抗微管劑類等[6-7]。右雷佐生(Dexrazoxane， Dex)作為FDA唯一批準可用于降低蒽環(huán)類化合物心臟毒性的藥物[8]，它是一種鐵螯合劑，可去除鐵，防止自由基的形成，誘導拓撲異構酶IIβ的快速降解[9]。但是，Dex對其他類型的腫瘤心臟病的研究并沒有明確的報道。

動物模型是藥物發(fā)現(xiàn)的基石，斑馬魚模型由于其與人類大部分基因組相同，同源性高達80%～90%，胚胎透明，可觀察早期發(fā)育進程，具有非凡的繁殖速度，可進行高密度生長，成本低，能進行顯微注射操縱基因表達等特點，常用于疾病的研究，尤其是心血管和代謝類疾病的研究[10-11]。本文通過早期斑馬魚胚胎模型評價非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的急性毒性、整體動物形態(tài)、心臟功能，以確定5種非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的疾病模型，為尋找治療非蒽環(huán)類腫瘤心臟病的藥物提供快速、高效的方法[12-13]。并且通過建立的疾病模型進一步探究Dex對非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物引起的腫瘤心臟病的保護作用，為Dex的進一步研究提供新的論據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器Axio Observer A1型研究型倒置顯微鏡(ZEISS)、DHP-9012型恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒)、Stemi 508型體式顯微鏡(ZEISS)、Axio Imager.2型研究型正置顯微鏡(ZEISS)、KG-SX-500型滅菌鍋(日本TOMY公司)、L500型醫(yī)用離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、TriStar2S型多功能酶標儀(BERTHOLD)

1.2 材料

1.2.1細胞株 H9C2傳代細胞(大鼠心肌細胞系)來自廣東工業(yè)大學生物醫(yī)藥研究院實驗室凍存。

1.2.2試劑 Dex(D134376，97%，阿拉丁生化公司)，順鉑(cisplatin, DDP，A2111110001，98%)、紫杉醇(paclitaxel, Taxol，A2007230001，100%)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU，A2108230002，99%)、硫酸長春新堿(vincristine sulfate, VCR，A2007230002，98%)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX，A2108230001，97%)均夠自廣州優(yōu)南科技有限公司，氯化鈉(7647-14-5，99.5%，天津市大茂化學試劑廠)，碳酸氫鈉(144-55-8，99.5%，天津市大茂化學試劑廠)，氯化鉀(P112134，99.5%，阿拉丁生化公司)，氯化鈣(C110766，96.0%，阿拉丁生化公司)，甲基纖維素(S14012)購自源葉生物，DMSO(Q5733)購自MP Biomedlcals，LLC，高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit，F(xiàn)C101-04)購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2.3魚系 Tg[myl7：EGFP]和Wild-type AB strain品系的成年斑馬魚(包含雄雌)，魚齡為6～12個月，兩種魚系均購于國家斑馬魚資源中心。

1.3 方法

1.3.1制備溶液 配制Holt buffer，分別將0.100 g KCl、7.000 g NaCl、0.235 g CaCl2和0.400 g NaHCO3置于裝有1.900 L超純水的燒杯中，并定容為2.000 L，待完全溶解后于121 ℃滅菌30 min，最后使用真空過濾器(孔徑為0.22 μm)進行過濾，室溫保存。Dex用DMSO溶解，配制為50 mmol·L-1的儲備液，于-20 ℃冰箱避光保存。DDP、Taxol、VCR、CTX、 5-FU使用含0.6%DMSO的Holt buffer溶解至相對應的濃度，且以上5種溶液均采用現(xiàn)配現(xiàn)用的方式進行實驗。

1.3.2獲取早期斑馬魚胚胎 在實驗前一天斑馬魚進食1 h后，選取健康的Tg[myl7：EGFP]或者Wild-type AB strain品系的成年斑馬魚置于交配缸中，用隔板將雄、雌魚按1 ∶1分隔開。次日早上8 ∶00，讓雄、雌魚自由交配，并在1 h后收集胚胎。每個培養(yǎng)皿加入100顆發(fā)育正常的卵以及適量的Holt buffer，在溫度為28.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3早期斑馬魚急性毒性實驗 挑選健康的受精24 h(hours post-fertilization，hpf) Wild-type AB strain斑馬魚胚胎置于24孔板中，每孔加入20顆卵，設置4組重復。每種化療藥物分別設置6個或以上濃度進行測試，以每孔1 mL相應濃度藥液的體積量加入到孔板中，同時設置含體積分數(shù)為0.6%DMSO的Holt buffer為空白組。以胚胎心臟停止跳動為判定死亡的標準，在48、72、96 hpf時，對胚胎的存活狀況進行統(tǒng)計。最后計算每種藥物的胚胎96 hpf的LC50值。然后采用聯(lián)合給藥的方式，以化療藥物的LC50值為模型組濃度評價Dex的保護作用，聯(lián)合不同濃度梯度的Dex(20、40、60、80、100 μmol·L-1)處理72 h，統(tǒng)計斑馬魚胚胎存活率。

1.3.4評價早期斑馬魚胚胎組織器官毒性和心臟功能 選取健康的24 hpf Tg[myl7：EGFP]的轉基因斑馬魚胚胎置于24孔板，每孔放入15顆，設置4組重復，并用Holt buffer稀釋DDP、Taxol、5-FU、VCR和CTX至相應濃度(LC50值)，同時設置含0.6%DMSO的Holt buffer為空白組。待胚胎在72 hpf時，使用質(zhì)量分數(shù)為4%的甲基纖維素將斑馬魚側躺固定在載玻片上，置于研究型正置顯微鏡下進行拍照。使用錄像系統(tǒng)記錄每分鐘心跳次數(shù)(heart rate， HR)。測量每條斑馬魚的1個心跳周期心臟的舒張和收縮末期的心室，計算收縮分數(shù)(fractional shortening， FS)、心室容積(stroke volume， SV)和心臟輸出量(cardiac output， CO)。然后采用聯(lián)合給藥的方式，以Dex的最佳藥效濃度評價對化療藥物的心臟功能的保護作用。每組選取8條斑馬魚進行統(tǒng)計。

1.3.5細胞急性毒性實驗 采用高糖DMEM完全培養(yǎng)基將H9C2細胞以每孔6 000個的細胞密度接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，設置5個復孔，然后將孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，以每孔100 μL藥液加入孔板中，同時設置空白組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測量450 nm處的OD值，從而獲得藥物的毒性曲線。根據(jù)曲線，確定細胞活力值接近50%的藥物濃度為造模濃度，先給予Dex預處理24 h，然后棄去培養(yǎng)基，加入相應濃度的藥液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最后測定450 nm處的OD值，從而獲得給藥后的活力曲線。

2 結果

2.1 Dex在斑馬魚模型上的藥效安全性根據(jù)經(jīng)Dex處理24 h、48 h、72 h的斑馬魚胚胎存活率以及孵化率(Fig 1A、B)，結果表明Dex的給藥濃度為500 μmol·L-1以下時，胚胎的孵化率與空白組相比沒有明顯改變，說明此濃度范圍不影響斑馬魚胚胎的發(fā)育周期。結合斑馬魚96 hpf的胚胎整體形態(tài)(Fig 1C)，經(jīng)400 μmol·L-1Dex處理72 h的斑馬魚胚胎出現(xiàn)輕微圍心腔水腫，經(jīng)300 μmol·L-1以下濃度的Dex處理72 h并未出現(xiàn)明顯毒性。因此，確定Dex的安全濃度為300 μmol·L-1以下(包括300 μmol·L-1)。

2.2 非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎急性毒性的影響為了評價Dex對DDP、Taxol、5-FU、VCR和CTX的保護作用，需確定它們對斑馬魚胚胎急性毒性的影響。結果顯示，空白組的96 hpf斑馬魚胚胎存活率無明顯變化。胚胎經(jīng)不同梯度濃度的DDP、VCR、5-FU和CTX處理72 h后，各組胚胎存活率明顯降低，其96 hpf斑馬魚胚胎的LC50見Tab 1，而Taxol在最大水溶解度下，其存活率與空白組相比并沒有明顯改變(Fig 2A)。

在探究5種藥物對斑馬魚急性毒性的基礎上，研究Dex對斑馬魚胚胎存活率的影響，結果如Fig 2B所示：只有DDP聯(lián)合Dex處理后，胚胎的存活率明顯上升，當Dex的濃度為40～100 μmol·L-1時差異有顯著性(P<0.01)，且Dex的濃度為80 μmol·L-1時達到最大藥效濃度，LC50值達639.448 μmol·L-1(590.582～725.419 μmol·L-1)。而VCR聯(lián)合Dex后，胚胎的存活率明顯降低，加劇胚胎毒性。因此，Dex能降低DDP的急性毒性，不影響5-FU和CTX的急性毒性，加劇VCR的急性毒性。

Fig 1 Effects of Dexrazoxane on survival rate， hatching rate and morphology of zebrafish

Tab 1 Acute toxicity LC50 value of 96 hpf zebrafish embryos

2.3 非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎組織器官毒性的影響為了進一步評價Dex對DDP、5-FU、VCR和CTX的組織器官的保護作用，本研究對斑馬魚胚胎的主要組織器官進行觀察。結果為，空白組斑馬魚胚胎發(fā)育正常，已脫殼孵化為幼魚，心血管系統(tǒng)無形態(tài)學改變，心房和心室部分重疊，且心臟環(huán)化正常。與空白組相比，經(jīng)438 μmol·L-1DDP處理48 h后，胚胎出現(xiàn)卵黃囊腫大、身體脊椎彎曲、小眼畸形、心臟輕微畸形、心室和心房容積減少，心房變??；經(jīng)65 mmol·L-1的5-FU處理48 h后胚胎出現(xiàn)心包膜明顯的水腫、卵黃囊出血且凹陷、小眼畸形、心房和心室腫大畸形；經(jīng)25 μmol·L-1VCR處理48 h后胚胎出現(xiàn)身體脊椎彎曲、尾部卷曲、卵黃囊輕微腫大、小眼畸形、心室變?。唤?jīng)20 mmol·L-1CTX處理48 h后胚胎心包膜出現(xiàn)明顯的水腫、卵黃囊出血且輕微凹陷、小眼畸形、心房和心室輕微腫大畸形。見Fig 3。

聯(lián)合80 μmol·L-1Dex給藥處理后，明顯改善DDP引起的毒性，但并沒有明顯改善5-FU、VCR或CTX所產(chǎn)生的組織器官毒性，結果見Fig 3。

因此，斑馬魚胚胎經(jīng)過DDP、5-FU、VCR和CTX處理后，除心臟毒性外還表現(xiàn)出其他組織器官毒性。而Dex只對DDP引起的組織器官毒性具有保護作用，對5-FU、VCR和CTX并沒有影響。

2.4 非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎的心臟功能影響為了更進一步評價4種非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎心臟功能的影響，選取HR、FS、SV和CO 4項指標進行評價，見Tab 2。與空白組相比，DDP與VCR均明顯降低斑馬魚胚胎的4項心功能指標；5-FU與CTX除降低斑馬魚胚胎的HR外，其余3項指標均上調(diào)，表現(xiàn)為擴張型心臟病。而經(jīng)過Dex聯(lián)合處理后，可恢復DDP引起的斑馬魚4項心功能指標的降低，明顯保護斑馬魚胚胎由于DDP引起的心臟毒性(P<0.01)，但不影響5-FU、VCR和CTX 4項心功能指標的變化。

2.5 Dex和DDP對細胞活力的影響結合斑馬魚急性毒性、組織器官毒性以及心臟毒性3個維度評價Dex對非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物引起的毒性保護作用，認為只有Dex對DDP具有保護作用，因此我們進一步采用哺乳動物細胞模型進行驗證，DDP對H9C2大鼠心肌細胞毒性影響見Fig 4。單獨給予不同DDP藥物濃度處理H9C2細胞24 h后，H9C2細胞的存活率隨濃度增大而降低(Fig 4A)。而采用Dex對H9C2細胞進行24 h預處理，結果顯示：Dex明顯提高由DDP引起的細胞活力降低，且最佳濃度為1.25 μmol·L-1，說明Dex可以降低DDP引起的心肌細胞毒性。

Fig 2 Effects of five anti-tumor drugs and combined Dexrazoxane on survival rate of zebrafish

Tab 2 Heart function of 72 hpf zebrafish embryos

Fig 3 Effects of four anti-tumor drugs and combined Dexrazoxane on overall development of 72 hpf zebrafish

Fig 4 Effects of cisplatin and combined Dexrazoxane on survival rate of H9C2

3 討論

抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細胞的同時也對正常細胞造成損傷，引起不良反應，影響患者的生活質(zhì)量，即使現(xiàn)在腫瘤治療明顯提高患者的壽命，但是目前的新藥還沒完全實現(xiàn)高活性與低不良反應相結合，心臟毒性嚴重影響腫瘤治療的預后，仍然是我們現(xiàn)在所要關注的問題[14]?？鼓[瘤藥物中，以阿霉素為代表的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物對于心臟毒性的不良反應研究甚多，目前Dex是FDA唯一批準用于降低蒽環(huán)類化合物心臟毒性的藥物[15]，但是其能否降低其他抗腫瘤藥物的不良反應尚屬未知。

斑馬魚是常用于藥物篩選的整體動物模型，擁有82%的人類疾病相關基因的直系同源基因，表現(xiàn)出接近，有時候甚至超過嚙齒動物的生理和藥理學保守性[16]。本課題組前期已使用斑馬魚模型對多種抗腫瘤藥物的心血管毒性進行了描述[13]及藥物篩選[17]。因此，本研究選擇斑馬魚作為模型對Dex的心臟保護作用進行進一步探索。

本研究選取了若干種具有代表性的，且被報導具有心血管毒性的抗腫瘤藥物進行研究，包括烷基化類的CTX、鉑類的DDP、抗代謝類的5-FU、抗微管劑型的VCR以及Taxol。結果顯示：在斑馬魚急性毒性測試中，5種抗腫瘤藥物中只有4種藥物(DDP、5-FU、VCR和CTX)明顯降低斑馬魚的胚胎存活率。DDP、5-FU、VCR和CTX在斑馬魚胚胎中也表現(xiàn)出明顯的心臟毒性。此外，DDP、5-FU、VCR和CTX還引起其他組織器官毒性，分別為：DDP表現(xiàn)為肝臟及代謝毒性、發(fā)育延緩和神經(jīng)毒性；5-FU表現(xiàn)為肝臟及代謝毒性和神經(jīng)毒性；VCR表現(xiàn)為神經(jīng)毒性、肝臟及代謝毒性和發(fā)育延緩；CTX表現(xiàn)為肝臟及代謝毒性和神經(jīng)毒性。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，Dex對DDP引起的斑馬魚胚胎死亡率增加，明顯的心臟毒性及發(fā)育毒性均有較好的保護作用，而對5-FU、VCR和CTX的各種毒性均未見明顯作用。

由此說明，Dex不僅可以保護蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的心臟毒性，還可以保護DDP引起的心臟毒性，同時還能改善DDP引起的肝臟及代謝毒性、發(fā)育延緩和神經(jīng)毒性。但在本研究的條件下，Dex并不能保護5-FU、VCR和CTX引起心臟毒性以及其他毒性。因此我們認為，Dex發(fā)揮作用的機制并非直接靶向心臟，而是通過影響抗腫瘤藥物產(chǎn)生毒性的毒理機制起作用。由于DDP產(chǎn)生多種毒副作用的根本原因是DDP與DNA相互作用，并與嘌呤DNA堿基形成共價加合物[18]，所以Dex對DDP發(fā)揮保護作用的機制可能影響此通路，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Dex可能降低由抗腫瘤藥物DDP引起的心臟及其他組織毒性，但并未發(fā)現(xiàn)對5-FU、VCR和CTX毒性的保護作用。本研究的發(fā)現(xiàn)說明，Dex可作為降低DDP化療不良反應的潛在藥物進行開發(fā)，并為Dex進一步的藥理機制研究提供了線索和理論基礎。