梁亞萍，王略力，黃 蓉，方 雁, ，杜曉華，陳 晨，肖 創(chuàng)，楊為民

(昆明醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院,云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650031)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是全球發(fā)病率和死亡率最高的慢性病之一[1]。作為一種常見(jiàn)的可預(yù)防和治療的疾病，COPD主要表現(xiàn)為持續(xù)的呼吸癥狀和氣流受限，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未完全闡明，主要病理機(jī)制包括氧化應(yīng)激、蛋白酶失衡、線粒體功能障礙、氣道炎癥等之間的相互作用[2]。目前，COPD主要的治療方式為藥物治療、氧療，以改善患者呼吸困難、咳痰、氣喘、胸悶等癥狀。然而，臨床上用于防治COPD的藥物均有許多不良反應(yīng)。目前用于防治COPD的藥物仍然十分有限，且尚無(wú)有效的治療方法可以阻止疾病的進(jìn)展。近年來(lái)的研究顯示，調(diào)控環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)通路在呼吸系統(tǒng)疾病的防治中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。cAMP是普遍存在的第二信使之一，主要在細(xì)胞內(nèi)參與物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，在松弛氣道平滑肌細(xì)胞、減輕炎癥中起著關(guān)鍵作用，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平有助于緩解哮喘、COPD、特發(fā)性肺纖維化等肺部疾病癥狀[3]。通過(guò)激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclases，ACs)或抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)可增加細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，從而改善肺功能障礙，是防治COPD的有效策略。本文主要對(duì)細(xì)胞內(nèi)調(diào)控cAMP的蛋白酶、調(diào)控cAMP通路防治COPD的機(jī)制及相關(guān)藥物進(jìn)行綜述，為基于cAMP通路防治COPD的藥物研發(fā)提供參考。

1 cAMP概述

1.1 cAMPcAMP首次被發(fā)現(xiàn)于1957年，是第一信使作用于靶細(xì)胞后產(chǎn)生的信息分子。cAMP在許多生物系統(tǒng)中發(fā)揮作用，如激素分泌、糖原分解、平滑肌松弛、心臟收縮以及學(xué)習(xí)和記憶等。經(jīng)典的cAMP信號(hào)通路是細(xì)胞外激動(dòng)劑與G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)結(jié)合并誘導(dǎo)構(gòu)象變化，Gs蛋白刺激ACs，誘導(dǎo)AC催化腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)生成cAMP，細(xì)胞內(nèi)cAMP的升高會(huì)同時(shí)誘導(dǎo)蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)和cAMP直接激活的交換蛋白(exchange proteins directly activated by cAMP，Epac)，從而發(fā)出信號(hào)控制下游反應(yīng)[4]。GPCRs、ACs和PDE動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)cAMP信號(hào)傳遞。細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平受到PDE作用控制，PDE將cAMP降解為5′-腺嘌呤核苷酸(adenosine 5′-monophosphate，5′-AMP)，從而終止其信號(hào)傳導(dǎo)[5]。此外，A-激酶錨定蛋白(A-kinase anchoring proteins，AKAP)通過(guò)形成復(fù)合體來(lái)維持細(xì)胞cAMP的區(qū)室化，進(jìn)而調(diào)控特定的細(xì)胞反應(yīng)。早期的研究表明，cAMP升高后，激活PKA和Epac，隨后通過(guò)不同途徑激活效應(yīng)器，誘導(dǎo)氣道平滑肌松弛，抑制氣道平滑肌增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌[6]。

1.2 調(diào)控cAMP的蛋白酶

1.2.1PDEs PDEs可以催化水解cAMP和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷，如今在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了PDEs的11種亞型(PDE1～PDE11)，且具有不同的同工酶，其中主要水解cAMP的是PDE4。PDE4又分為PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D四種亞型，其廣泛分布于各種組織，參與炎癥調(diào)節(jié)、微血管通透性和纖維化、血管和氣道平滑肌收縮和增殖等生理過(guò)程[7]。PDE4與cAMP水平之間的負(fù)相關(guān)是各種病理生理疾病如氣道炎癥、COPD、哮喘、銀屑病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的關(guān)鍵機(jī)制。在肺部，PDE4主要表達(dá)于肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞，包括平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，調(diào)節(jié)并引起氣道平滑肌的舒張，參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)[8]。

1.2.2ACs 在1989年第一個(gè)哺乳動(dòng)物AC在牛腦中被發(fā)現(xiàn)后純化克隆，隨后又發(fā)現(xiàn)了9種AC亞型，目前已確定哺乳動(dòng)物AC共有10個(gè)亞型，9個(gè)跨膜AC亞型(membrane adenylate cyclase，mAC)和一種可溶型AC(soluble AC，sAC)。sAC作為一個(gè)可溶性酶，不同于哺乳動(dòng)物中其它AC亞型，sAC不受G蛋白的調(diào)節(jié)，鈣和碳酸氫鹽的刺激是影響它的主要因素，主要與精子運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)有關(guān)[9]。

mAC由1個(gè)氮端 (N-端)、2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、其通過(guò)C1a和C1b區(qū)域連接，并在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)C2a和C2b與碳端(C-端)相連組成，N-端和C-端伸入胞質(zhì)中，C1和C2是兩個(gè)具有高度同源性的胞漿區(qū)，是AC的催化結(jié)構(gòu)域，影響AC的活性，而N-端的序列和長(zhǎng)度在不同的ACs具有明顯差異[10]。大多數(shù)組織和許多細(xì)胞類型都表達(dá)不止一種AC亞型，且不同物種間各個(gè)亞型的表達(dá)也是不一致的。AC1在大腦中高表達(dá)，主要影響神經(jīng)功能，是慢性疼痛的合適的神經(jīng)元特異性藥物靶點(diǎn)。AC8主要在大腦中表達(dá)，被認(rèn)為在學(xué)習(xí)和記憶中起作用；AC3在嗅覺(jué)上皮中含量最豐富，在嗅覺(jué)中起作用；而AC5和AC6在心臟中占主導(dǎo)地位，與心臟收縮有關(guān)；AC4、AC7、AC9則普遍存在哺乳動(dòng)物組織中；AC2分布較為廣泛，在腦、肺、骨骼肌、心臟均有表達(dá)，而在肺中高表達(dá)的亞型是AC2、AC6、AC8、AC9[11]。

2 cAMP與COPD

cAMP在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)有巨大作用，通過(guò)識(shí)別并放大信號(hào)，作用于依賴cAMP的酶或蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)相應(yīng)的生理效應(yīng)。細(xì)胞受到外界刺激后，影響AC、PDE酶活性，調(diào)節(jié)胞內(nèi)cAMP濃度，從而影響下游PKA、Epac和AKAP，進(jìn)而影響核因子κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)、cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)氣道平滑肌舒張，減輕炎癥和氣道纖維化，因此，調(diào)控cAMP通路在防治COPD等慢性呼吸系統(tǒng)疾病中有巨大潛力。

2.1 cAMP與氣道平滑肌松弛COPD患者呼吸道表現(xiàn)出明顯的氣道壁重塑和黏液滯留等氣流受限癥狀，其中氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)異常增生與肥大是COPD氣道重塑最顯著特征之一。β2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑是治療COPD氣流阻塞的關(guān)鍵藥物之一，其支氣管松弛效應(yīng)部分歸因于細(xì)胞內(nèi)cAMP的增加，隨后cAMP主要效應(yīng)因子PKA、Epac被激活，參與促進(jìn)氣道平滑肌松弛[12]。Epac通過(guò)ERK抑制氣道平滑肌表型轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)ASMCs的收縮和舒張功能，使Ras同源基因家族成員A與Ras相關(guān)C3肉毒素底物(Ras related C3 botulinum toxin substrate，Rac)的平衡向Rac移動(dòng)從而抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化，最終誘導(dǎo)松弛氣道平滑肌[6]。另有研究證實(shí)[13]，通過(guò)增加氣道平滑肌和支氣管上皮內(nèi)cAMP濃度，可協(xié)同減少上皮內(nèi)乙酰膽堿釋放，改善支氣管癥狀。最新的研究發(fā)現(xiàn)[14]，抑制或下調(diào)ATP結(jié)合盒亞家族C成員1可明顯減少ASMCs中β2受體引發(fā)的cAMP釋放，從而使胞內(nèi)cAMP升高，松弛氣道平滑肌細(xì)胞，從多種途徑防止COPD氣道平滑肌重構(gòu)。

Fig 1 The signaling pathway of cAMP in treatment of COPD

2.2 cAMP與炎癥慢性炎癥是COPD的核心發(fā)病機(jī)制，其氣道炎癥以中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多為特征。cAMP的抗炎作用是多樣的，調(diào)節(jié)著廣泛的生物過(guò)程，其調(diào)節(jié)作用也因細(xì)胞類型而異。

在COPD的炎癥發(fā)病進(jìn)程中，中性粒細(xì)胞通過(guò)釋放炎癥介質(zhì)和蛋白酶發(fā)揮了作用。Dunne等[15]發(fā)現(xiàn)，COPD患者的中性粒細(xì)胞異常遷移，對(duì)趨化物白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)、趨化因子CXC配體1(chemokine C-X-C motif ligand 1，CXCL1)的遷移活性增加，且發(fā)現(xiàn)升高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度可抑制中性粒細(xì)胞對(duì)CXCL1和LTB4的趨化作用。

肺部主要存在支氣管巨噬細(xì)胞、間質(zhì)巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，其中肺泡巨噬細(xì)胞的作用尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，在肺泡巨噬細(xì)胞中，經(jīng)香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)或其他刺激物刺激活化后巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子，而cAMP信號(hào)可抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和趨化因子C-C配體3(C-C motif chemokine 3，CCL3)等促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，促進(jìn)IL-10等抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16]。

Oldenburger等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在ASMCs上CSE減弱cAMP信號(hào)導(dǎo)致了白介素-8(interleukin-8，IL-8)的釋放，而Epac和PKA則分別抑制NF-κB和ERK，減少I(mǎi)L-8的分泌，發(fā)揮抗炎作用。

在免疫系統(tǒng)中，cAMP另外一通路則是通過(guò)激活下游核轉(zhuǎn)錄因子CREB，通過(guò)PKA與NF-κB抑制蛋白 ( inhibitor of nuclear factor-kappa B，IκB)分子相連形成復(fù)合體，引起IκB降解的信號(hào)激活PKA催化亞基，進(jìn)而磷酸化p65分子。磷酸化的CREB可以通過(guò)與活化的NF-κB結(jié)合，抑制NF-κB與相應(yīng)基因的結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄，從而有效控制炎癥發(fā)生。

2.3 cAMP與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在過(guò)去研究中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用的證據(jù)越來(lái)越多。香煙煙霧和環(huán)境污染物使肺部暴露于過(guò)量的氧化劑，特別是活性氧，增加氧化應(yīng)激負(fù)擔(dān)，誘導(dǎo)EMT，導(dǎo)致COPD的嚴(yán)重惡化，且COPD患者氣道、肺上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化顯著增加[18]。Zuo等[3]研究表明，cAMP定位于特定的亞細(xì)胞微區(qū)，調(diào)節(jié)下游效應(yīng)蛋白PKA和Epac的活性，AKAP則通過(guò)短的α-螺旋結(jié)構(gòu)與PKA結(jié)合，調(diào)節(jié)EMT。最近的證據(jù)也表明[19]，在Beas-2b細(xì)胞上CSE誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β釋放使EMT進(jìn)程加重，使Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ，COLⅠ)上調(diào)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白下調(diào)，而升高cAMP或破壞AKAP-PKA直接的相互作用能夠明顯減少COLⅠ的上調(diào)，影響COPD中的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而緩解COPD癥狀。

3 調(diào)控cAMP通路的藥物在COPD中的應(yīng)用研究

臨床上用于防治COPD的藥物主要包括吸入性糖皮質(zhì)激素、長(zhǎng)效β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑和長(zhǎng)效M受體拮抗劑，但均有許多不良反應(yīng)，用于防治COPD的藥物仍然十分有限，尚無(wú)有效的治療方法阻止疾病的進(jìn)展。目前，調(diào)控cAMP通路的藥物在COPD中的應(yīng)用研究主要集中在PDE4抑制劑和AC激動(dòng)劑。

羅氟司特(Roflumilast，RF)作為第2代PDE4抑制劑，其主要抑制PDE4A和PDE4B。RF于2010年被批準(zhǔn)上市用于防治COPD急性加重，是臨床上目前唯一被批準(zhǔn)用于治療COPD的選擇性PDE4抑制劑，可以抑制氣道炎癥，改善COPD患者的肺功能，減少病情惡化。在體內(nèi)，其可減輕與COPD相關(guān)的關(guān)鍵疾病機(jī)制，如煙草煙霧引起的肺部炎癥、黏液纖毛功能障礙、肺纖維化和肺氣腫重塑、氧化應(yīng)激、肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓；在體外，RF可影響多種細(xì)胞的功能，包括中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，這些細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)能夠減輕病情惡化和改善肺功能，被認(rèn)為是RF對(duì)COPD疾病產(chǎn)生有益影響的原因[20]。

由于口服治療劑量的RF會(huì)導(dǎo)致胃腸道的副作用，如腹瀉、惡心、食欲下降、體質(zhì)量減輕等，更多的PDE抑制劑被研究用于治療COPD。Tanimilast(國(guó)際非專有名稱：CHF6001)，是一種新型吸入PDE4抑制劑，目前正在開(kāi)展Ⅲ期臨床試驗(yàn)(ClinicalTrials.gov identifier:NCT04636801)，其對(duì)PDE4抑制作用約為RF的10倍，肺部抗炎特性明顯。在對(duì)廣泛PDEs的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)PDE4具有高度選擇性。Tanimilast作為三聯(lián)療法的補(bǔ)充，用于降低患有慢性支氣管炎和有加重病史的COPD患者的加重風(fēng)險(xiǎn)。在體外對(duì)巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，Tanimilast減少了促炎癥細(xì)胞因子(TNF-α和IL-6)、趨化因子(CXCL8、CCL3和CXCL10)的釋放[21]。

Ensifentrine(國(guó)際非專有名稱：RPL554)是PDE3和PDE4雙重抑制劑，具有強(qiáng)效的舒張氣管和抗炎作用，目前處于Ⅲ期臨床試驗(yàn)(ClinicalTrials.gov identifier:NCT04535986)[22]。Ensifentrine對(duì)PDE3的選擇性比PDE4強(qiáng)，PDE3作為氣道平滑肌中的主要同工酶，對(duì)氣道張力有影響。因此，在COPD患者中的早期臨床試驗(yàn)集中在吸入Ensifentrine的支氣管擴(kuò)張作用上。

目前仍有多種PDE4抑制劑處于臨床試驗(yàn)階段，主要包括以下：GSK256066(ClinicalTrials.gov identifier: NCT00549679)處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)，Cilomilast(ClinicalTrials.gov identifier: NCT00103922)處于Ⅲ期臨床試驗(yàn)，HPP737(ClinicalTrials.gov identifier:NCT04714294)則還在Ⅰ期臨床試驗(yàn)。Tetomilast(ClinicalTrials.gov identifier: NCT00917150)目前正在進(jìn)行其用于COPD的Ⅱ期試驗(yàn)。

針對(duì)AC激動(dòng)劑用于防治COPD的研究仍處于臨床前。其中佛司可林(Forskolin，F(xiàn)SK)是一種典型的AC激動(dòng)劑，它從印度植物毛喉鞘蕊花(Coleusforskohlii)的根部提取的二萜類物質(zhì)，高度激活除AC9以外的所有膜結(jié)合AC亞型，且對(duì)肝臟、肺等其他器官有很好的抗纖維化作用[23]，可減輕缺血/再灌注引起的微血管通透性增高和肺毛細(xì)血管損傷[24]。FSK具有潛在的抗COPD作用，可以誘導(dǎo)哮喘患者的支氣管擴(kuò)張[11]。而異佛司可林(isoforskolin，ISOF)是云南特有植物毛喉鞘蕊花中提取分離到的二萜類活性成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)SK和ISOF為同分異構(gòu)體，兩者在C6、C7位上存在乙?；c羥基位置的差異。研究發(fā)現(xiàn)，ISOF可以激活A(yù)C 1、2和5，改善COPD模型大鼠的肺通氣功能，減輕急性、慢性肺損傷，下調(diào)促炎細(xì)胞因子并減輕炎癥反應(yīng)，提示ISOF可能是一種潛在的防治COPD的藥物[24-25]。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

綜上，cAMP是多條通路的中心節(jié)點(diǎn)之一，參與COPD的發(fā)生發(fā)展。激活A(yù)C或者抑制PDE均可升高cAMP水平，進(jìn)而增強(qiáng)氣道平滑肌松、減輕炎癥反應(yīng)，拮抗COPD。鑒于AC和PDE均有多種亞型、其在不同組織細(xì)胞上的分布不同，cAMP在細(xì)胞內(nèi)存在區(qū)室化的調(diào)控機(jī)制，因此，調(diào)控cAMP通路用于COPD的防治也面臨挑戰(zhàn)。一方面需要進(jìn)一步研究闡明cAMP信號(hào)在不同細(xì)胞中區(qū)室化的分子機(jī)制，另一方面需要尋找選擇性的AC亞型激動(dòng)劑或PDE亞型抑制劑用于防治COPD的新藥研發(fā)。目前，針對(duì)cAMP的防治COPD藥物雖已有多種處于臨床研究，但仍處于發(fā)展階段，還需要更加深入的探索，為其真正應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)。