李平，夏文廣，鄭嬋娟，段璨，李正良 ，曹鈺卓，張荷玲

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430000；2.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢 430000；3.湖北省直屬機(jī)關(guān)醫(yī)院，湖北 武漢 430000）

0 引言

腦卒中是世界范圍內(nèi)致死、致殘的主要原因之一，缺血性腦卒中是最常見的類型，約占60%～80%[1]。中醫(yī)將缺血性腦卒中歸屬于“中風(fēng)”范疇，以益氣活血化瘀為主要治療方法[2]。紅花-桃仁藥對是活血化瘀的經(jīng)典藥對，始于元代王好古所著《醫(yī)壘元戎》中的加味四物湯[3]。近年來桃仁、紅花在腦血管病中應(yīng)用廣泛，但分子層面的作用機(jī)制尚不清楚，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)預(yù)測桃仁-紅花藥對治療缺血性腦卒中的作用靶點(diǎn)與信號(hào)通路，為該藥對治療腦卒中提供臨床應(yīng)用依據(jù)，并對中藥的研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 桃仁-紅花活性成分和靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systerms Pharmacology）收集桃仁、紅花所有活性成分[4]，以口服利用度(OB)＞30%，類藥性(DL)＞0.18為標(biāo)準(zhǔn)[5]篩選活性成分。通過挖掘文獻(xiàn)補(bǔ)充被遺漏的活性成分。使用UniProt 數(shù)據(jù)庫得到活性成分相關(guān)靶點(diǎn)并對靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范化。

1.2 缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過OMIM、GeneCards、TTD和DrugBank[6]數(shù)據(jù)庫得到缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)。利用BioinfoGP中VENNY2.1工具，將藥物活性成分的預(yù)測靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析并繪制韋恩圖，提取活性成分與疾病的交集靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將1.2中的交集靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING平臺(tái)繪制得到PPT（protein-protein interaction network）網(wǎng)絡(luò)圖和tsv文件。通過Cytoscape 3.7.2軟件中的CytoNCA包對PPI進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，進(jìn)一步評估關(guān)鍵靶點(diǎn)并繪制網(wǎng)絡(luò)圖，利用CytoHubba插件計(jì)算度值≥19的Hub基因。

1.4 GO和KEGG分析

將交集靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO(Geneontology)富集分析和 KEGG( Kyoto encyclopedia of genes and genomes) 通路分析（人種設(shè)定為人）。

1.5 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥對與疾病的活性成分-靶點(diǎn)-通路整理成Network文件和Type文件，上傳到Cytoscape 3.7.2，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。

1.6 分子對接

對“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。通過 Pubchem 數(shù)據(jù)庫下載活性成分SDF格式文件，通過OpenBabel（version 2.4.1）轉(zhuǎn)換為MOL2格式；通過PDB數(shù)據(jù)庫下載PDB格式的靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)。利用AutoDock Tools對結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水、加氫等處理，通過AutoDock Vina進(jìn)行分子對接，最后用Pymol軟件繪制分子對接示意圖。

2 結(jié)果

2.1 桃仁-紅花藥對中活性成分的篩選

TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索得到桃仁成分66個(gè)，紅花成分189個(gè)，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，共得到桃仁紅花活性成分各17個(gè)，查詢相關(guān)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行補(bǔ)充，去除重復(fù)值最終獲得34個(gè)潛在活性化合物，結(jié)果見表1。

表1 桃仁-紅花中的活性化合物

2.2 缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

共得到缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)1202個(gè)，藥物成分靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)交集韋恩圖如圖1所示，缺血性腦卒中與桃仁共有靶點(diǎn)32個(gè)，缺血性腦卒中與紅花共有靶點(diǎn)147個(gè)，缺血性腦卒中、桃仁、紅花潛在靶點(diǎn)總數(shù)為149個(gè)。

圖1 桃仁和紅花藥對與缺血性腦卒中靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3 缺血性腦卒中與桃仁和紅花藥對共有靶點(diǎn)的 PPI 網(wǎng)絡(luò)及分析

通過STRING平臺(tái)得到缺血性腦卒中與桃仁和紅花藥對共有靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖2），共有98個(gè)節(jié)點(diǎn)、2240條邊。根據(jù)度中心性[8](Degree Centrality，DC)＞19進(jìn)一步確定關(guān)鍵靶點(diǎn)。按Degree值由大到小排序，統(tǒng)計(jì)出頻次前20的Hub基因并繪制條形圖（見圖3）橫坐標(biāo)為靶點(diǎn)的度值。其中IL-6、ALB、AKT1、TNF、VEGFA度值顯著高于其余交集靶點(diǎn)，在PPI 網(wǎng)絡(luò)中起著重要的聯(lián)系作用。AKT1度值最大，可能是藥對治療缺血性腦卒中最主要的潛在靶點(diǎn)。

圖2 桃仁-紅花藥對治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 前20個(gè)互作靶點(diǎn)

2.4 GO和KEGG分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶基因進(jìn)行GO富集分析及 KEGG 通路分析。使用微生信平臺(tái)對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

GO富集分析包括BP(biological process)629條結(jié)果，CC（cellular component)74條結(jié)果，MF(molecular function) 148條結(jié)果，根據(jù)P值＜0.01從小到大排列，均選取前 20 條進(jìn)行富集分析（圖4）。

圖4 共有靶點(diǎn)的GO生物學(xué)過程富集分析

KEGG富集分析涉及121條信號(hào)通路，根據(jù)P值＜0.01，F(xiàn)DR值＜0.05作為篩選條件，從小到大排列，選取前20條通路繪制氣泡圖（圖5）。

圖5 共有靶點(diǎn)的前20條 KEGG通路

2.5 “活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)如圖6所示，選擇KEGG 富集中Count值前10的信號(hào)通路，集中展示桃仁-紅花藥對作用靶點(diǎn)的所在通路。34個(gè)主要活性成分可能通過作用于149個(gè)靶點(diǎn)，在10條信號(hào)通路中發(fā)揮作用，表明桃仁和紅花藥對可能通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路抑制腦卒中的發(fā)生發(fā)展。

圖6 “活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接技術(shù)預(yù)測川芎-赤芍藥對活性成分與潛在靶點(diǎn)的結(jié)合能力

對Degre e值排名前十的核心活性成分與Degree值排名前五的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測。一般認(rèn)為小于-5.0kcal/mol有較好的結(jié)合活性，小于-7.0kcal/mol有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[9]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-谷固醇、羥基紅花黃色素A、木犀草素、山奈酚、赫達(dá)拉汀赤霉素7與ALB、AKT1和VEGFA有強(qiáng)烈的結(jié)合能力，見表2。通過PyMOL軟件對部分成分與靶點(diǎn)對接結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖7。

表2 核心活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能預(yù)測

圖7 核心活性成分與核心靶點(diǎn)對接結(jié)果

3 討論

本研究收集桃仁紅花藥對活性成分34個(gè)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桃仁-紅花藥對中活性成分度值最高的是槲皮素、豆淄醇、羥基紅花黃色素A、木犀草素、山奈酚等。研究表明這些化合物具有抗炎抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡，改善微循環(huán)、保護(hù)血腦屏障，改善腦水腫和神經(jīng)功能缺損等作用[10-13]。拓 撲分析和PPI網(wǎng)絡(luò)圖表明，ALB、IL-6、AKT1、TNF和VEGFA是桃仁-紅花治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)血清白蛋白（ALB）[14]、白介素-6（IL-6）[15]在缺血性腦卒中后炎癥發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，腫瘤壞死因子（TNF）對細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，可引發(fā)血管炎性，并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞從血管內(nèi)轉(zhuǎn)移至神經(jīng)組織[16]，VEGFA可以促進(jìn)血管生成，恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)，起到保護(hù)神經(jīng)元、減輕腦缺血損傷的作用[17]。GO富集結(jié)果分析表明，桃仁紅花治療缺血性腦血管病可能與氧化應(yīng)激的反應(yīng)、活性氧代謝、細(xì)胞凋亡調(diào)控等有關(guān)。研究[18]表明這些生物過程與神經(jīng)系統(tǒng)的功能密切相關(guān)，參與了腦缺血的病理生理過程。KEGG富集結(jié)果提示TNF 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路、HIF-1 信號(hào)通路，PI3K-Akt 信號(hào)通路被顯著性富集，是桃仁-紅花治療缺血性腦卒中的主要通路。TNF信號(hào)通路可以介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞上粘附分子的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤，影響血腦屏障通透性[19]。HIF-1信號(hào)通路在急性腦缺血時(shí)被激活，介導(dǎo)HIF-1α表達(dá)。相關(guān)研究表明，PI3K-Akt信號(hào)通路的激活與抑制與腦梗死有密切聯(lián)系[20]，特別是對腦缺血再灌注后氧化反應(yīng)、血管生成、細(xì)胞凋亡等過程[21]及改善腦缺血再灌注損傷有重要作用[22-23]。分子對接結(jié)果顯示關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分對接效果好，其中AKT1、ALB、VEGFA與10種主要活性成分的結(jié)合能均≤-7.0kcal/mol，表明有較強(qiáng)結(jié)合活性。由此推測關(guān)鍵靶點(diǎn)與主要成分結(jié)合可能是桃仁紅花發(fā)揮治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵。

綜上所述，桃仁紅花主要通過槲皮素、山奈酚和木犀草素等活性成分，作用于AKT1、ALB、VEGFA、IL-6、ALB等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和血管新生等作用，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡通路、 HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、PI3-K/Akt信號(hào)通路等通路治療缺血性腦卒中。該結(jié)果為桃仁-紅花治療缺血性腦卒中作用機(jī)制提供理論指導(dǎo)。為2020湖北省科技重大專項(xiàng)基于湖北道地藥材的現(xiàn)代中藥創(chuàng)制技術(shù)提升提供參考。該藥對的劑量是否對治療效果有影響是我們下一步需要研究的問題。