王權(quán)鵬，黃崇杰，曹偉蘭，洪 滉，尹商羽，錢(qián)朦敖，劉長(zhǎng)寶

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease, IBD）是以腸黏膜屏障功能受損、黏膜通透性增加為特征的非特異性慢性腸道炎性疾病，近年其發(fā)病率升高，但是目前炎癥性腸病的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚[1]。熱休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）結(jié)構(gòu)高度保守，通過(guò)分子伴侶作用介導(dǎo)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和正確裝配，調(diào)節(jié)靶蛋白的活性和功能，協(xié)助修復(fù)在炎癥、應(yīng)激狀態(tài)下折疊結(jié)構(gòu)改變的蛋白損傷[2-3]。有研究表明，HSP70參與慢阻肺、腎小管的炎癥反應(yīng)并起重要作用，但其在腸道炎癥中的作用機(jī)制尚不清楚[4-5]。激活Toll樣受體4 （toll-like receptor 4, TLR4）是觸發(fā)促炎細(xì)胞因子釋放的主要途徑，本研究以過(guò)表達(dá)和低表達(dá)HSP70的Caco-2細(xì)胞為觀察對(duì)象，研究HSP70與TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，探討HSP70在腸道炎癥發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑 Caco-2細(xì)胞系購(gòu)自上海慧穎生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基（貨號(hào)11054-001）及胎牛血清（貨號(hào)16400-044）購(gòu)自德國(guó)Gibco公司，RIPA裂解液（貨號(hào)P0013D）、BCA蛋白定量試劑盒（P0012）、EdU-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)C0075S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Western blotting實(shí)驗(yàn)中的HSP70、MyD88、P65、β-actin一抗抗體（貨號(hào)10995-1-AP、23230-1-AP、14220-1-AP、20536-1-AP）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，TLR4一抗抗體（貨號(hào)ab13556）購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，ECL試劑盒購(gòu)自伯樂(lè)（中國(guó)）有限公司。TaKaRa MiniBEST總RNA提取試劑盒（貨號(hào)9767）、PrimeScript RT試劑盒（RR047A）及TB?PreMix Ex TaqTMII試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Caco-2細(xì)胞用含有10%胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度至培養(yǎng)瓶80%左右進(jìn)行傳代。

1.2.2 慢病毒感染 用完全培養(yǎng)基制備密度為3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞匯合度為20%～30%。更換新的培養(yǎng)基并加入相應(yīng)的慢病毒感染增強(qiáng)液和病毒量。37 ℃培養(yǎng)12 h后更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在感染72 h，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的感染效率。然后用嘌呤霉素（2 μg/mL）篩選出感染成功的穩(wěn)定細(xì)胞株，篩選時(shí)間超過(guò)7 d。根據(jù)所用的慢病毒不同將細(xì)胞分為HSP70過(guò)表達(dá)組、HSP70過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組、HSP70低表達(dá)組、HSP70低表達(dá)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（未加慢病毒的Caco-2細(xì)胞）。

1.2.3 細(xì)胞炎癥誘導(dǎo) 在DMEM中加入脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），使其濃度達(dá)到 1 μg/μL，取處于對(duì)數(shù)期的各組Caco-2細(xì)胞在37 ℃的含有5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，模擬炎癥反應(yīng)，未加入LPS刺激的細(xì)胞作為對(duì)照。

1.2.4 ELISA檢測(cè)IL-1β及TNF-α水平 將各組細(xì)胞在4 ℃，以1000 ×g離心10 min，然后取等量上清液分裝于EP管。根據(jù)制造商的操作說(shuō)明，配置洗滌液、生物素化抗體工作液及酶結(jié)合物工作液來(lái)檢測(cè)上清液中IL-1β及TNF-α水平。

1.2.5 定量PCR 用TaKaRa MiniBEST總RNA提取試劑盒提取Caco-2細(xì)胞的總RNA后，使用含有g(shù)DNA Eraser的PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA?；虻谋磉_(dá)水平使用TB?PreMix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行熒光標(biāo)記后，檢測(cè)熒光表達(dá)，引物見(jiàn)表1。β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)源性參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對(duì)目的基因表達(dá)進(jìn)行歸一化處理，數(shù)據(jù)用 2?ΔΔCT方法進(jìn)行分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用的引物序列

1.2.6 Western blotting 細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入50 μL的RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解15 min。離心15 min，吸取上清液棄去沉淀。使用BCA法進(jìn)行蛋白定量后，加入Loading Buffer后，在100 ℃下煮沸 10 min制備蛋白質(zhì)樣品。將15 μg蛋白上樣至SDS-PAGE 凝膠孔中進(jìn)行凝膠電泳后，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉后，依次孵育一抗和二抗，最后用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行蛋白條帶顯像，Gel Image System 進(jìn)行拍照。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，檢測(cè)結(jié)果以灰度值表示。

1.2.7 EdU比色法 在6孔板中按照3×104個(gè)/mL的密度鋪板。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后，LPS組加入所需的脂多糖處理，對(duì)照組不加刺激處理等。配制EdU工作液及Click反應(yīng)液。反應(yīng)后用Hoechst 33342室溫避光染色。洗滌后，用熒光顯微鏡在波長(zhǎng)460 nm處觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)HSP70促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng) LPS刺激Caco-2細(xì)胞24 h，各組IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)量和蛋白含量較相應(yīng)未加LPS組均有明顯上升（P < 0.05），其中HSP70過(guò)表達(dá)組IL-1β和TNF-α的蛋白表達(dá)分別為刺激前的7.73和6.60倍，過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組為刺激前的5.44和6.22倍，而HSP70低表達(dá)組僅為刺激前的5.10、5.62倍（P < 0.05），說(shuō)明炎癥細(xì)胞造模成功。在LPS刺激后，與過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組相比，HSP70過(guò)表達(dá)組IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)量分別升高0.57和0.59倍，蛋白含量分別升高0.22和0.31倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與低表達(dá)陰性對(duì)照組比較，HSP70低表達(dá)組IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)量分別降低0.18、0.13倍，蛋白含量分別降低0.27、0.20倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與低表達(dá)組相比，HSP70過(guò)表達(dá)組的IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)量分別為其1.87、1.94倍，蛋白含量分別為其1.77、1.57倍，說(shuō)明過(guò)表達(dá)HSP70增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的的炎癥反應(yīng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)和蛋白含量比較

2.2 過(guò)表達(dá)HSP70促進(jìn)細(xì)胞增殖 LPS刺激24 h，各組細(xì)胞增殖率較相應(yīng)未加LPS組均有明顯上升（P < 0.05）；與過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組相比，HSP70過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞增殖率為其1.41倍；與低表達(dá)陰性對(duì)照組比較，HSP70低表達(dá)組細(xì)胞增殖率為其0.69倍; 與低表達(dá)組相比，HSP70過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞增殖率為其2.14倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞增殖率比較

2.3 過(guò)表達(dá)HSP70激活TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路 LPS刺激24 h后，與過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組相比，HSP70過(guò)表達(dá)組HSP70、TLR4、MyD88及P65的蛋白表達(dá)量為其1.68、1.34、1.66、1.27倍，mRNA表達(dá)量為其2.56、2.03、2.09、1.88倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與低表達(dá)陰性對(duì)照組比較，HSP70低表達(dá)組HSP70、TLR4、MyD88、P65 蛋白表達(dá)量為其 0.89、0.68、0.82、0.77倍，mRNA表達(dá)量為其0.41、0.62、0.64、0.71倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與低表達(dá)組相比，HSP70過(guò)表達(dá)組蛋白表達(dá)量為其1.86、1.96、2.12、1.69 倍， mRNA 表達(dá)量為 6.05、2.98、3.02、2.46 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞在LPS刺激24 h后TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白及基因表達(dá)的比較

3 討論

腸道炎癥是先天免疫和獲得性免疫異常激活的結(jié)果，免疫激活、遺傳、環(huán)境因素和腸道菌群改變等多種因素共同參與誘導(dǎo)了腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展[6-8]。自上世紀(jì)以來(lái)，從細(xì)菌和哺乳動(dòng)物來(lái)源的熱休克蛋白及其重組產(chǎn)物已經(jīng)被學(xué)者證明是免疫系統(tǒng)的強(qiáng)大誘導(dǎo)劑，其中細(xì)菌來(lái)源的HSP60、分枝桿菌HSP65和HSP70可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和 IL-12等的表達(dá)和分泌[9-11]，促使抗原提呈細(xì)胞釋放一氧化氮（NO）和C-C趨化因子。研究表明，HSP70與腸道炎癥發(fā)生有關(guān)，潰瘍性結(jié)腸炎患者在患病期間表現(xiàn)出腸黏膜HSP70升高，經(jīng)過(guò)治療后其水平下降[12]。

Caco-2細(xì)胞來(lái)源于人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞，具有微絨毛結(jié)構(gòu),并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系，結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似于分化的腸上皮細(xì)胞。本研究通過(guò)慢病毒構(gòu)建HSP70穩(wěn)定表達(dá)的Caco-2細(xì)胞，并用LPS刺激Caco-2細(xì)胞模擬腸道炎性環(huán)境，結(jié)果表明增強(qiáng)HSP70表達(dá)可導(dǎo)致下游炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)和分泌增加。熱休克蛋白還被認(rèn)為是細(xì)胞程序性死亡的抑制劑，可以阻斷半胱氨酸蛋白酶依賴凋亡的內(nèi)在和外在途徑[13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HSP70可以改善小鼠感染后腸易激綜合征癥狀[14]，這可能與熱休克蛋白誘導(dǎo)炎癥免疫作用和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖相關(guān)。本研究進(jìn)一步通過(guò)EdU實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HSP70表達(dá)增高具有促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖的作用，且在炎癥環(huán)境中的細(xì)胞具有更高的增殖率。本研究結(jié)果顯示，HSP70和炎癥刺激雖然都可以使得細(xì)胞增殖率較對(duì)照組增高，但是兩者之間并無(wú)相關(guān)作用，提示炎癥刺激雖然可以導(dǎo)致Caco-2細(xì)胞增殖率增加，但可能并非通過(guò)調(diào)控HSP70表達(dá)起作用。

Toll樣受體是一種先天免疫受體，TLR受體家族可以對(duì)入侵病原體的釋放及物質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生促炎反應(yīng)，LPS作為腸道細(xì)菌內(nèi)毒素能通過(guò)誘導(dǎo)腸道TLR4表達(dá)改變腸黏膜屏障通透性[15]，從而觸發(fā)MyD88信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在該受體介導(dǎo)的通路中，適配蛋白MyD88通過(guò)其自身的Toll/interleukin-1 receptor（TIR）基序與受體TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而其C末端的死亡結(jié)構(gòu)域則將IL-LR相關(guān)激酶（IRAK）招募到復(fù)合物中，IRAK被自動(dòng)磷酸化并從復(fù)合物中釋放出來(lái)，與TNF受體相關(guān)因子-6（TRAF6）結(jié)合后激活NF-κB通路或MAP激酶級(jí)聯(lián)，該機(jī)制與炎性腸病的病理機(jī)制相關(guān)[16-17]。有學(xué)者進(jìn)一步證實(shí)TLR2 和TLR4及其輔因子CD14是HSP70的受體，參與疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[18]。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞調(diào)控HSP70的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在炎性細(xì)胞環(huán)境中調(diào)高HSP70表達(dá)后能誘導(dǎo)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生激活效應(yīng)，在一定程度上抑制HSP70的表達(dá)后， TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的激活強(qiáng)度明顯降低。說(shuō)明HSP70在炎性腸病中起上游激活作用，并通過(guò)TLR4信號(hào)通路發(fā)揮相應(yīng)的作用。

綜上所述，HSP70通過(guò)激活TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生，參與腸道炎癥反應(yīng)。這一結(jié)果有助于揭示腸道炎性疾病發(fā)病的機(jī)制，并為臨床上腸道疾病的診療提供新靶點(diǎn)。