皇甫云鵬， 包怡紅,2,*， 趙鑫磊， 駱嘉原， 姜喆卉

(1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 哈爾濱 150040)

大豆為我國(guó)主要的農(nóng)作物之一。大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)是大豆的主要工業(yè)化產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量高于90%[1]，因其富含多種必需氨基酸且氨基酸組成合理，被公認(rèn)為優(yōu)質(zhì)植物蛋白[2]。SPI在食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[3]，但因其溶解性、乳化性和起泡性等功能性質(zhì)較差，在一定程度上限制了其應(yīng)用。因此，通過(guò)改變SPI的結(jié)構(gòu)進(jìn)而改善其功能特性，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)改性常用的方法有化學(xué)改性(糖基化、磷酸化、乙酰化、親脂化、巰基化和交聯(lián)等)、物理改性(高壓處理、高壓均質(zhì)和高強(qiáng)度超聲等)和酶改性(谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、氧化酶和內(nèi)肽酶等)[4-6]，相比之下，化學(xué)改性更有效且成本更低[7-9]。

研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)堿處理、自由基接枝法制備的蛋白質(zhì)- 多酚共價(jià)復(fù)合物以及通過(guò)糖基化制備的蛋白質(zhì)- 多糖共價(jià)復(fù)合物的功能特性都優(yōu)于改性前的蛋白質(zhì)[10-11]。接枝多酚引入的羥基對(duì)蛋白質(zhì)- 多酚共價(jià)復(fù)合物的抗氧化能力有較大的貢獻(xiàn)，Guo等[12]的研究發(fā)現(xiàn)單寧酸與SPI在堿性條件下可以形成共價(jià)鍵，增加了SPI的抗氧化活性。多酚的共價(jià)接枝同樣可以改變蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)，Sui等[13]的研究報(bào)道，SPI與黑米花青素之間的共價(jià)和非共價(jià)結(jié)合均改善了蛋白質(zhì)的乳化和起泡特性，并且SPI-花青素共價(jià)復(fù)合物比非共價(jià)復(fù)合物具有更好的起泡性。蛋白質(zhì)- 多糖共價(jià)復(fù)合物含有較多的親水基團(tuán)和更為疏松的表面結(jié)構(gòu)，從而具有更好的溶解性和乳化活性[14]。多糖的共價(jià)接枝也可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)距離空間排斥，提高其乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性[15-16]。Hu等[17]發(fā)現(xiàn)SPI-杏鮑菇多糖共價(jià)復(fù)合物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性在pH值3～11內(nèi)均顯著優(yōu)于天然SPI，共價(jià)復(fù)合物作為乳化劑穩(wěn)定β-胡蘿卜素乳液時(shí)，多糖產(chǎn)生的空間位阻可以促進(jìn)乳液中功能因子的包埋，并減少油滴聚集。因此利用多酚和多糖對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)修飾，可以開(kāi)發(fā)具有較好功能性質(zhì)的新型食品級(jí)材料。蛋白質(zhì)- 多酚- 多糖三元共價(jià)復(fù)合物可將蛋白質(zhì)的乳化活性、多酚的抗氧化活性和多糖的空間位阻效應(yīng)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)[18]，具有更加優(yōu)異的功能特性。肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)-葡聚糖(dextran，DEX)共價(jià)復(fù)合物與不同多酚(表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、兒茶素和沒(méi)食子酸)的共價(jià)接枝均降低了其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的含量，3種三元共價(jià)復(fù)合物的熱穩(wěn)定性和抗氧化活性均顯著優(yōu)于MP-DEX[7]。Liu等[19]研究綠原酸- 乳鐵蛋白- 葡聚糖三元共價(jià)復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)三元共價(jià)復(fù)合物表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性和乳化性能，可作為抗氧化性乳化劑更有效地提高β-胡蘿卜素乳液的物理穩(wěn)定性并抑制β-胡蘿卜素的化學(xué)降解。

目前，多酚、多糖、SPI組成的三元共價(jià)復(fù)合物的研究還存在很多空白。為了使改性后的SPI能兼具多酚和多糖兩種物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)、獲得更加理想的功能特性，本研究采用富含羥基的水溶性多酚——單寧酸(tannin acid，TA)，以及水溶性較好的多糖——麥芽糊精(maltodextrin，MD)和聚葡萄糖(polydextrose，PD)對(duì)SPI進(jìn)行改性，在堿處理法制備SPI-TA的基礎(chǔ)上，采用濕法美拉德反應(yīng)將MD、PD分別共價(jià)接枝到SPI-TA上，制備三元共價(jià)復(fù)合物SPI-TA-MD、SPI-TA-PD，并且與2種SPI-TA的三元物理混合物進(jìn)行對(duì)比，對(duì)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行分析，探究多酚和多糖的共價(jià)接枝對(duì)SPI結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響。本研究旨在為SPI的改性提供新的思路和理論依據(jù)，以期提高其在食品工業(yè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI(w≥98%)，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；TA(w≥99%)，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MD(w≥99%，DE=18)、PD(w≥90%，分子量162～15 000，其中5 000以?xún)?nèi)的占88.7%)，購(gòu)自河南萬(wàn)邦化工科技有限公司；氫氧化鈉，購(gòu)自北京化工廠；透析袋(截留分子質(zhì)量3 kDa)、福林酚、L-亮氨酸、丙烯酰胺，購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；蛋白Marker(5～250 kDa)，購(gòu)自賽默飛世爾中國(guó)；松籽油，購(gòu)自吉林省輝慶農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PL203型電子分析天平，日本島津公司；79-1型磁力加熱攪拌器，山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TENSOR27型傅里葉紅外光譜儀，德國(guó)Bruker公司；DSC Q20型差示掃描量熱儀，美國(guó)TA儀器；LS55型熒光分光光度計(jì)，珀金埃爾默股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1SPI-TA共價(jià)復(fù)合物的制備

參考Guo等[12]的方法制備SPI-TA共價(jià)復(fù)合物。將SPI和TA按照質(zhì)量比10∶1溶解在去離子水中，使溶液中SPI的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。將溶液放置在4 ℃環(huán)境中過(guò)夜以充分水合，使用濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)節(jié)至10.0，并暴露于空氣中攪拌反應(yīng)24 h。利用3 kDa的透析袋將反應(yīng)后的溶液在4 ℃條件下透析48 h，每隔8 h換一次水以確保除去未參與反應(yīng)的游離TA。將透析液在-20 ℃下預(yù)凍6 h，進(jìn)行真空冷凍干燥48 h，得到SPI-TA共價(jià)復(fù)合物粉末。

1.3.2三元共價(jià)復(fù)合物的制備

參考Weng等[20]的方法通過(guò)濕法美拉德反應(yīng)制備SPI-TA-MD、SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物。將已充分水合，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的MD、PD水溶液分別與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的SPI-TA溶液等體積混合，混合溶液中SPI-TA與MD、PD的質(zhì)量比為1∶3，在恒溫95 ℃條件下加熱并攪拌反應(yīng)1 h后，迅速冷卻至室溫結(jié)束反應(yīng)，用濃度為1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH值至7.0，預(yù)凍后真空冷凍干燥得到三元共價(jià)復(fù)合物，記為SPI-TA-MD con、SPI-TA-PD con。相同條件下，不加熱制備SPI-TA與MD、PD的三元物理混合物溶液，預(yù)凍后真空冷凍干燥得到三元物理混合物，記為SPI-TA-MD mix、SPI-TA-PD mix。

1.3.3反應(yīng)基團(tuán)的測(cè)定

1.3.3.1 多酚接枝量的測(cè)定

參考Xu等[7]的方法測(cè)量樣品中的多酚含量。將1.0 mL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的樣品溶液與2.5 mL福林酚試劑混合，并在25 ℃避光反應(yīng) 5 min，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的Na2CO3溶液并將混合物避光2 h以進(jìn)行反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)量最終溶液的吸光度，采用TA標(biāo)準(zhǔn)品繪制吸光值- 多酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，TA的接枝量按式(1)計(jì)算。

(1)

式(1)中，b(TA)為T(mén)A接枝量，μmol/g；ρ1為T(mén)A的質(zhì)量濃度，mg/mL；ρ2為樣品中SPI的質(zhì)量濃度，mg/mL；M為T(mén)A的摩爾質(zhì)量，1 701.20 g/mol。

1.3.3.2 游離巰基含量的測(cè)定

參考李楊等[21]的方法，將15 mg樣品溶于5 mL Tris-甘氨酸緩沖液(86 mmol/L的Tris，90 mmol/L的甘氨酸，4 mmol/L的EDTA，8 mol/L的尿素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的SDS，pH值8.0)中配置樣品溶液。將 4 mg 的5，5-二硫硝基苯甲酸(DNTB)溶解于1 mL的Tris-甘氨酸緩沖液中，取上述溶液50 μL與樣品溶液渦旋混合均勻，室溫反應(yīng)1 h，以未加蛋白質(zhì)的混合液為空白，在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其吸光度A412。巰基含量的計(jì)算見(jiàn)式(2)。

(2)

式(2)中，b(巰基)為巰基質(zhì)量摩爾濃度，μmol/g；1.36×104為摩爾消光系數(shù)；73.53=106/(1.36×104)；ρ為樣品中SPI的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.3.3 游離氨基含量及多糖接枝度的測(cè)定

參考趙城彬等[22]方法，將80 mg的OPA溶解在2 mL的甲醇中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的SDS溶液5.0 mL、濃度為0.1 mol/L的硼砂溶液50 mL及200 μL的β-巰基乙醇，最后用去離子水定容到100 mL配置成OPA試劑。將樣品粉末溶解在去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液。測(cè)定時(shí)，將4 mL OPA試劑和200 μL樣品溶液充分混合，然后在35 ℃水浴中反應(yīng)2 min，使用酶標(biāo)儀在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)340，根據(jù)吸光值計(jì)算樣品中游離氨基含量，以賴(lài)氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。三元共價(jià)復(fù)合物中MD、PD的接枝度(DG)的計(jì)算見(jiàn)式(3)。

(3)

式(3)中，C0為SPI-TA分別和MD、PD物理混合物的自由氨基含量，μmol/mg；Ct為三元共價(jià)復(fù)合物自由氨基的含量，μmol/mg。

1.3.4蛋白質(zhì)電泳分析

參考Laemmli[23]的方法進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)實(shí)驗(yàn)，對(duì)蛋白及其共價(jià)復(fù)合物進(jìn)行凝膠電泳分析。將凍干樣品分散到去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的樣品溶液，分離膠、濃縮膠中丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%、5%，每孔上樣量為10 μL，采用5～250 kDa的蛋白Marker，電泳之后通過(guò)考馬斯亮藍(lán)R250對(duì)凝膠條帶染色后進(jìn)行分析。

1.3.5紫外-可見(jiàn)光吸收光譜分析

參考Liu等[10]的方法，準(zhǔn)確稱(chēng)量不同凍干粉，用去離子水配制成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液。通過(guò)酶標(biāo)儀在200～450 nm波長(zhǎng)下掃描樣品，速度為1 nm/s，采用去離子水作為空白參照。

1.3.6傅里葉紅外光譜的測(cè)定

采用溴化鉀壓片法測(cè)定樣品的紅外光譜。將1 mg樣品與100 mg溴化鉀混合研磨成均勻粉末，在傅里葉紅外光譜儀上掃描4 000～500 cm-1波數(shù)內(nèi)的紅外光譜(FTIR)，采用溴化鉀作為空白對(duì)照。

1.3.7溶解性的測(cè)定

參考Klompong等[24]的方法分析蛋白質(zhì)及其共價(jià)復(fù)合物的溶解性。將200 mg的凍干樣品分散在20 mL去離子水中，配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，采用濃度為0.1 mol/mL的HCl、NaOH溶液將體系的pH值調(diào)節(jié)至7.0，室溫下攪拌30 min，8 000 r/min離心20 min。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。同時(shí)將樣品在濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液中溶解，測(cè)定樣品中的總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。蛋白質(zhì)的溶解性根據(jù)式(4)計(jì)算。

(4)

式(4)中，ρ上清為上清液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；ρ總為總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.8抗氧化活性的測(cè)定

1.3.8.1 ABTS+自由基清除率測(cè)定

參考Zhou等[25]的方法，測(cè)定樣品的ABTS+自由基的清除率。取濃度為7 mmol/L的ABTS+水溶液與濃度為2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液混合，避光反應(yīng)12 h以上制備得到ABTS+溶液，實(shí)驗(yàn)前用甲醇將ABTS+溶液稀釋?zhuān)蛊湓?47 nm波長(zhǎng)處的吸光度值為0.7±0.020。取質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的樣品溶液1 mL，加入3 mL ABTS+溶液，振蕩混勻，避光反應(yīng)60 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。運(yùn)用式(5)來(lái)計(jì)算ABTS+自由基清除率。

(5)

式(5)中，A0為空白對(duì)照的吸光值；At為反應(yīng)60 min 后反應(yīng)液的吸光值。

1.3.8.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考Gong等[26]的方法測(cè)定樣品的DPPH自由基清除率。用乙醇配制濃度為1.75×10-4mol/L的DPPH溶液，取質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的樣品溶液2 mL加入到2 mL的DPPH乙醇溶液中，在室溫下避光反應(yīng)1 h，隨后檢測(cè)其在517 nm波長(zhǎng)處的吸光值，根據(jù)式(5)來(lái)計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.8.3 還原能力測(cè)定

參考Yi等[27]的方法測(cè)定樣品的還原能力。取2 mL的樣品溶液(質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，溶解在體積分?jǐn)?shù)為2%的醋酸溶液中)，加入1 mL的鐵氰化鉀溶液(質(zhì)量濃度為10 mg/mL)，振蕩混勻后，于50 ℃水浴反應(yīng)20 min，隨后加入1 mL的三氯乙酸溶液(質(zhì)量濃度為100 mg/mL)，振蕩混勻。取1 mL的上述溶液，加入3 mL的去離子水和0.4 mL的三氯化鐵溶液(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，于室溫下反應(yīng)5 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在700 nm處的吸光值，以吸光值大小表示其還原能力大小。

1.3.9乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參考肖志剛等[28]的方法測(cè)定樣品的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。冷凍干燥后的樣品用去離子水分散后配置成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。按照溶液- 油體積比4∶1加入松籽油。采用高速剪切乳化機(jī)在10 000 rpm下剪切2 min后，移液槍移取底部100 μL的乳濁液，加入到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS溶液中，于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，剪切后的乳液靜置30 min后，按照上述操作再次測(cè)其吸光值。分別根據(jù)式(6)、(7)計(jì)算其乳化活性(emulsifying activity index，EAI)和乳化穩(wěn)定性(emulsion stability index，ESI)。

(6)

(7)

式(6)、(7)中，EAI為乳化活性，m2/g；ESI為乳化穩(wěn)定性，min；2為固定系數(shù)；2.303為反應(yīng)速率常數(shù)；A0為初始吸光值；DF為稀釋倍數(shù)(200)；ρ為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/mL；L為光程，cm；α為油相占比；A30為靜置30 min后的吸光值。

1.3.10起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

參考代世成等[29]的方法測(cè)定樣品的起泡性及泡沫穩(wěn)定性，使用高速剪切乳化機(jī)將15 mL質(zhì)量濃度為3 mg/mL的蛋白質(zhì)及其復(fù)合物溶液在10 000 r/min下剪切2 min。使用量筒來(lái)確定剪切前、剪切后0 min和剪切后靜置30 min不同樣品溶液的體積，分別根據(jù)式(8)、(9)計(jì)算樣品的起泡性(foaming capacity，F(xiàn)C)和泡沫穩(wěn)定性(foaming stability，F(xiàn)S)。

(8)

(9)

式(8)、(9)中，F(xiàn)C為起泡性，%；FS為泡沫穩(wěn)定性，%；Vb為均質(zhì)前的溶液體積，mL；V0為均質(zhì)后 0 min 的溶液體積，mL；V30為均質(zhì)后靜止30 min的溶液體積，mL。

1.3.11表面疏水性的測(cè)定

參考Xu等[7]的方法，將8-苯胺基-1-萘磺酸鈉(8-anilino-1-naphthalene sulfonate，ANS)溶于濃度為10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中(pH值7.0)，配置成濃度為8 mmol/L的ANS探針溶液。用磷酸鹽緩沖液配置不同蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的樣品溶液(0.05～0.2 mg/mL)。將樣品溶液與ANS探針溶液按體積比200∶1混合均勻，利用熒光分光光度計(jì)在390 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定其發(fā)射波長(zhǎng)，計(jì)為樣品的疏水性。

1.3.12熱穩(wěn)定性測(cè)定

參考Wang等[30]的方法，稱(chēng)取5.0 mg左右的樣品放置在鋁制的樣品盒中并密封，以密封空鋁盤(pán)作為空白對(duì)照，升溫程序：30～180 ℃，升溫速率為 5 ℃/min，干燥氮?dú)獾牧魉贋?0 mL/min。利用TA universal analysis 2000分析軟件對(duì)得到的熱曲線(xiàn)進(jìn)行分析，計(jì)算出樣品的變性溫度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次，采用Origin 8.0軟件繪圖，數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 共價(jià)接枝對(duì)SPI基團(tuán)的影響

SPI、SPI-TA、三元共價(jià)復(fù)合物和混合物中的巰基含量和自由氨基含量，見(jiàn)表1。由表1可知，通過(guò)福林酚法測(cè)定所制備的SPI-TA二元共價(jià)復(fù)合物的多酚結(jié)合當(dāng)量為(35.56±1.32) μmol/g。堿性有氧條件可以促使TA中的酚羥基去質(zhì)子化，酚羥基易被氧化成為相應(yīng)的醌，進(jìn)而與蛋白的親核基團(tuán)如游離氨基、賴(lài)氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等反應(yīng)，在酚環(huán)上形成C-N和C-S共價(jià)鍵，最終形成穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物[31]。

表1 SPI及其共價(jià)復(fù)合物和物理混合物的巰基含量、自由氨基含量、TA結(jié)合當(dāng)量和多糖接枝度

游離巰基是蛋白質(zhì)中最具活性的官能團(tuán)之一，和蛋白質(zhì)變性及其功能特性密切相關(guān)。由表1可知，與SPI相比，SPI-TA共價(jià)復(fù)合物的游離巰基含量顯著下降(P<0.05)，這可能是由于部分巰基被氧化成二硫鍵或是二硫鍵相互轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的[21]。此外，TA在堿性處理?xiàng)l件下產(chǎn)生的醌類(lèi)物質(zhì)也可直接與巰基發(fā)生相互作用形成C-S共價(jià)鍵，從而顯著地降低SPI中巰基的含量[32]。SPI-TA-MD/PD三元共價(jià)復(fù)合物的巰基含量相比于物理混合物更高(P<0.05)，這是因?yàn)闈穹览路磻?yīng)的條件會(huì)導(dǎo)致SPI的構(gòu)象變化，反應(yīng)過(guò)程中巰基基團(tuán)逐漸暴露于SPI表面，因此巰基含量增加，這與Xu等[33]的研究結(jié)果相似。

評(píng)估自由氨基含量可以分析蛋白質(zhì)-多酚共價(jià)復(fù)合物中多酚的結(jié)合程度，這種方法也常用來(lái)測(cè)定美拉德反應(yīng)的進(jìn)程。由表1可知，相比于SPI，SPI-TA共價(jià)復(fù)合物中自由氨基量減少15.15%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Xu等[7]的研究相似。由于SDS可以破壞蛋白質(zhì)和多酚間的非共價(jià)鍵，結(jié)果中的自由氨基含量降低表明，SPI與TA可能發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，生成了C-N共價(jià)鍵[18]。

SPI-TA與多糖經(jīng)過(guò)濕法美拉德反應(yīng)后，SPI-TA-MD、SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物中自由氨基都顯著降低(P<0.05)，因?yàn)槊览路磻?yīng)發(fā)生時(shí)，蛋白質(zhì)自由氨基和還原糖羰基通過(guò)共價(jià)連接形成席夫堿。SPI-TA-MD共價(jià)復(fù)合物中自由氨基的濃度低于SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物(P<0.05)，計(jì)算可得SPI-TA-MD共價(jià)復(fù)合物中MD的接枝度為46.54%，SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物中PD的接枝度為32.26%，說(shuō)明SPI-TA和MD之間美拉德反應(yīng)程度更高。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生主要由兩種多糖的結(jié)構(gòu)差異所致。一方面，PD是通過(guò)葡萄糖與山梨醇在檸檬酸的催化下真空熔融縮合制備，是高度分支的非消化葡萄糖聚合物，平均具有10或12個(gè)葡萄糖分子[34-35]；而MD的平均聚合度為18，高于PD，因此在美拉德反應(yīng)中當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和多糖之間的質(zhì)量比相同時(shí)，MD具有比PD更多數(shù)量的C-末端分子，更易與SPI發(fā)生反應(yīng)，因此接枝度更高。另一方面，MD水溶液的黏度比PD的更小，有利于蛋白質(zhì)和多糖的美拉德反應(yīng)[36]。有研究報(bào)道，糖的分子流動(dòng)性可能是蛋白質(zhì)與糖接枝反應(yīng)具有不同反應(yīng)速率的原因[37]。

2.2 共價(jià)接枝對(duì)SPI分子質(zhì)量的影響

SPI及其共價(jià)復(fù)合物的SDS-PAGE結(jié)果如圖1。由圖1可知，泳道2中條帶的遷移率不同，在35 kDa附近、50 kDa附近以及70～100 kDa 都有條帶分布，分別對(duì)應(yīng)著SPI的A亞基、β亞基、α和α′亞基部分[12]。泳道3、泳道4和泳道5在250 kDa以上有條帶分布，表明二元復(fù)合物和三元復(fù)合物的分子量高于SPI，這是因?yàn)門(mén)A在反應(yīng)過(guò)程中氧化成其相應(yīng)的醌，并被SPI側(cè)鏈中的親核基團(tuán)攻擊，導(dǎo)致與SPI發(fā)生交聯(lián)，形成大分子蛋白質(zhì)聚集體[12, 38-39]。由于實(shí)驗(yàn)時(shí)使用的上樣緩沖液中含有SDS和β-巰基乙醇，可以破壞蛋白質(zhì)與多酚或多糖之間的非共價(jià)鍵，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SPI和TA之間形成了共價(jià)鍵。并且從圖1中可以看出SPI在經(jīng)過(guò)TA修飾后，主要亞基部分的條帶顏色也都明顯變淺，這是因?yàn)橄鄳?yīng)蛋白質(zhì)亞基參與了共價(jià)反應(yīng)從而被消耗。通過(guò)對(duì)比泳道3、泳道4、泳道5中250 kDa分子質(zhì)量以上的條帶分布可以發(fā)現(xiàn)，泳道4和泳道5中高分子質(zhì)量條帶的顏色略淺于泳道3，這可能是因?yàn)镸D、PD與SPI-TA共價(jià)結(jié)合消耗了部分SPI-TA，并且形成分子量更大的三元共價(jià)復(fù)合物聚集體[38]。

泳道1～5分別對(duì)應(yīng)蛋白Marker、SPI、SPI-TA、SPI-TA-MD 共價(jià)復(fù)合物和SPI-TA-PD 共價(jià)復(fù)合物。α、α′、β和A為大豆分離蛋白的亞基。

2.3 共價(jià)接枝對(duì)SPI紫外- 可見(jiàn)光吸收光譜的影響

通過(guò)紫外- 可見(jiàn)光吸收光譜研究蛋白質(zhì)和多酚的相互作用，SPI、SPI-TA、三元共價(jià)復(fù)合物和三元物理混合物的紫外- 可見(jiàn)光吸收光譜結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 大豆分離蛋白及其共價(jià)復(fù)合物和物理 混合物的紫外- 可見(jiàn)光吸收光譜

由圖2可知，樣品的吸光度均在285 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)峰值，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中的一些氨基酸如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸具有紫外吸收性質(zhì)。SPI僅在283 nm處顯示吸收峰，而SPI-TA和SPI-TA-MD、SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物不僅在286 nm處具有最大吸收峰，而且在370 nm處出現(xiàn)了一個(gè)肩峰，肩峰的出現(xiàn)是因?yàn)镾PI與TA的共價(jià)結(jié)合[10]。SPI共價(jià)接枝TA后，最大吸收峰波長(zhǎng)紅移，說(shuō)明SPI的氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化。并且SPI與TA、MD、PD的共價(jià)交聯(lián)使蛋白質(zhì)發(fā)生解折疊，導(dǎo)致色氨酸與酪氨酸殘基暴露到了蛋白質(zhì)的表面，使得吸光度增加。

2.4 共價(jià)接枝對(duì)SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖3 TA、SPI、SPI-TA、SPI-TA-MD和SPI-TA-PD共價(jià) 復(fù)合物及物理混合物的FTIR光譜

據(jù)報(bào)道，多酚可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，主要是α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲之間的轉(zhuǎn)換[42]，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與酰胺Ⅰ帶峰的對(duì)應(yīng)關(guān)系是α-螺旋(1 646～1 664 cm-1)、β-折疊(1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角(1 664～1 681 cm-1)和無(wú)規(guī)則卷曲(1 637～1 645 cm-1)。利用peakfit軟件對(duì)樣品的酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)進(jìn)行傅里葉變換、高斯去卷積可以大致得出蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，如圖4。由圖4可知，接枝TA后，SPI的β-折疊結(jié)構(gòu)減少了12.30%，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的比例分別增加了7.33%、12.09%、4.39%。這和呂思瑤等[43]關(guān)于SPI和染料木素共價(jià)作用的研究結(jié)果相似，說(shuō)明TA對(duì)SPI造成了不可逆的結(jié)構(gòu)改變。相比于SPI-TA以及相應(yīng)的三元物理混合物，三元共價(jià)復(fù)合物表現(xiàn)出β-折疊結(jié)構(gòu)進(jìn)一步減少，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量進(jìn)一步增加，這是因?yàn)镸D、PD與SPI-TA 的共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)的變化和蛋白質(zhì)分子的展開(kāi)。研究報(bào)道，蛋白質(zhì)和多糖之間的美拉德反應(yīng)會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)造成影響，不僅是由于生物聚合物的相互作用，而且和濕法美拉德反應(yīng)過(guò)程中蛋白質(zhì)的熱變性有關(guān)[44]。

圖4 SPI及其共價(jià)復(fù)合物和物理混合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

2.5 共價(jià)接枝對(duì)SPI溶解性的影響

溶解性是蛋白質(zhì)最重要的特性之一，會(huì)影響蛋白質(zhì)的其他功能特性，例如乳化性[45]、膠凝特性[36]。植物蛋白溶解性差，限制了它們作為功能成分在藥物和食品中的應(yīng)用[46]。SPI及其共價(jià)復(fù)合物和物理混合物的溶解性如圖5。由圖5可知，SPI接枝TA后形成的SPI-TA共價(jià)復(fù)合物的溶解性顯著下降。在共價(jià)反應(yīng)的堿性條件下，TA氧化為醌類(lèi)物質(zhì)，與SPI側(cè)鏈通過(guò)C-N鍵形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而形成了不溶性聚集體，其分子質(zhì)量也有所增加。凝膠電泳結(jié)果(圖1)也與這一結(jié)論相一致，這和代世成等[29]關(guān)于SPI和兒茶素共價(jià)復(fù)合物溶解性的研究結(jié)果相似。相比于SPI，SPI-TA-MD、SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物的溶解性分別提高了32.17%、26.45%，這與反應(yīng)的多糖有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)在美拉德反應(yīng)條件下，SPI的溶解性會(huì)提高[1, 47]。在美拉德反應(yīng)初期，暴露在蛋白表面的自由氨基可以較快地與親水性的MD、PD反應(yīng)生成富含糖基的產(chǎn)物[48]。三元共價(jià)復(fù)合物比蛋白質(zhì)本身或者三元物理混合物具有更多的親水基團(tuán)，產(chǎn)生的空間位阻可以阻止SPI分子之間的相互作用并提高SPI與水分子之間的親和力[49-50]，因此三元共價(jià)復(fù)合物具有更好的溶解性。

不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.6 共價(jià)接枝對(duì)SPI抗氧化活性的影響

因?yàn)椴煌寡趸椒y(cè)定原理不同，單一的測(cè)定方法不能準(zhǔn)確地評(píng)估活性物質(zhì)的抗氧化能力。因此本研究分別以ABTS+自由基清除率、DPPH自由基清除率和Fe3+還原能力為指標(biāo)，測(cè)定蛋白及其復(fù)合物的抗氧化活性，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，TA具有很強(qiáng)的抗氧化性，可作為抗氧化劑用于食品中，能夠有效地延長(zhǎng)食品的貨架期。本研究中，SPI、TA、SPI-TA共價(jià)復(fù)合物、三元共價(jià)復(fù)合物和三元物理混合物的ABTS+自由基清除活性、DPPH自由基清除活性和Fe3+還原能力分別如圖6所示。由圖6可知，天然SPI的ABTS+自由基清除活性、DPPH自由基清除活性和還原能力較弱，而SPI-TA共價(jià)復(fù)合物顯示出較高的抗氧化活性(P<0.05)。SPI-TA共價(jià)復(fù)合物的ABTS+自由基清除活性為66.36%，是SPI的3.41倍；SPI-TA共價(jià)復(fù)合物的DPPH自由基清除活性為71.53%，是SPI的8.50倍；SPI-TA共價(jià)復(fù)合物的還原能力是SPI的12.93倍。研究結(jié)果表明，SPI共價(jià)結(jié)合TA后形成的二元復(fù)合物具有強(qiáng)烈的自由基清除能力，能終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。這主要是由于共價(jià)反應(yīng)后SPI分子中引入了更多的羥基，羥基對(duì)物質(zhì)的抗氧化能力有較大的貢獻(xiàn)。同時(shí)二元和三元復(fù)合物的抗氧化能力低于相同濃度的TA溶液，這與蛋白和多酚的反應(yīng)機(jī)制有關(guān)，兩者的共價(jià)結(jié)合消耗了TA中部分的羥基。此外，空間位阻也在一定程度上導(dǎo)致共價(jià)結(jié)合的蛋白- 酚類(lèi)化合物抗氧化能力的下降[51]。

由圖6可知，2種三元共價(jià)復(fù)合物相比于SPI、SPI-TA以及它們的三元物理混合物具有更高的抗氧化活性。有研究表明，蛋白與還原糖通過(guò)美拉德反應(yīng)可以得到具有抗氧化性的產(chǎn)物[52]。SPI-TA和多糖反應(yīng)過(guò)程中生成的中間體還原酮化合物能夠打破氫原子供給的自由基鏈，并被認(rèn)為是自由基鏈反應(yīng)的終止劑[53]。這可能是提高2種三元共價(jià)復(fù)合物的抗氧化活性的重要原因。由此可見(jiàn)，三元共價(jià)復(fù)合物可用作食品中有效的抗氧化劑，防止脂質(zhì)氧化。

不同小寫(xiě)字母代表同一指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。

2.7 共價(jià)接枝對(duì)SPI乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

與多糖發(fā)生美拉德反應(yīng)是提升蛋白乳化活性的重要手段[54]，多酚的共價(jià)結(jié)合同樣會(huì)影響蛋白的乳化性能。SPI、SPI-TA、三元共價(jià)復(fù)合物和三元物理混合物的乳化活性、乳化穩(wěn)定性如表2所示。

由表2可知，SPI在接枝TA、MD、PD后形成的共價(jià)復(fù)合物的乳化活性顯著上升(P<0.05).相比于天然SPI，SPI-TA的乳化活性提高了149.04%。這是由于反應(yīng)過(guò)程中TA的羥基與SPI的殘基結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，更多的疏水基團(tuán)暴露在蛋同列不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

表2 SPI及其共價(jià)復(fù)合物和物理混合物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性

白表面，增加了SPI與油滴的結(jié)合能力，因此乳化能力提高。SPI-TA-MD、SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物的乳化活性相比于SPI-TA分別提高了45.25%、48.95%，并且都顯著高于其物理混合物(P<0.05)。這是因?yàn)闈穹览路磻?yīng)進(jìn)一步打開(kāi)了SPI的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了其在油水兩相界面的吸附作用。此外，相比于SPI和SPI-TA，SPI-TA-MD、SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性也顯著提高(P<0.05)，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)表面吸附大量多糖后，蛋白質(zhì)分子之間的強(qiáng)靜電排斥會(huì)產(chǎn)生空間位阻，形成的乳液液滴較小，從而得到更加穩(wěn)定的乳液[55]。

2.8 共價(jià)接枝對(duì)SPI起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

起泡特性是衡量許多食品品質(zhì)的重要因素，比如牛奶、冰淇淋、鮮奶油、蛋糕和面包等[8]。蛋白質(zhì)溶液經(jīng)快速攪打使大量氣體進(jìn)入溶液中，降低其表面張力后形成泡沫的能力稱(chēng)作蛋白的起泡性[56]，泡沫穩(wěn)定性是指泡沫產(chǎn)生后穩(wěn)定泡沫的能力，影響起泡能力的因素多且不易控制[28]。SPI及其共價(jià)復(fù)合物和物理混合物的起泡性、起泡穩(wěn)定性如圖7。

不同小寫(xiě)字母代表起泡性差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母代表起泡穩(wěn)定性差異顯著(P<0.05)。

由圖7可知，SPI的起泡性為95.75%，SPI-TA的起泡性為116.44%，共價(jià)接枝了TA后，SPI的起泡性顯著提高(P<0.05)。這是因?yàn)镾PI和TA形成的共價(jià)交聯(lián)結(jié)構(gòu)可以使蛋白在氣-液表面的快速吸附以及展開(kāi)重排，增強(qiáng)了泡沫的形成能力[21]。多糖的加入同樣提高了蛋白的起泡性，SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物和物理混合物的起泡性能分別為166.67%、162.99%，相比于SPI-TA二元共價(jià)復(fù)合物分別提高了50.23%、46.55%。一方面是因?yàn)镻D的引入顯著提高了樣品溶液的黏度，使得其起泡性顯著提高(P<0.05)；另一方面，SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物中的蛋白具有較好的溶解性(圖5)，這允許蛋白質(zhì)分子更有效地轉(zhuǎn)移到空氣- 水界面[57]。并且不同多糖的加入，起泡性的改變程度不同，SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物的起泡性顯著優(yōu)于SPI-TA-MD共價(jià)復(fù)合物(P<0.05)。這和多糖的性質(zhì)有關(guān)，PD的水溶液比MD的水溶液具有更高的黏度。剪切30 min后測(cè)得各個(gè)樣品的泡沫穩(wěn)定性沒(méi)有顯著差異，表明TA、MD、PD的加入不會(huì)對(duì)蛋白的泡沫穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。SPI-TA的泡沫穩(wěn)定性略高于SPI，這是因?yàn)槎喾拥募尤虢档土说鞍捉缑娴谋砻鎵毫?，使得界面薄膜變得更加穩(wěn)定。

2.9 共價(jià)接枝對(duì)SPI表面疏水性的影響

表面疏水性是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的重要指標(biāo)，與其乳化特性密切相關(guān)。SPI及其共價(jià)復(fù)合物的表面疏水性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8。由圖8可知，SPI在接枝TA、MD、PD后，共價(jià)復(fù)合物的表面疏水性顯著提高(P<0.05)。SPI-TA表面疏水性提高是因?yàn)門(mén)A附著在親水性的氨基酸上，并且共價(jià)接枝使得SPI的構(gòu)象展開(kāi)，導(dǎo)致內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露在SPI分子表面上[58]。Mendis等[59]研究發(fā)現(xiàn)β-折疊含量的減少表明疏水相關(guān)位點(diǎn)可能暴露。研究結(jié)果中SPI-TA二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊減少(圖4)和疏水性的提高證實(shí)了這一點(diǎn)。SPI-TA-MD、SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物的表面疏水性更高，這和濕熱處理有關(guān)。熱處理使蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)進(jìn)一步暴露，二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變同樣影響了三元共價(jià)復(fù)合物的表面疏水性。同干法糖基化相比，濕法美拉德反應(yīng)可導(dǎo)致更多的疏水基團(tuán)暴露于蛋白質(zhì)表面[20]。本研究表明，TA、MD、PD的共價(jià)接枝可以改善SPI的表面疏水性。

不同小寫(xiě)字母代表組間差異顯著(P<0.05)。

2.10 共價(jià)接枝對(duì)SPI熱穩(wěn)定性的影響

加熱可以改變蛋白質(zhì)分子間的作用力，破壞其內(nèi)部的化學(xué)鍵，變性溫度越高，說(shuō)明熱穩(wěn)定性越高。差示掃描量熱(differential scanning calorimetry，DSC)是一種有效的熱分析手段。樣品的DSC圖譜見(jiàn)圖9。由圖9可知，圖中的吸熱峰值主要?dú)w因于SPI的熱變性，SPI-TA的變性溫度為117.53 ℃，高于SPI的變性溫度108.5 ℃，說(shuō)明TA對(duì)SPI的共價(jià)修飾提高了SPI的熱穩(wěn)定性。這是因?yàn)镾PI經(jīng)過(guò)TA修飾之后，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。Liu等[19]研究也發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白與綠原酸共價(jià)后其變性溫度提高了4.29 ℃。SPI-TA-MD、SPI-TA-PD物理混合物的變性溫度分別為115.34、119.37 ℃，SPI-TA-MD、SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物的變性溫度分別為111.14、110.39 ℃。2種三元共價(jià)復(fù)合物的變性溫度均高于天然SPI，但是低于SPI-TA及其對(duì)應(yīng)的物理混合物。一方面歸因于SPI-TA分子被MD、PD共價(jià)修飾后有序結(jié)構(gòu)比例的降低以及無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的增加，這和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致；另一方面，這可能是因?yàn)楣矁r(jià)復(fù)合物在濕法美拉德反應(yīng)條件下部分蛋白變性導(dǎo)致的。本研究結(jié)果表明，TA和MD、PD的共價(jià)接枝可以對(duì)SPI的熱變性起到一定的保護(hù)作用。

圖9 SPI及其共價(jià)復(fù)合物和物理混合物的 差示掃描量熱分析

3 結(jié) 論

以SPI、TA、MD、PD為原料，通過(guò)堿處理法、濕法美拉德反應(yīng)制備SPI-TA共價(jià)復(fù)合物和SPI-TA-MD、SPI-TA-PD三元共價(jià)復(fù)合物，研究多酚(TA)和多糖(MD、PD)的共價(jià)修飾對(duì)SPI結(jié)構(gòu)和功能特性的影響。通過(guò)反應(yīng)基團(tuán)的光譜以及電泳分析，證實(shí)SPI-TA和SPI-TA-MD、SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物的形成。SPI-TA中TA的接枝量為(35.56±1.32) μmol/g，SPI-TA-MD、SPI-TA-PD三元共價(jià)復(fù)合物中MD和PD的接枝度分別為46.54%、32.26%。紫外- 可見(jiàn)光吸收光譜和紅外光譜分析SPI及其共價(jià)復(fù)合物和物理混合物的結(jié)果表明：TA、MD、PD的共價(jià)接枝改變了SPI的結(jié)構(gòu)，使SPI的β-折疊含量下降，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的含量增加；相比于SPI、SPI-TA和三元物理混合物，同時(shí)共價(jià)接枝了多酚和多糖的SPI-TA-MD、SPI-TA-PD三元共價(jià)復(fù)合物表現(xiàn)出更加優(yōu)異的溶解性、乳化性、抗氧化活性、起泡性、表面疏水性和熱穩(wěn)定性。2種三元共價(jià)復(fù)合物具有較為相似的結(jié)構(gòu)和功能特性，但是SPI-TA-PD共價(jià)復(fù)合物的起泡性顯著優(yōu)于SPI-TA-MD共價(jià)復(fù)合物。SPI-TA-MD、SPI-TA-PD三元共價(jià)復(fù)合物可以作為新型的乳化劑、抗氧化劑和起泡劑用于食品工業(yè)，以期為大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性?xún)?yōu)化提供新思路。