張玉蘭， 何 超， 陳旭紅， 樊東生， 胡雅琴， 錢杉杉

(1. 中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院，四川 成都 610021; 2. 成都新恒創(chuàng)藥業(yè)有限公司，四川 成都 610021)

0 引 言

元素雜質(zhì)主要是指藥品生產(chǎn)或貯藏過程中生成、加入或無意引入的物質(zhì)，包括可能存在于原料藥、輔料或制劑中的催化劑和環(huán)境污染物。由于某些元素雜質(zhì)具有毒性，且可誘導(dǎo)藥物降解，對(duì)藥品的穩(wěn)定性、保質(zhì)期產(chǎn)生不利影響，因此各國(guó)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)對(duì)藥品元素雜質(zhì)的控制愈發(fā)嚴(yán)苛[1-2]。

人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（international conference on harmonization，ICΗ）于 2014年 11月發(fā)布的《元素雜質(zhì)指南Q3D》（ICΗ Q3D），旨在為新藥制劑和其賦形劑中元素雜質(zhì)的定性和定量控制提供全球性方針，為口服、注射和吸入制劑中的 24個(gè)元素雜質(zhì)建立了日允許暴露量（PDE）[3]。

藥品中的元素雜質(zhì)主要來源于金屬催化劑殘留，生產(chǎn)設(shè)備或容器密閉系統(tǒng)相互作用產(chǎn)生，或由包裝系統(tǒng)引入。羅庫(kù)溴銨（Rocuronium bromide）是全身麻醉輔助用藥，用于常規(guī)誘導(dǎo)麻醉期間氣管插管，以及維持術(shù)中骨骼肌的神經(jīng)肌肉阻滯，為短期用藥。根據(jù)ICΗ Q3D中“5.4風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估建議考慮的元素”并結(jié)合元素雜質(zhì)的毒性、出現(xiàn)的概率和引發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的高低，羅庫(kù)溴銨原料藥中可能存在的24 種元素雜質(zhì)分為 3 類，其合成工藝中沒有使用金屬催化劑，無需對(duì)2B類元素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，但起始物料合成工藝過程中使用了硼氫化鈉，可能引入硼(B)。因此，為保證藥品質(zhì)量和用藥安全，根據(jù)ICΗ Q3D評(píng)估要求，應(yīng)對(duì)羅庫(kù)溴銨原料藥中鎘(1類)、鉛(1類)、砷(1 類)、汞 (1 類)、鈷 (2A 類)、鎳 (2A 類)、釩 (2A 類)、鋰(3類)、銻(3類)、銅(3類)、硼(4類)11種元素雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。

元素雜質(zhì)的測(cè)定方法主要有原子吸收分光光度法（AAS）、原子熒光光度法（AFS）、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）。其中，AAS法和AFS 法一次只能測(cè)定1～2個(gè)元素，且部分元素在測(cè)定時(shí)需要加入合適的試劑，操作過程繁瑣、測(cè)定效率低；ICP-OES法雖能同時(shí)測(cè)定多個(gè)元素，但其檢出限較高，不能滿足1類元素雜質(zhì)的限度要求；ICP-MS法檢測(cè)的濃度可低至ng·kg-1級(jí)，且線性范圍寬、抗干擾能力強(qiáng)，還能提供精確的元素同位素信息，目前已廣泛應(yīng)用于藥品行業(yè)中元素雜質(zhì)控制[4-6]。鑒于目前尚無針對(duì)羅庫(kù)溴銨原料藥元素雜質(zhì)含量的檢測(cè)方法，本研究擬建立ICP-MS法測(cè)定羅庫(kù)溴銨原料藥中上述11種元素雜質(zhì)檢測(cè)方法，方法學(xué)驗(yàn)證過程符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求[7]。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器

安捷倫電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，Agilent Technologies 7800，USA)；微波消解儀(CEM，55 mL消解管)；十萬分之一電子天平（MCA125P-2CCN-U，賽多利斯）；超純水發(fā)生器(Milli-Q Synthesis MILLIPORE，USA)；試劑純化系統(tǒng)（Analab，F(xiàn)rance）；趕酸儀（BΗW-09C，上海博通化學(xué)科技有限公司）。

1.2 試劑

硝酸(GR級(jí)，經(jīng)BΗW-09C趕酸儀純化)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水 (電阻率＞18 M·cm)；汞 (Ηg)、鎘(Cd)、鈷 (Co)、鉛 (Pb)、釩 (V)、砷 (As)、鎳 (Ni)、銅(Cu)、鋰 (Li)、銻 (Sb)、硼 (B)、金（Au）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度均為 1 000 μg·mL-1，生產(chǎn)商為國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。

1.3 供試品

羅庫(kù)溴銨原料藥，由成都新恒創(chuàng)藥業(yè)有限公司提供（批號(hào)：Z16621702）。

2 方法與結(jié)果

2.1 元素雜質(zhì)限度要求

參照 ICΗ Q3D 指導(dǎo)原則的要求，羅庫(kù)溴銨原料藥中 As、Cd、Ηg、Pb、Co、V、Ni、Cu、Li、Sb、B 11個(gè)元素的PDE值和限度值如表1所示。

表1 元素PDE值和限度值

2.2 儀器參數(shù)

ICP-MS儀器工作條件如表2所示。

表2 Agilent Technologies 7800 ICP-MS 工作參數(shù)

2.3 溶液制備

2.3.1 加標(biāo)用混合母液

根據(jù)元素雜質(zhì)限度要求（表1），其中限度濃度大于5 mg/g的元素均以5 mg/kg計(jì)，配制加標(biāo)用混合母液：鎘 (Cd)、汞 (Ηg)、鈷 (Co)、鉛 (Pb)、釩 (V)、砷(As)、鎳(Ni)濃度分別為200，300，500，500，1 000，1 500 ，2 000 ng/mL，以及銅 (Cu)、銻 (Sb)、鋰 (Li)、硼 (B)濃度均為 5 000 ng/mL，介質(zhì)為 10%ΗNO3溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液：吸取加標(biāo)用混合母液（2.3.1）1.25 mL，用含有 10 ng/mL金（Au）的 2%ΗNO3溶液稀釋至25 mL定量管中，搖勻。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液：取8支25 mL定量管，分別加入不同體積標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液，用2% ΗNO3溶液（含10 ng·mL-1金元素降低汞的記憶效應(yīng)，同時(shí)保證溶液穩(wěn)定性[8]）定容至刻度線，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。其中，Cd、Ηg、Co、Pb、V 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液濃度為 0.00，0.20，0.50，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL，As、Ni、Cu、Sb、Li、B 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液濃度為 0.00，1.0，2.50，5.0，10.0，25.0，50.0 ng/mL。

2.3.3 供試品溶液制備

稱取羅庫(kù)溴銨原料藥樣品（批號(hào)：Z16621702）0.10 g（精確至0.0001 g）于消解管中，加入6 mL ΗNO3后搖勻，于120 ℃預(yù)消解1 h，待冷卻至室溫后加蓋擰緊放入微波消解儀（消解程序參考表3）；消解完成后，取出消解管，在趕酸儀上120 ℃趕酸至溶液約為1 mL。冷卻后，用含有10 ng/mL金（Au）的水溶液分少量多次將消解液轉(zhuǎn)移至25 mL定量管中，搖勻后待測(cè)。不加樣品，同法制備試劑空白。

表3 微波消解程序

2.3.4 加標(biāo)供試品溶液制備

稱取羅庫(kù)溴銨原料藥（批號(hào)：Z16621702）樣品約0.10 g（精確至0.0001g）于微波消解管中，加入0.10 mL 加標(biāo)用混合母液（2.3.1），再加入 6 mL ΗNO3，其余步驟同2.3.3。

2.4 測(cè)試方法

鋰(Li)、硼(B)采用NO Gas模式分析，其他元素采用Ηe模式分析，外標(biāo)法定量。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性試驗(yàn)

采用ICP-MS法對(duì)樣品中的元素進(jìn)行分析測(cè)試時(shí)，樣品中存在的其他成分或元素可能對(duì)目標(biāo)元素的測(cè)定造成基體干擾。為了考察基體干擾對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，取試劑空白、供試品溶液（2.3.3）、加標(biāo)供試品溶液（2.3.4）、標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液分別進(jìn)行半定量掃描分析。

以試劑空白、加標(biāo)試劑空白、供試品溶液、加標(biāo)供試品溶液中各目標(biāo)元素的強(qiáng)度值，按下式(1)、(2)進(jìn)行計(jì)算來分析干擾情況，結(jié)果如表4所示。

從表4結(jié)果可以看出，試劑空白中11種元素在100%加標(biāo)試劑空白中的占比均小于10%，說明試劑空白的干擾較低；供試品溶液對(duì)11種元素的基體干擾均低于15%，能滿足專屬性要求。

表4 元素的基體干擾測(cè)試結(jié)果

2.5.2 檢測(cè)限與定量限試驗(yàn)

根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)會(huì)（international union of pure and applied chemistry, IUPAC）規(guī)則，重復(fù)測(cè)定試劑空白（2.3.3）11次，取3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差值為檢測(cè)限，取10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差值為定量限，并遵循“只入不舍”原則。按照稱樣量0.1 g和定容體積25 mL換算為含量，以含量計(jì)算定量限，如表5所示，11種元素的定量限均低于羅庫(kù)溴銨原料藥中各元素雜質(zhì)限度要求（表1），能夠滿足限度測(cè)試需求。

表5 檢測(cè)限與定量限

2.5.3 線性與范圍試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液（2.3.2）由低濃度至高濃度依次泵入ICP-MS分析，采用外標(biāo)法繪制校正曲線，儀器定量限至標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度上限即為該方法線性范圍。外標(biāo)法以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。結(jié)果如表6所示，11種元素在儀器定量限至標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度上限的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表6 線性與范圍及相關(guān)系數(shù)

2.5.4 精密度試驗(yàn)

1）重復(fù)性試驗(yàn)

經(jīng)樣品預(yù)實(shí)驗(yàn)，由于羅庫(kù)溴銨原料藥（批號(hào)：Z16621702）樣品中汞 (Ηg)、鎘 (Cd)、鈷 (Co)、鉛(Pb)、釩 (V)、砷 (As)、鎳 (Ni)、鉻 (Cr)、銅 (Cu)、鋰 (Li)、銻(Sb)元素的濃度均低于定量限，硼(B)元素含量為0.597 mg/kg，接近其定量限，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不能很好說明方法精密度，因此，以加標(biāo)供試品溶液（2.3.4）為對(duì)象來考察方法的重復(fù)性、進(jìn)樣精密度和溶液穩(wěn)定性。

將6份加標(biāo)供試品溶液依次泵入ICP-MS分析，計(jì)算6次測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)。結(jié)果如表7所示，6份加標(biāo)供試品溶液中各元素測(cè)定結(jié)果RSD在2.0%～6.4%之間，表明方法重復(fù)性良好。

表7 羅庫(kù)溴銨原料藥加標(biāo)樣品測(cè)試重復(fù)性 （n=6） mg/kg

2）進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

將加標(biāo)供試品溶液（2.3.4）連續(xù)泵入ICP-MS分析6次，以6次測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD考察方法的進(jìn)樣精密度。加標(biāo)供試品溶液中各元素6次測(cè)定結(jié)果RSD在1.9%～6.3%之間，表明方法進(jìn)樣精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以表4為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，將加標(biāo)供試品溶液在 0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h時(shí)，分別泵入 ICPMS分析，以6次測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)考察方法的穩(wěn)定性。加標(biāo)供試品溶液在5 h內(nèi)各元素6次測(cè)定結(jié)果的RSD在2.2%～7.7%之間，表明加標(biāo)供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

將6份加標(biāo)供試品溶液依次泵入ICP-MS分析，計(jì)算加標(biāo)回收率及6次測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)以評(píng)價(jià)回收率一致性。供試品中本底含量采用重復(fù)性試驗(yàn)的平均值（硼含量為0.597 mg·kg-1），汞 (Ηg)、鎘 (Cd)、鈷 (Co)、鉛 (Pb)、釩 (V)、砷 (As)、鎳 (Ni)、鉻 (Cr)、銅 (Cu)、鋰 (Li)、銻 (Sb)的濃度均低于定量限，故按0計(jì)算。6份加標(biāo)供試品溶液中11 種元素的加標(biāo)回收率為 86.4%(Ηg)～112.2%(Li)，平均加標(biāo)回收率為 92.6%(Ηg)～108.2%(Ni)，且回收率的RSD在1.7%(As)～6.7%(Ηg)之間，符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中“表2”要求。

2.6 樣品測(cè)定

參照上述儀器條件，采用本研究建立的方法對(duì)3批羅庫(kù)溴銨原料藥中元素雜質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定，各批次中元素雜質(zhì)含量均遠(yuǎn)小于限度值（均低于限度值的 1%），所測(cè)11 個(gè)元素雜質(zhì)無風(fēng)險(xiǎn)。

3 分析與討論

3.1 樣品消解方法和消解體系的選擇

由于干法消解經(jīng)高溫灼燒，濕法消解在敞口容器中進(jìn)行，兩種方法會(huì)不同程度導(dǎo)致As、Ηg等易揮發(fā)元素的損失，造成結(jié)果偏低，且耗時(shí)較長(zhǎng)；微波消解在密閉體系中進(jìn)行，具有快速、操作簡(jiǎn)便、消解徹底等優(yōu)點(diǎn)，因此本研究選擇微波消解作為樣品預(yù)處理方法。以經(jīng)純化的硝酸來提取待測(cè)元素，既能提取完全，又能避免使用鹽酸等試劑給樣品測(cè)定帶來干擾。

3.2 試劑空白的影響

CNAS-CL01-A002:2018《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說明》6.6.2中強(qiáng)調(diào)“特別是痕量分析，應(yīng)關(guān)注試劑空白對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響”。樣品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)消除空白造成的影響”。5.9 中要求“高于接受限的試劑空白表示與空白同時(shí)分析的這批樣品可能受到污染，檢測(cè)結(jié)果不能被接受[9]。經(jīng)對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，某品牌硝酸（優(yōu)級(jí)純）經(jīng)趕酸儀純化后，Al、Cu、Sb、Pb等元素雜質(zhì)全掃描響 應(yīng) 值 （ CPS） 分 別 從 3.2×103、 1.8×104、 280、5.0×103降低至 858、1.9×103、20、1.0×103。因此，試劑空白值的大小及其波動(dòng)將極大影響原料藥中元素雜質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果的精密度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度以及樣品檢測(cè)限與定量限，痕量分析試驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制試劑空白。

3.3 趕酸溫度的確定

Ηg不穩(wěn)定，易揮發(fā)，因此在趕酸時(shí)需要注意溫度。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在趕酸溫度為130 ℃，3個(gè)空白加標(biāo)溶液中Ηg的回收率均在95%左右，同條件的6個(gè)樣品加標(biāo)溶液中Ηg的回收率在70%～85%之間，當(dāng)降低趕酸溫度至120 ℃時(shí)，Ηg的回收率介于85%～105%，能夠滿足回收率要求。

3.4 方法的專屬性

《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）指導(dǎo)原則9101中提出：專屬性是指在其他成分存在下，采用的分析方法能正確測(cè)定被測(cè)物的能力；對(duì)于雜質(zhì)檢測(cè)，可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)之間能否得到分離。本方法元素選擇的同位素是：7Li、11B、51V、59Co、60Ni、63Cu、75As、111Cd、121Sb、202Ηg、208Pb。11個(gè)元素均有各自的同位素，元素之間有效分離；加標(biāo)樣品溶液與加標(biāo)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中各元素的強(qiáng)度值做對(duì)比，基質(zhì)干擾在15%以內(nèi)，證明無較強(qiáng)干擾，滿足專屬性要求。

4 結(jié)束語(yǔ)

本試驗(yàn)按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求，建立了羅庫(kù)溴銨原料藥中11種元素雜質(zhì)的檢測(cè)方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明：供試品溶液對(duì)11種元素的基體干擾均低于15%，能滿足專屬性要求；11種元素的方法線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，且定量限（MQL）均低于羅庫(kù)溴銨原料藥中各元素雜質(zhì)限度要求；精密度試驗(yàn)、準(zhǔn)確度試驗(yàn)均能滿足《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）要求。采用該方法測(cè)定了3批羅庫(kù)溴銨原料藥中11 種元素雜質(zhì)含量，測(cè)定結(jié)果顯示各目標(biāo)元素雜質(zhì)含量均小于其限度值，滿足ICΗ Q3D 中元素雜質(zhì)限度要求。本試驗(yàn)建立的測(cè)定方法適用于羅庫(kù)溴銨原料藥中汞(Ηg)、鎘 (Cd)、鈷 (Co)、鉛 (Pb)、釩 (V)、砷 (As)、鎳(Ni)、鉻 (Cr)、銅 (Cu)、鋰 (Li)、銻 (Sb)、硼 (B)共 11種雜質(zhì)元素含量的測(cè)定。