舒 軍，王嘯旗，郭寧馨，李旭凱，高建華，王興春，侯思宇，趙雄偉

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院/雜糧種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種山西省重點實驗室，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801）

谷子（Setaria italica）是耐貧瘠抗旱作物，在亞洲半干旱地區(qū)（印度、中國和日本）以及南歐廣泛種植，有著悠久的種植歷史[1-3]。近年來，隨著新一代谷子高質(zhì)量全基因組序列的公布和谷子突變體“xiaomi”的出現(xiàn)，其作為C4模式植物也得到了越來越多研究人員的關(guān)注和認可[4-8]。谷子去殼后稱為小米，主要包括維生素、碳水化合物、葉酸、類胡蘿卜素和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，并且具有較高的氨基酸含量[9-11]。有研究表明，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸等人體必需氨基酸在蛋白質(zhì)合成方面有明顯的增強作用[12]。此外，小米中富含的甲硫氨酸在抗脂肪肝和促進人體胰島素分泌方面有重要作用，并且可以促進血清素的分泌，還有助睡眠的功效[13-14]。因此，提升小米中的氨基酸含量是改善人們膳食結(jié)構(gòu)多樣性的有力保障。

前期研究者已對小米的氨基酸組分及其含量進行分析。馮耐紅等[15]研究結(jié)果表明，供試10種山西主推品種小米富含17種氨基酸，其中必需氨基酸種類齊全，含量豐富，尤其谷氨酸和亮氨酸含量較高。與其他作物相比，小米中8種人體必需氨基酸含量豐富，占整個氨基酸總量的41.9%，比大米、小麥粉和玉米分別高出56.4%、80.6%、42.6%[14,16]。谷子中不同種質(zhì)之間氨基酸含量差異較大，特別是賴氨酸的含量較低，不利于優(yōu)質(zhì)小米品種的推廣。目前，主要通過培育高賴氨酸品種、氨基酸強化和飲食搭配等手段來彌補小米賴氨酸缺乏的這一特點。

雖然目前對于小米的營養(yǎng)成分已有研究報道，但其主要從蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪和維生素等方面進行[14,17]，且谷子種質(zhì)資源的氨基酸積累特性研究相對較少。因此，了解清楚來源不同的谷子種質(zhì)之間氨基酸積累特性，以及對氨基酸積累的影響，對篩選和創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)品種具有重要意義。本研究以來源于我國不同省份的154份谷子核心種質(zhì)為研究材料，連續(xù)2 a分析小米中17種氨基酸含量，分析不同氨基酸在谷子小米中的積累特性，以及不同種質(zhì)來源或亞群對氨基酸含量的影響，并篩選核心的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)，為選育谷子優(yōu)良品種提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

基于中國農(nóng)業(yè)科學院刁現(xiàn)民研究員團隊[18]提供的重測序核心谷子種質(zhì)，進一步以盡可能囊括不同地理來源、不同基因型品種多樣性為原則，選擇有代表性的我國154份谷子核心品種（圖1），包括北京2份、甘 肅14份、河 北29份、河 南12份、黑 龍 江12份、吉林17份、江西3份、遼寧7份、內(nèi)蒙古8份、寧夏6份、山東9份、山西25份、陜西3份、四川5份和新疆2份。此外，根據(jù)前期谷子不同種質(zhì)遺傳亞群研究[18]，試驗材料中58份種質(zhì)來自于春谷亞群，96份種質(zhì)來自于夏谷亞群。

圖1 谷子154份核心種質(zhì)來源分布Fig.1 Origin and distribution of 154 core germplasms of foxtail millet

1.2 試驗方法

試驗材料均于2019—2020年種植于山西農(nóng)業(yè)大學雜糧育種基地中，行寬2 m，行距20 cm，單穴播種，株距15 cm，每份種質(zhì)種植3行。待谷穗成熟后，剪取株型和穗大小一致的8穗，晾曬干后混合脫粒并使用小型壟谷機（TP-JLG-2018）去殼碾成小米，去雜過篩（直徑1 mm圓孔篩）制得精小米，每個品種取10 g備用。

1.3 小米中17種氨基酸含量的測定

將1.2中精選的等量小米放于近紅外光譜儀樣品池中，保持自然狀態(tài)（樣品量高度、松緊度一致），利用已建立的小米氨基酸近紅外光譜分析模型對小米中17種氨基酸含量進行測定，分別為谷氨酸（Glu）、精 氨酸（Arg）、脯 氨 酸（Pro）、天 冬 氨 酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、甲硫氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）、組 氨 酸（His）、丙 氨 酸（Ala）、苯 丙 氨 酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、半胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）。樣品掃描前，儀器需預(yù)熱0.5 h以上，以儀器內(nèi)置參比作背景進行校正，所用的近紅外光譜儀型號為Foss DS2500F。每個樣品混合重復(fù)裝樣2次，測量結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 21.0進 行變異系數(shù)和統(tǒng)計分析，并通過SPSS 21.0進行方差分析和主成分分析。使用R語言Hmisc包（Pearson系數(shù)）和Stats包的hclust函數(shù)（系統(tǒng)聚類法）進行相關(guān)性分析和聚類分析，并利用corplot包和ggplot包繪制相關(guān)性圖、箱線圖及聚類圖。

利用綜合主成分值模型，先計算出各主成分的載荷值（Ui），再利用載荷值和各氨基酸含量標準值得出主成分表達式（Yi），最后結(jié)合各主成分的權(quán)重，得出154份小米各氨基酸的綜合主成分值（Y），進而綜合評價小米氨基酸組分特點，篩選出谷子重點氨基酸種質(zhì)資源。

式中，Ui為主成分載荷矩陣，Ai為因子載荷矩陣，λi為主成分特征值，m為提取主成分的個數(shù)。

式中，Yi為第i主成分，Zxj為第j個氨基酸含量的標準值，n為氨基酸個數(shù)17。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米17種氨基酸組分的遺傳多樣性分析

供試谷子種質(zhì)在2019—2020年的氨基酸含量分析及其變異程度如表1所示。

表1 供試谷子種質(zhì)在2019—2020年的氨基酸含量分析及其變異程度Tab.1 Amino acid content analysis and its variation in test germplasms of foxtail millet in 2019 and 2020

通過測定154份谷子種質(zhì)小米的17種氨基酸含量（表1）發(fā)現(xiàn)，小米中總氨基酸含量平均值為11.93%。谷子小米中富含大量的Glu、Ala和Ile（大于1%），其中，Glu的平均含量最高，為2.78%；Pro、Asp含 量 次之，平均 含 量 為0.84%，而Thr、His、Lys、Cys含量較低（小于0.4%），其中Lys和Cys平均含量較低（0.19%）。對2019—2020年小米不同氨基酸含量進行方差分析發(fā)現(xiàn)，除His、Val無顯著差異外，其余的15種氨基酸年份間均存在顯著差異（P<0.05），其中Glu的F值高達838.56。氨基酸含量積累在不同谷子種質(zhì)間也存在顯著差異，變異范圍因不同氨基酸差異較大，其中，Glu、Cys、Leu、Phe和His氨基酸變幅最大，呈現(xiàn)豐富的遺傳多樣性。

通過對氨基酸含量的變異系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，除Glu和Pro的變異系數(shù)在2 a相差大于18%外，其余氨基酸都小于4%，說明前者更容易受環(huán)境的影響。測定的17種氨基酸中有10種（如Glu、Pro、Cys等）的變異系數(shù)都高于10%，其中Clu變異系數(shù)最高，平均值為43.63%，表明這些氨基酸離散程度較大，有豐富的變異性，其余7種氨基酸的變異系數(shù)在3.81%～9.71%，暗示了其受環(huán)境和來源的影響更小，具有更高的穩(wěn)定性。

2.2 不同來源及遺傳亞群的小米氨基酸含量特征分析

為了研究不同地理來源的小米氨基酸變化特征，對2019—2020年連續(xù)2 a的各地區(qū)（品種數(shù)大于10）小米的氨基酸總含量進行分析。由圖2可知，雖然2019年不同地區(qū)的氨基酸總含量普遍高于2020年，但不同地區(qū)的小米氨基酸總含量在2 a間趨勢較為一致。在2019年，黑龍江和甘肅地區(qū)總氨基酸平均含量較高，分別為13.87%和13.82%，其次是吉林和山西地區(qū)（12.96%和12.90%），河南與河北地區(qū)最低。

圖2 不同環(huán)境來源的小米總氨基酸含量分布Fig.2 The distribution of total amino acid content in fox?tail millet grains from different environmental origins

通過對谷子不同遺傳亞群的氨基酸含量分析發(fā)現(xiàn)（圖1），來源于甘肅和黑龍江地區(qū)的種質(zhì)均屬于春谷亞群，山西地區(qū)種質(zhì)占據(jù)56%。河南地區(qū)的種質(zhì)均屬于夏谷亞群，河北和吉林地區(qū)種質(zhì)的96.5%和88.2%屬于夏谷。此外，通過對連續(xù)2 a不同遺傳亞群的小米氨基酸含量特征分析發(fā)現(xiàn)（圖3），春谷亞群小米的Ile、Leu等5種人體必需氨基酸及Ala、Arg、Asp等8種非必需氨基酸的含量顯著高于夏谷亞群（P<0.05），Thr僅在2019年春谷亞群中極顯著高于夏谷亞群（P<0.01）。以上結(jié)果表明，春谷亞群小米的品質(zhì)明顯高于夏谷品質(zhì)，也暗示了甘肅、黑龍江和山西等北方地區(qū)更適宜優(yōu)質(zhì)谷子品種的種植。

圖3 2019、2020年春谷與夏谷亞群的氨基酸含量比較分析Fig.3 Comparative analysis of amino acid content between spring-sown millet group and summer-sown millet group in 2019 and 2020

2.3 小米17種氨基酸之間的相關(guān)性分析

為了研究小米中不同氨基酸含量之間的關(guān)系，本研究對2019—2020年連續(xù)2 a的17種氨基酸含量進行相關(guān)性分析（圖4）。結(jié)果顯示，除了Phe、His和Met外，Glu與其他13種氨基酸都呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系，其中與Asp的相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為0.864；與Tyr的相關(guān)性最?。?.351）。Phe與Ser（0.781）、Thr、Gly呈極顯著正相關(guān)，與His（-0.869）、Tyr等10種氨基酸呈極顯著負相關(guān)，而與Glu、Asp、Lys不相關(guān)。Lys除了與Phe、Tyr、Val不相關(guān)外，與其余的13種氨基酸均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，其中與Asp的相關(guān) 系 數(shù) 最大（0.967）。Leu和Ile與Met（0.922和0.844）、Cys（0.820和0.943）等12種氨基酸呈極顯著正相關(guān)，僅與Phe（-0.688和-0.451）呈 顯 著 負 相 關(guān)，與Thr、Ser、Gly不 顯 著 相 關(guān)?？傊?，小米中的17種氨基酸之間具有一定的相關(guān)性，大部分氨基酸之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，Phe、Ser、Thr與其他大量氨基酸存在顯著負相關(guān)，暗示了不同氨基酸在積累過程中存在一定的協(xié)同或抑制關(guān)系，篩選氨基酸含量高的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)較為復(fù)雜。

圖4 不同氨基酸之間的相關(guān)性分析Fig.4 Relationship analysis among different amino acids

2.4 小米17種氨基酸組分的主成分分析與綜合主成分評價

為了篩選核心種質(zhì)中的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)，本研究基于小米中不同氨基酸含量之間的相關(guān)性結(jié)果，進一步對2019—2020年的小米各氨基酸含量進行主成分分析，通過綜合主成分值評價核心種質(zhì)在氨基酸方面表現(xiàn)出的優(yōu)質(zhì)特性。結(jié)果顯示，2019年第1、2主成分和2020年第1、2、3主成分的累積貢獻率分別為87.215%和89.177%（表2），主成分組成的單元包含了17種氨基酸。此外，對其進行成分矩陣載荷分析發(fā)現(xiàn)（圖5），Leu、Cys、Arg、Tyr、Met、His、Ile、Val在2019、2020年 的 主 成 分1中 載 荷 分 別 大于0.2和0.1，而Thr、Ser、Gly、Lys、Asp、Phe、Glu在主成分2中載荷大于0.28，其中Thr最大（0.43）。Met、Ile和Phe在2020年 的 主 成分3中有很高的載荷。因此，通過主成分的劃分可以將小米17種氨基酸含量轉(zhuǎn)化為3個獨立的主成分指標，從而降低小米氨基酸分析的難度，會更加直觀地展示氨基酸在種質(zhì)之間的差異關(guān)系。

圖5 2019、2020年不同氨基酸主成分矩陣的載荷雷達Fig.5 Load radar diagram for the principal component matrix of different amino acids in 2019 and 2020

表2 谷子種質(zhì)17種氨基酸含量的主成分分析Tab.2 Principal component analysis of contents of 17 amino acids in foxtail millet germplasms

對小米17種氨基酸含量進行標準化處理，以2 a各主成分所對應(yīng)的特征值占所提取主成分總的特征值之和的比例作為權(quán)重，得到主成分綜合模型，2019年綜合主成分值Y=0.635×（0.20XGlu+0.31XArg+0.22XPro+0.22XAsp－0.01XThr+0.28XMet+0.19XLys+0.28XHis+0.31XAla－0.2XPhe+0.3XTyr－0.03XSer+0.06XGly+0.31XCys+0.25XVal+0.28XIle+0.32XLeu）+0.365×（0.28XGlu+0.05XArg－0.01XPro+0.31XAsp+0.43XThr－0.13XMet+0.32XLys－0.13XHis+0.13XAla+0.3XPhe－0.14XTyr+0.42XSer+0.42XGly－0.09XCys－0.09XVal－0.02XIle－0.03XLeu）。通過 上 述公式計算出每個谷子種質(zhì)在2020年的綜合主成分值，結(jié)果表明，Asp、Ala、Lys、Glu、Arg氨基酸對主成分綜合值的作用最大（>0.2）。結(jié)合并比較2 a的綜合主成分值，發(fā)現(xiàn)甘肅的隴谷10號、隴粟2號、隴谷5號，河北的毛毛谷、冀谷17，黑龍江的嫩選十四號、嫩選十一號，遼寧的大毛毛谷，內(nèi)蒙古的白油沙、紅苗齊頭紅，山西的白毛粱谷、貓?zhí)愎?、大同黃以及新疆的二白谷等品種的綜合主成分值均排前10%。

2.5 基于小米氨基酸組成的聚類分析

為了更全面并多角度評價核心種質(zhì)和篩選出優(yōu)異氨基酸種質(zhì)的谷子資源，對154份2 a的小米氨基酸含量進行聚類分析（圖6）。結(jié)果顯示，可將154份谷子核心種質(zhì)分為4個類群。其中，GroupⅠ以品種B029（山西白毛粱谷）、B077（新疆二白谷）、B110（甘肅隴谷5號）、B139（黑龍江嫩選十一號）和B112（甘肅隴粟2號）為代表，其平均總氨基酸含量最高，達15.37%，Lys平均含量最高，為0.27%，且除Phe、Met、Thr外，其余14種氨基酸含量都要顯著高于其他三大類群，其中Glu平均含量高1.18%，Lys平均含量高0.04%。而GroupⅡ以B032（甘肅茄谷）、B023（山東陰天旱）、B108（甘肅隴谷3號）為代表，其Glu、Arg、Asp、Ala、Gly、Phe、Tyr平均含量與GroupⅢ和GroupⅣ氨基酸含量相比，分別提高了33.7%和67.5%。GroupⅢ以B005（遼寧黑黏谷）為代表，各氨基酸平均含量較GroupⅠ和GroupⅡ降低了59.8%，但較GroupⅣ提高34.6%。GroupⅣ以B089（河北冀谷15）、B021（山東黃黏谷）、B144（山西晉谷23號）等品種為代表，所有氨基酸含量普遍偏低。基于此，不同谷子核心種質(zhì)的氨基酸含量存在較大差異，通過聚類分析將供試154份谷子種質(zhì)劃分為4個類群，其中GroupⅠ中具有高氨基酸且賴氨酸含量較高的種質(zhì)，如甘肅隴谷10號和山西向陽谷。

圖6 2019（A）、2020年（B）154份谷子種質(zhì)聚類及各類群氨基酸占比Fig.6 Dendrograms and proportion of amino acids of different groups in 154 foxtail millet germplasms in 2019（A）and 2020（B）

3 結(jié)論與討論

谷子脫粒后即為小米，是日常生活中主要的雜糧之一，具有很高的營養(yǎng)價值，其中氨基酸含量和種類更是豐富多樣[9]。作物的種質(zhì)資源與基因型多樣性既是種質(zhì)創(chuàng)新的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是遺傳特性研究的重要基石[19]，因此，基于人們對膳食營養(yǎng)的追求和谷子優(yōu)異氨基酸種質(zhì)資源挖掘的需要，開展關(guān)于小米氨基酸組分及其積累特性的研究，篩選優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源及培育新品種就顯得尤為重要。

作物遺傳變異特性可以從多個角度進行闡釋，變異系數(shù)就是其中一個重要參數(shù)。有研究表明[20]，變異系數(shù)大于10%即可表示個體間具有較大差異。本研究所測定的不同材料小米氨基酸含量與馮耐紅等[15]基本相似，并發(fā)現(xiàn)除Asp、Thr、Ala、Ile外，其余13種氨基酸的變異系數(shù)均大于10%，表明供試小米種質(zhì)具有豐富的遺傳差異，可為谷子種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)深入研究提供理論基礎(chǔ)?；? a的小米各氨基酸含量值，方差分析發(fā)現(xiàn)，除His和Val外，其余15種氨基酸都呈極顯著差異，其中2019年黑龍江地區(qū)的總氨基酸含量最高，達13.87%，表明不同年份產(chǎn)生的生態(tài)環(huán)境差異對氨基酸的積累有較大影響。有研究表明，氣候因素、品種因素、地域因素、播種期等都會顯著影響小米氨基酸的積累[21-24]。對不同來源的小米氨基酸含量分析發(fā)現(xiàn)，黑龍江、甘肅、山西等地區(qū)的氨基酸平均總含量較高，說明這些地區(qū)環(huán)境選育的品種或品系在遺傳特性上更加有利于小米氨基酸的積累。不同夏谷和春谷亞群小米各氨基酸含量有明顯差異，本研究中春谷有13種氨基酸含量連續(xù)2 a都顯著高于夏谷，其中還包含了Lys、Ile等5種必需氨基酸，說明春谷亞群是具有優(yōu)異品質(zhì)的種質(zhì)資源。主要集中在甘肅、山西和黑龍江地區(qū)的春谷亞群也表明在一定生境下小米的氨基酸能得到更加有效的積累。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明，小米不同氨基酸間均有較高的相關(guān)性。Glu與Asp、Gly等13種氨基酸呈極顯著正相關(guān)，表明其在氨基酸代謝中可能促進其他氨基酸的積累；Phe則表現(xiàn)出與其他氨基酸間的復(fù)雜相關(guān)性，既有正相關(guān)，也有負相關(guān)，甚至無相關(guān)關(guān)系，表明Phe可能參與了各個氨基酸復(fù)雜的代謝調(diào)控；Lys和Asp間的相關(guān)性系數(shù)高達0.97，說明Lys和Asp在氨基酸代謝積累中可能存在協(xié)同作用，此結(jié)果與古世祿等[25]結(jié)果相似。

主成分分析能夠綜合不同氨基酸含量的特征，增加其在優(yōu)質(zhì)品種選育中的準確性和可靠性。胡曉航等[26]利用主成分分析對甜菜塊根氨基酸進行分析綜合評價，鑒定篩選出具有優(yōu)異營養(yǎng)品質(zhì)的甜菜品種。本研究通過主成分分析將2019、2020年的小米17種氨基酸分別轉(zhuǎn)化為2個主成分和3個主成分，并根據(jù)王倩朝等[27]主成分因子分析篩選標準和莫昭展等[28]綜合主成分值模型，得出小米氨基酸綜合主成分值，并以此篩選出隴谷10號、隴粟2號、冀谷17、嫩選十四號、白油沙、白毛粱谷、大同黃等氨基酸含量較高的谷子品種或種質(zhì)。Lys是禾谷類作物中第一限制性必需氨基酸，育種家們也是一直致力于提高禾谷類作物中Lys的水平[29]。在谷子中，任瑞玉等[30]利用多元聚優(yōu)雜交和水旱穿梭選育相結(jié)合的方法選育出高蛋白谷子品種隴谷10號。崔海英等[31]采用有性雜交方法，水旱平行與系譜法相結(jié)合連續(xù)定向選擇篩選出高賴氨酸谷子品種衡谷11號。本研究最終通過聚類分析將154份供試谷子核心種質(zhì)分為4個類群，并結(jié)合主成分分析，從GroupⅠ中篩選出隴粟2號、隴谷5號、隴谷10號、嫩選十一號、大同黃、白毛粱谷、二白谷等高氨基酸品種和隴谷10號、向陽谷等高賴氨酸品種，為谷子優(yōu)質(zhì)氨基酸種質(zhì)篩選和新品種培育提供參考。

小米不同種質(zhì)間17種氨基酸積累特性存在較大的差異，不同生態(tài)環(huán)境差異對Glu、Arg等15種氨基酸的積累有較大影響，且春谷小米氨基酸含量顯著高于夏谷。各氨基酸之間的積累相互影響，其中Glu僅可正向促進其他氨基酸的積累，而Phe則表現(xiàn)出正負調(diào)控，Lys和Asp的積累存在協(xié)同作用。結(jié)合主成分和聚類分析結(jié)果，篩選出了山西白毛粱谷、新疆二白谷等6個高氨基酸品種和高賴氨酸品種。本研究的小米氨基酸組分積累特性分析與評價，可為谷子優(yōu)質(zhì)品種的鑒定、篩選以及品質(zhì)改良提供理論參考。