劉韶華，劉慧芳，李六林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030801）

梨樹是世界范圍內(nèi)重要的果樹之一，具有很高的經(jīng)濟價值[1]。由納雪黑星菌（Venturia nashicolaTanak et Yamamota）引起梨黑星?。≒ear Scab）是目前我國梨產(chǎn)區(qū)的主要病害之一[2]。梨黑星病主要危害葉片和果實，會造成葉片黃化和果實畸形，嚴重影響梨的產(chǎn)量與品質(zhì)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，黑星菌能夠引起梨胞內(nèi)Ca2+水平的上升，同時誘導(dǎo)鈣感受器相關(guān)基因上調(diào)表達[4]。Ca2+作為第二信使，在植物信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，它與鈣傳感蛋白結(jié)合，將鈣信號級聯(lián)放大并向下游傳遞，進而調(diào)控植物的生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答[5]。目前，植物中主要存在三大類鈣傳感器，包括鈣調(diào)素和類鈣調(diào)素蛋白（Calmodulin and Calmodulin-like protein，CaM and CaML）、鈣依賴蛋白激酶（Calcium-Dependent Protein Kinase，CDPK）和類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白（Calcineurin B-like protein，CBL）[6-8]。與其他鈣傳感器相比，CDPK是植物與部分原生生物特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可不依賴鈣調(diào)素蛋白而直接與鈣離子結(jié)合，并將鈣信號轉(zhuǎn)化為磷酸化信號，從而進一步啟動下游信號傳導(dǎo)過程[9]。

CDPK普遍存在于植物和部分原生生物中，并且在植物生長的諸多方面起關(guān)鍵作用，如植物的生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和對逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[10-12]。典型的CDPK具有4個保守的蛋白結(jié)構(gòu)，分別為N端可變域、激酶域、自抑制域和類鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域[13]。激酶域含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶序列，同源性較高，類鈣調(diào)素結(jié)合域通常含有4個可直接與Ca2+結(jié)合的EF手型結(jié)構(gòu)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，外界環(huán)境刺激會造成胞質(zhì)Ca2+濃度發(fā)生變化，瞬時激活CDPK活性，使底物蛋白磷酸化，CDPK與促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）協(xié)同調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子并激活防衛(wèi)基因的表達，從而使植物產(chǎn)生特異性抗逆響應(yīng)[15]。目前，研究人員已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana tabacum）和毛白楊（Populus tomentosa）等植物中克隆得到多個CDPK基因，并對部分成員進行表達分析[16-18]。然而，有關(guān)梨CDPK基因的研究鮮見報道。LIU等[4]研究發(fā)現(xiàn)，黑星菌侵染會誘導(dǎo)抗病品種黃冠梨PbCDPK29基因上調(diào)表達，而在感病品種雪花中受病原菌誘導(dǎo)下調(diào)表達，推測其可能在梨抗黑星病中發(fā)揮作用，所以對PbCDPK29進行克隆和生物信息學(xué)分析，為進一步闡明該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

本研究通過克隆梨PbCDPK29基因，并對其蛋白特性、系統(tǒng)進化關(guān)系和啟動子區(qū)域的順式作用元件進行分析，旨在為進一步研究PbCDPK29基因的生物學(xué)功能和抗逆分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以雪花梨（Pyrus bretschneideriRehd.‘Xuehua’）品種為試驗材料，雪花梨自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗基地采樣，選取植物葉片進行試驗，液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

大腸桿菌菌株DH5α購于上海生工生物公司；從TaKaRa生物公司購買反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD19-T克隆載體；從杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司購買DNA膠回收試劑盒；試驗中其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 梨葉片總RNA提取及cDNA合成參考關(guān)玲等[19]從果樹中提取RNA的方法，通過改良CTAB法提取梨葉片總RNA，經(jīng)質(zhì)量檢測合格后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。

1.2.2PbCDPK29基因的克隆根據(jù)梨基因組數(shù)據(jù)庫（http://gigadb.org/search/new?keyword=Py‐rus）下載PbCDPK29基因（Pbr017041.1）序列，利用Primer Premier 5.0軟件對其保守序列設(shè)計引物（表1）。以反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板，利用高保真酶Phanta進行PbCDPK29基因全長編碼區(qū)擴增，反應(yīng)體系如下：cDNA模板2μL，2×Phanta Master Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，ddH2O 6.4μL。電泳檢測擴增產(chǎn)物后，通過DNA膠回收試劑盒將該目的片段回收，并將其與pMD19-T載體（Ta‐KaRa）連接，隨后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取白色菌落陽性產(chǎn)物送到上海生工生物公司進行測序。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of the primers

1.2.3PbCDPK29基因生物信息學(xué)分析利用ProtParam程序預(yù)測蛋白質(zhì)各項理化性質(zhì)；采用GPS-Lipid預(yù)測蛋白序列的N末端棕櫚?；投罐Ⅴ；稽c；亞細胞定位分析通過PSORT程序進行；運用SignalP 5.0程序進行蛋白質(zhì)信號肽分析；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)通過SOPMA在線工具分析；蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)通過Phyre 2進行分析[20]；采用MEGA 7.0軟件，選擇鄰接法（neighbour-joining，NJ）構(gòu)建梨與其他物種CDPK的進化樹；利用DNAMAN 8.0軟件將PbCDPK29與其他物種的CDPK蛋白序列進行多序列對比；運用PlantCARE分析啟動子序列的順式作用元件。

1.2.4PbCDPK29基因的表達分析在樹體健壯的雪花梨樹上選取健康、無病斑的新梢葉片，用濃度為0.1 mmol/L的MeJA溶液進行葉面噴施處理，噴至葉面充分濕潤為宜，對照為無菌水處理。每個處理重復(fù)3次，分別在處理后0、24、48、72、96、120 h取樣，采用改良CTAB法提取葉片總RNA，以反轉(zhuǎn)錄后合成的cDNA為模板，采用試劑盒SYBR Pre‐mix Ex TaqⅡkit（Vazyme）進 行 實 時 熒 光 定 量PCR。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，Actin引物的設(shè)計參考LIU等[4]的報道，熒光定量引物序列如表1所示。

對熒光值變化曲線和熔解曲線進行分析后，通過2-??Ct方法計算PbCDPK29在不同處理時間的相對表達量[21]，并采用SPSS 26.0軟件進行差異顯著性分析（P<0.05），最后利用Excel 2016作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PbCDPK29基因的克隆

以雪花梨葉片cDNA為模板，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果顯示，PbCDPK29的擴增產(chǎn)物條帶在1 500 bp左右（圖1）?；厥占兓康臈l帶后，將其連接到克隆載體上，挑選單克隆進行菌落PCR，選擇陽性菌測序，結(jié)果顯示，PbCDPK29基因CDS序列全長為1 554 bp，編碼517個氨基酸（圖2），比對結(jié)果顯示，其與梨基因組PbCDPK29（Pbr017041.1）參考蛋白序列相似度為99.81%。

圖1 PbCDPK29基因PCR擴 增Fig.1 PCR amplification of PbCDPK29 gene

圖2 PbCDPK29基因的核苷酸和氨基酸序列Fig.2 PbCDPK29 gene nucleotide and amino acid sequence

2.2 PbCDPK29基因生物信息學(xué)分析

2.2.1PbCDPK29基因序列分析利用Prot‐Param軟件預(yù)測分析結(jié)果顯示，PbCDPK29基因開放閱讀框為1 554 bp，編碼517個氨基酸，分子質(zhì)量為58.26 ku，理 論 等 電 點（pI）為6.03，分 子 式 為C2584H4102N714O774S22，總原子數(shù)為8 196。不穩(wěn)定系數(shù)為31.95（參數(shù)小于40是穩(wěn)定蛋白），被歸類為穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為85.20，總平均親水系數(shù)為-0.430，預(yù)測該蛋白為親水性蛋白。PbCDPK29蛋白由20種氨基酸組成，其中，賴氨酸（Lys，8.7%）、亮氨酸（Leu，8.5%）、谷氨酸（Glu，8.3%）、纈氨酸（Val，7.7%）、甘氨酸（Gly，7.5%）和天冬氨酸（Asp，7.2%）這6種氨基酸所占比例達到47.9%，而色氨酸（Trp）僅占1.0%。GPS-Lipid在線軟件預(yù)測顯示，PbCDPK29蛋白在N端包含棕櫚酰化和豆蔻?；稽c。PSORT亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，PbCDPK29蛋白主要定位在質(zhì)膜上，可信度為85%。信號肽預(yù)測結(jié)果表明（圖3），信號肽預(yù)測值為0.001 3，其他預(yù)測值為0.998 7，PbCDPK29蛋白不存在信號肽，初步斷定其不是分泌型蛋白。

圖3 PbCDPK29蛋白的信號肽預(yù)測分析Fig.3 The signal peptide prediction analysis of PbCDPK29 protein

2.2.2 PbCDPK29蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析PbCDPK29蛋白的二級結(jié)構(gòu)通過SOPMA在線工具進行預(yù)測，結(jié)果顯示（圖4），該蛋白以α-螺旋（Al‐pha helix）和無規(guī)則卷曲（Random coil）結(jié)構(gòu)為主，分別占46.23%、35.20%，延伸鏈（Extended strand）和β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）結(jié)構(gòu)分別占9.67%和8.90%。利用Phyre 2.0在線軟件對PbCDPK29蛋白進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示（圖5），PbCDPK29蛋白序列中435個氨基酸（序列總長度的84%）與已知3D結(jié)構(gòu)的惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）鈣依賴蛋白激酶CDPK2匹配度最高，可信度為100%。

圖4 PbCDPK29蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of PbCDPK29 protein

圖5 PbCDPK29蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of PbCDPK29 protein

2.2.3 PbCDPK29蛋白的系統(tǒng)進化樹分析在NCBI網(wǎng)站中對PbCDPK29蛋白序列進行同源性BLAST比對，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示（圖6），PbCDPK29與其他物種的CDPK具有較高的相似性，與薔薇科植物蘋果（Ma?lus domestica，XP_008392224.1）、甜 櫻 桃（Prunus avium，XP_021800127.1）、梅花（Prunus mume，XP_016651831.1）、桃（Prunus persica，XP_007204103.1）和扁桃（Prunus dulcis，XP_034223379.1）的相似度較高，分別為97%、88%、88%、88%和87%，親緣關(guān)系較近，說明PbCDPK29具有較高的保守性。

圖6 PbCDPK29與其他物種CDPK家族蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of PbCDPK29 and CDPK family proteins of other species

2.2.4 PbCDPK29同源蛋白的多序列比對分析利用DNAMAN 8.0軟 件 將 蘋 果MdCDPK32（XP_008392224.1）、甜櫻桃PaCDPK8（XP_021800127.1）、梅 花PmCDPK8（XP_016651831.1）、桃PpCDPK8（XP_007204103.1）和扁桃PdCDPK8（XP_0342233 79.1）與PbCDPK29蛋白進行多序列比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖7），PbCDPK29蛋白與上述CDPK蛋白序列都具有CDPK家族的典型結(jié)構(gòu)域，從N端到C端依次為可變結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域、自抑制結(jié)構(gòu)域和包含能促進Ca2+結(jié)合的EF手型結(jié)構(gòu)的類鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域。通過箭頭和橫線標示出這4個結(jié)構(gòu)域，其中可變結(jié)構(gòu)域的起始序列為MGNCCVT，包含棕櫚?；投罐Ⅴ；稽c[22]，該區(qū)域由20～140個氨基酸組成，同源性極低且保守性較差；激酶結(jié)構(gòu)域也稱催化域，由約300個氨基酸組成，包含起催化作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶序列，同源性較高且相對保守；自抑制結(jié)構(gòu)域也稱連接域，由30個左右的氨基酸組成，起到連接激酶結(jié)構(gòu)域與類鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域的作用，該區(qū)域保守性最高；類鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域又稱調(diào)控域，保守性很低，該區(qū)域包含4個可直接與Ca2+結(jié)合的EF手型結(jié)構(gòu)，這是CDPK不依賴鈣調(diào)素而直接與Ca2+結(jié)合的原因。結(jié)果表明，PbCDPK29具有CDPK家族蛋白典型的4個結(jié)構(gòu)域，確定所克隆的PbCDPK29結(jié)構(gòu)完整。

圖7 PbCDPK29與其他物種CDPK蛋白的多序列比對Fig.7 Multiple sequence alignment of PbCDPK29 and CDPK proteins of other species

2.2.5PbCDPK29基因啟動子元件預(yù)測分析利用PlantCARE分析PbCDPK29基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 500 bp序列的順式作用元件，結(jié)果顯示（表2），PbCDPK29基因啟動子區(qū)域含有CAAT-box和TATA-box基本啟動子元件，還存在厭氧誘導(dǎo)所需元件ARE，光誘導(dǎo)響應(yīng)元件GT1-motif，干旱脅迫響應(yīng)元件MBS，生長素響應(yīng)元件TGAelement，與胚乳表達有關(guān)的GCN4_motif元件，與分生組織表達有關(guān)的CAT-box元件，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG-motif和CGTCA-motif。

表2 PbCDPK29基因啟動子順式作用元件分析Tab.2 Analysis of cis-acting elements in the promoter regions of PbCDPK29 gene

2.3 外源MeJA處理對PbCDPK29基因表達的影響

通過qRT-PCR檢測外源MeJA處理下雪花梨葉片PbCDPK29基因的表達量，結(jié)果表明（圖8），與對照相比，PbCDPK29被誘導(dǎo)上調(diào)表達，且呈現(xiàn)先升后降的表達模式，在處理72 h時達到表達峰值，其相對表達量約為對照的2.35倍。PbCDPK29基因的表達受MeJA的誘導(dǎo)，因此，推測PbCDPK29基因可能參與茉莉酸信號途徑。以上結(jié)果也表明，對PbCDPK29啟動子區(qū)域順式作用元件預(yù)測的結(jié)果準確性較高。

圖8 外源MeJA處理后PbCDPK29相對表達量分析Fig.8 Relative expression analysis of PbCDPK29 gene af?ter exogenous MeJA treatment

3 結(jié)論與討論

CDPKs普遍存在于各種植物中，并參與植物生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)[23]。目前，已從水稻、油菜和二穗短柄草等植物中克隆獲得CDPK基因[24-26]，這些研究在草本植物中比較常見，關(guān)于木本植物CDPK的研究報道較少，多集中于楊樹[27]和蘋果[28]。本研究從雪花梨葉片中克隆得到PbCDPK29基因，對其進行進化樹和多序列比對分析，結(jié)果顯示，PbCDPK29蛋白與其他薔薇科植物的CDPK蛋白序列具有較高的相似性，其中與蘋果MdCDPK32蛋白的親緣關(guān)系最近，說明該基因在進化過程中較為保守；另外，PbCDPK29與已知的CDPK蛋白都存在N端可變域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶域、自抑制域和包含EF手型結(jié)構(gòu)的類鈣調(diào)素域，符合CDPK家族典型的結(jié)構(gòu)特征[13]，說明克隆的PbCDPK29屬于鈣依賴蛋白激酶家族基因。多數(shù)CDPKs的N端可變域包含棕櫚?；投罐Ⅴ；稽c，它們可能與膜定位有關(guān)[29]。ZHAO等[30]研究發(fā)現(xiàn)，同時含有棕櫚?；投罐Ⅴ；稽c的蒺藜苜蓿MtCDPKs定位在質(zhì)膜上。本研究中，PbCDPK29蛋白包含棕櫚?；投罐Ⅴ；稽c，并且亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白主要定位于質(zhì)膜上，暗示N末端?；稽c可能在PbCDPK蛋白的亞細胞定位中起關(guān)鍵作用。

基因啟動子區(qū)域包含的順式作用元件對下游基因表達具有重要影響，并且根據(jù)順式作用元件可以初步判斷該基因家族成員的基本功能[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，PbCDPK29基因的啟動子序列中包含茉莉酸響應(yīng)元件，并且MeJA處理后，該基因的表達量顯著上調(diào)，說明PbCDPK29可能參與茉莉酸信號途徑，但其具體的參與過程還有待進一步研究。另外，PbCDPK29啟動子區(qū)域存在調(diào)節(jié)胚乳和分生組織發(fā)育的相關(guān)元件，推測PbCDPK29可能參與調(diào)控植物胚乳和分生組織的發(fā)育，且調(diào)控機制可能與水稻種子中特異表達的一種CDPK類似[32]；還存在干旱脅迫響應(yīng)元件，表明PbCDPK29可能受到干旱脅迫的誘導(dǎo)。

本研究從雪花梨葉片中克隆出長度為1 554 bp的PbCDPK29基因，編碼517個氨基酸，與同科植物蘋果的相似度最高，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有CDPK家 族典型的4個保守結(jié) 構(gòu) 域，PbCDPK29基因啟動子區(qū)域含有MeJA響應(yīng)元件；qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，PbCDPK29基因受MeJA誘導(dǎo)上調(diào)表達。本研究首次從梨中克隆得到PbCDPK29基因，并推測外源MeJA可能通過誘導(dǎo)PbCDPK29表達，從而緩解黑星病菌對梨的侵染，但該基因?qū)婧谛遣【秩镜木唧w響應(yīng)機制還需要進一步研究。