郭奕陽(yáng)，馬偉麗，曹詩(shī)茹，郭秀娟，鄧艷麗，張金艷*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050011；2.河北省胸科醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所，河北 石家莊 050011)

全球范圍內(nèi)，乳腺癌的醫(yī)療負(fù)擔(dān)都在增加，位居中國(guó)女性癌癥發(fā)病率第一位[1]。依靠敏感度高、特異度強(qiáng)的生物標(biāo)志物可以提高早期診斷率，同時(shí)實(shí)施安全有效的精準(zhǔn)治療可以提高存活率[2-3]。但是，現(xiàn)階段仍然缺乏乳腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物[4]。外泌體是一種廣泛存在于體液，如血漿、尿液、唾液中的分泌小囊泡[5]。乳腺癌細(xì)胞分泌的外泌體在細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[6]。通過(guò)分析乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和非癌性乳腺細(xì)胞系MCF-10A的外泌體蛋白質(zhì)組差別，發(fā)現(xiàn)血清外泌體膜蛋白Glypican-1有作為乳腺癌早期診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值[7]。本實(shí)驗(yàn)采用臨床樣本對(duì)血清外泌體膜蛋白Glypican-1進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)與研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年4—7月因新發(fā)乳腺腫塊于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院就診的患者66例，均由病理組織學(xué)檢查確診，其中乳腺良性占位18例，乳腺癌48例，所有患者之前均未經(jīng)任何治療。另收集與其相匹配的同時(shí)期于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院體檢的健康查體者17名，為健康對(duì)照組。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2血清外泌體提取及鑒定

1.2.1制備血清 所有研究對(duì)象均于空腹?fàn)顟B(tài)下采集4 mL外周靜脈血，待自然凝固后，離心取血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血清外泌體提取及鑒定 采用聚乙二醇沉淀法提取血清外泌體，取0.5 mL待檢血清，加入120 μLPEG 8 000工作液，充分混勻，4 ℃靜置30 min，1 500 g離心30 min，棄上清，再次1 500 g 離心5 min，吸出殘液，所得沉淀即所需外泌體，經(jīng)透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)和Western blot檢測(cè)外泌體表面蛋白標(biāo)記物CD9后，-80 ℃凍存。

1.3血清外泌體GPC-1的檢測(cè) 采用Western blot檢測(cè)乳腺癌組、乳腺良性占位組和健康對(duì)照組血清外泌體GPC-1的表達(dá)水平，及乳腺癌組治療前后血清外泌體GPC-1表達(dá)水平。

1.4臨床數(shù)據(jù)整理 收集乳腺良性占位組和乳腺癌組血清腫瘤標(biāo)志物、乳腺超聲、鉬靶和病理組化結(jié)果，并進(jìn)行整理總結(jié)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布計(jì)量資料采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線評(píng)價(jià)血清外泌體GPC-1對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值。以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算血清外泌體GPC-1、血清腫瘤標(biāo)志物、超聲、鉬靶射線四種診斷方法的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，采用Kappa一致性檢驗(yàn)評(píng)價(jià)四種診斷方法對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1血清外泌體形態(tài)及分子鑒定 使用PEG8000 沉淀法提取血清外泌體，透射電鏡下觀察外泌體呈杯托樣，直徑約為100 nm(圖1)。Western blot檢測(cè)血清外泌體標(biāo)記蛋白，可見CD9的表達(dá)條帶(圖2)。結(jié)果證明所提取的沉淀物為外泌體。

圖1 血清外泌體形態(tài)

圖2 血清外泌體CD9表達(dá)

2.2三組標(biāo)本間血清外泌體GPC-1的表達(dá)水平差異 Western blot檢測(cè)乳腺癌組、乳腺良性占位組和健康對(duì)照組血清外泌體GPC-1表達(dá)水平，55kDa左右可見明顯條帶(圖3)，對(duì)蛋白條帶灰度分析后可得，三組間血清外泌體GPC-1表達(dá)水平不全相同，乳腺癌組血清外泌體GPC-1表達(dá)水平[1.065(0.501)]高于乳腺良性占位組[0.652(0.711)]和健康對(duì)照組[0.625(0.117)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=32.051，P<0.05)。

圖3 血清外泌體GPC-1表達(dá)

2.3血清外泌體GPC-1對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值 以病理檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，利用ROC曲線評(píng)估血清外泌體GPC-1檢測(cè)結(jié)果對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，ROC曲線下面積(AUC)為0.900(95%CI:0.833～0.967)，最佳截?cái)嘀禐?.961，即血清外泌體GPC-1值≥0.961時(shí)診斷為乳腺癌，此時(shí)診斷的敏感度為72.9%，特異度為97.1%(圖4)。

圖4 血清外泌體GPC-1診斷乳腺癌的ROC曲線

2.4乳腺癌組血清外泌體GPC-1在不同臨床及病理特征組的比較 根據(jù)乳腺癌組血清外泌體GPC-1表達(dá)水平，以最佳截?cái)嘀禐?.961為界，將48例乳腺癌患者分為GPC-1陽(yáng)性組和GPC-1陰性組，分析其表達(dá)水平和患者臨床特征的關(guān)系。結(jié)果顯示GPC-1陽(yáng)性在不同TNM分期組、淋巴結(jié)浸潤(rùn)組和Ki-67高表達(dá)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),在不同患者年齡、月經(jīng)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和HER-2表達(dá)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),見表1。

表1 血清外泌體GPC-1表達(dá)水平在不同臨床及病理特征的組間的比較Table 1 Comparison of expression level of serum exosomal GPC-1 in different clinical pathological characters groups (例數(shù)，%)

2.5乳腺癌組治療前后血清外泌體GPC-1的表達(dá)水平差異 Western blot檢測(cè)乳腺癌組治療20 d前后的GPC-1表達(dá)水平，經(jīng)蛋白條帶灰度分析后可得，治療前血清外泌體GPC-1表達(dá)水平[1.065(0.501)]高于治療后血清外泌體GPC-1表達(dá)水平[0.844(0.195)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=856.000，P=0.006)。

2.6血清外泌體GPC-1、血清腫瘤標(biāo)志物、乳腺超聲、鉬靶四種檢測(cè)方法對(duì)乳腺癌診斷價(jià)值的分析 以病理檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分別用血清外泌體GPC-1、血清腫瘤標(biāo)志物、乳腺超聲、鉬靶診斷乳腺良性占位組和乳腺癌組共66例患者，四種檢測(cè)方法的診斷結(jié)果見，見表2。并分別對(duì)四種檢測(cè)方法與金標(biāo)準(zhǔn)病理檢查結(jié)果做Kappa一致性檢驗(yàn)，血清外泌體GPC-1檢測(cè)方法的Kappa值為0.485>0.4，與病理檢查比較一致性中等，且優(yōu)于其他3種檢測(cè)方法，見表3。

表2 乳腺癌四種檢測(cè)方法的診斷結(jié)果Table 2 The results of four detection methods in the diagnosis of breast cancer (例數(shù))

表3 乳腺癌四種檢測(cè)方法的一致性檢驗(yàn)Table 3 Consistency test of the four detection methods for breast cancer

3 討 論

Glypicans是硫酸類肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)家族一員，通過(guò)C末端的糖基磷脂酰肌醇連接到細(xì)胞膜外膜[8],GPCs家族通常分為六種(GPC-1～GPC-6)[9]。GPC-1在胰腺癌[10]，膠質(zhì)瘤[11]，食管癌[12]等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)[12-13]。外泌體由體內(nèi)多種細(xì)胞分泌而來(lái)，可進(jìn)入外周血循環(huán)[14]。外泌體檢測(cè)具備標(biāo)本易采集、穩(wěn)定，能夠?qū)崟r(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)和反映分泌細(xì)胞生物學(xué)特性等優(yōu)勢(shì)[15]。有研究通過(guò)免疫組化法對(duì)220例乳腺癌患者GPC-1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中GPC-1高表達(dá)與正常組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在乳腺癌晚期和大直徑腫瘤的患者中，GPC-1表達(dá)顯著升高[16]。本研究通過(guò)檢測(cè)乳腺癌組、乳腺良性占位組和健康對(duì)照組血清外泌體GPC-1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組血清外泌體GPC-1水平高于乳腺良性占位組和健康對(duì)照組，與以往檢測(cè)乳腺組織的實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致，證明血清外泌體中的GPC-1可以準(zhǔn)確的反應(yīng)乳腺組織細(xì)胞的變化，篩查乳腺癌患者，具有乳腺癌早期診斷的潛力的。Matsuda等[17]研究發(fā)現(xiàn)GPC-1的表達(dá)可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞系對(duì)不同肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子促有絲分裂和細(xì)胞增殖的反應(yīng)，表明GPC-1的上調(diào)在乳腺癌進(jìn)展中發(fā)揮作用。此外,MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系GPC-1基因的表達(dá)使其更具有轉(zhuǎn)移潛力[18]。本研究通過(guò)分析乳腺癌組48例患者血清外泌體GPC-1表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GPC-1陽(yáng)性與TNM分期、淋巴結(jié)浸潤(rùn)和Ki-67高表達(dá)顯著相關(guān)，且GPC-1表達(dá)水平越高，腫瘤TNM分期越晚，呈正相關(guān)性。同時(shí)，我們對(duì)乳腺癌組治療20 d前后的血清外泌體GPC-1表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)治療后血清外泌體GPC-1表達(dá)水平下降且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清外泌體GPC-1高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，且對(duì)治療反應(yīng)敏感，可對(duì)乳腺癌的臨床診斷和預(yù)后評(píng)估提供參考。

本研究以病理檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建了血清外泌體GPC-1診斷乳腺癌的ROC曲線，ROC曲線下面積為0.900，提示其可以作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物。血清外泌體GPC-1、血清腫瘤標(biāo)志物、乳腺B超、鉬靶四種乳腺癌檢測(cè)方法一致性檢驗(yàn)顯示血清外泌體CPC-1檢測(cè)結(jié)果與病理檢查結(jié)果一致性最高，敏感度高于血清腫瘤標(biāo)志物，特異度高于乳腺B超和鉬靶，提示乳腺癌早期篩查可以將血清腫瘤標(biāo)志物和血清外泌體GPC-1聯(lián)合應(yīng)用，提高檢出率。影像學(xué)方法不易發(fā)現(xiàn)腫瘤患者早期病變且儀器場(chǎng)地限制不適合早期大規(guī)模篩查，而血清外泌體GPC-1檢測(cè)彌補(bǔ)了該方法的不足。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體GPC-1對(duì)乳腺癌的診斷有一定輔助價(jià)值，同時(shí)本研究也存在不足之處，標(biāo)本量較少，下一步我們將深入研究外泌體來(lái)源的GPC-1在乳腺癌的作用機(jī)制，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，進(jìn)一步分析其在預(yù)后中的價(jià)值。