王 佳，高恒波，林雪容，羅肖宇，陳麗君，韓樹(shù)池

(1. 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院急診科，河北 張家口075000；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院急診科，河北 石家莊050000)

急性生理和慢性健康評(píng)分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)是評(píng)價(jià)膿毒癥預(yù)后的常用指標(biāo)[1-3]。新近的研究認(rèn)為免疫功能抑制、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡等環(huán)節(jié)與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。淋巴細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道，激活自噬能夠促進(jìn)膿毒癥小鼠體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞的存活[7]；另有臨床研究證實(shí)，膿毒癥患者外周血淋巴細(xì)胞中自噬基因Beclin-1的表達(dá)明顯減少且與病情加重、預(yù)后惡化有關(guān)[8-9]，提示淋巴細(xì)胞自噬減弱是影響膿毒癥預(yù)后的可能因素。本研究旨在探索Beclin-1聯(lián)合APACHEⅡ評(píng)分預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的價(jià)值。旨在為臨床評(píng)價(jià)膿毒癥的病情及預(yù)后提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月—2019年10月期間河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的膿毒癥患者238例作為膿毒癥組，入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》[10]中膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②入院后即刻留取外周靜脈血標(biāo)本；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、免疫功能缺陷疾??；②入院前正在使用免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素治療；③妊娠及哺乳。另取同期體檢健康者104例作為對(duì)照組。膿毒癥組中男性131例、女性107例，年齡45～72歲、平均(56.38±8.85)歲；對(duì)照組中男性59例、女性45例，年齡40～68歲、平均(55.29±8.45)歲。2組一般資料比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分離液、RIPA裂解液、BCA試劑盒均為上海碧云天公司，Beclin-1一抗為美國(guó)Abcam公司，β-actin一抗為美國(guó)Sigma公司，電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)為上海天能公司。

1.3方法

1.3.1外周血Beclin-1表達(dá)的檢測(cè) 取膿毒癥組和對(duì)照組的外周靜脈血5 mL，采用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，而后加入RIPA裂解液裂解淋巴細(xì)胞、提取蛋白，采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量，將含有30 μg蛋白的樣本用于Western blot實(shí)驗(yàn)。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜1 h，1∶1 000稀釋的Beclin-1一抗或1∶2 500稀釋的β-actin一抗4℃孵育PVDF膜過(guò)夜，洗膜3次后室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值、以β-actin為內(nèi)參計(jì)算Beclin-1的表達(dá)水平。

1.3.2收集臨床資料 查閱膿毒癥患者的病歷，收集以下臨床資料：性別，年齡，既往病史(高血壓、糖尿病)，生命體征(體溫、收縮壓、舒張壓)，入科24 h的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)[白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell，WBC)、血紅蛋白(hemoglobin，Hb)、血小板計(jì)數(shù)(platelet count，PLT)、白蛋白(albumin，ALB)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酐(creatinine，Cr)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)，根據(jù)入院后24 h內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)的最差值計(jì)算APACHEⅡ]。

1.3.3預(yù)后情況判斷 查閱膿毒癥患者的病歷，根據(jù)入科后28 d的病情判斷預(yù)后，包括存活和死亡，自動(dòng)出院或臨終前放棄的患者均視作死亡。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；預(yù)后的比較采用Kaplan-Meier曲線分析及ROC曲線分析，預(yù)后的影響因素采用COX模型分析，聯(lián)合指標(biāo)的生成采用Logistic回歸模型分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1膿毒癥組與對(duì)照組外周血Beclin-1表達(dá)的比較 與對(duì)照組比較，膿毒癥患者外周血中Beclin-1的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

圖1 膿毒癥組與對(duì)照組外周血Beclin-1表達(dá)的蛋白電泳圖

表1 膿毒癥組與對(duì)照組外周血Beclin-1表達(dá)的比較Table 1 Comparison of beclin-1 expression in peripheral blood between sepsis group and control group

2.2外周血Beclin-1預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線及ROC曲線分析 按照膿毒癥組患者外周血Beclin-1表達(dá)的中位數(shù)將其分為高表達(dá)患者和低表達(dá)患者，經(jīng)Kaplan-Meier曲線分析，與Beclin-1高表達(dá)患者比較，低表達(dá)患者的28 d累積病死率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。繪制外周血Beclin-1表達(dá)預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線，曲線下面積為0.5947(95%CI：0.5210～0.6683，P=0.015)。見(jiàn)圖2。

圖2 外周血Beclin-1預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線及ROC曲線A.外周血Beclin-1預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線;B.外周血Beclin-1預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線Figure 2 Kaplan-Meier curve and ROC curve of Beclin-1 in peripheral blood in predicting 28-day mortality in patients with sepsis圖3 APACHEⅡ評(píng)分預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線及ROC曲線A.APACHEⅡ評(píng)分預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線;B.A-PACHEⅡ評(píng)分預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線

2.3APACHEⅡ評(píng)分預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線及ROC曲線分析 按照膿毒癥組患者APACHEⅡ評(píng)分分為<15分患者、15～25分患者、>25分患者，經(jīng)Kaplan-Meier曲線分析，與APACHEⅡ評(píng)分分為<15分及15～25分患者比較，APACHEⅡ評(píng)分>25分患者的28 d累積病死率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。繪制APACHEⅡ評(píng)分預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線，曲線下面積為0.5861(95%CI：0.511～0.661，P=0.027)。

2.4膿毒癥組中存活患者與病死患者臨床資料的比較 與膿毒癥中存活患者比較，病死患者的性別、年齡、高血壓、糖尿病、體溫、舒張壓、WBC、Hb、PLT、ALB、ALT、AST、CRP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， Cr、PCT、APACHEⅡ評(píng)分明顯增加，收縮壓、Beclin-1表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 膿毒癥組中存活患者與死亡患者臨床資料的比較Table 2 Comparison of clinical data between survival patients and dead patients in sepsis group

2.5膿毒癥患者28 d病死影響因素的COX回歸分析 以膿毒癥組患者預(yù)后作為應(yīng)變量(存活=0、病死=1)，以Beclin-1、APACHEⅡ、收縮壓、Cr、PCT作為連續(xù)自變量，進(jìn)行COX回歸分析可知Beclin-1、APACHEⅡ評(píng)分是膿毒癥組患者預(yù)后的影響因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 膿毒癥患者28 d病死影響因素的COX回歸分析Table 3 COX regression analysis of influencing factors of 28-day mortality of sepsis patients

2.6外周血Beclin-1與APACHEⅡ評(píng)分聯(lián)合指標(biāo)預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的Logistic回歸與ROC曲線聯(lián)合分析 在Logistic回歸模型中生成Beclin-1聯(lián)合APACHEⅡ評(píng)分預(yù)測(cè)膿毒癥組患者預(yù)后的新指標(biāo)方程為：-0.566-2.238×Beclin-1+0.065×APACHEⅡ評(píng)分。該聯(lián)合指標(biāo)預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線下面積為0.6452(95%CI：0.5694～0.7211，P<0.001)。見(jiàn)圖4。

圖4 外周血Beclin-1與APACHEⅡ評(píng)分聯(lián)合指標(biāo)預(yù)測(cè)膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線

3 討 論

膿毒癥是重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，救治難度大、預(yù)后差、病死率高，學(xué)者們不僅致力于研究膿毒癥發(fā)病的病理生理機(jī)制，同時(shí)也在探索能夠準(zhǔn)確評(píng)估病情及預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和方法。APACHEⅡ評(píng)分是目前重癥醫(yī)學(xué)科應(yīng)用最廣泛的病情評(píng)價(jià)指標(biāo)，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)APACHEⅡ評(píng)分是膿毒癥患者預(yù)后的影響因素[10]。雖然APACHEⅡ評(píng)分系統(tǒng)涵蓋了慢性病、缺氧、炎癥、休克等與膿毒癥病情相關(guān)的因素，但卻未能納入近些年發(fā)現(xiàn)與膿毒癥發(fā)病相關(guān)的自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡等環(huán)節(jié)。因此，本研究從新發(fā)現(xiàn)的膿毒癥病理生理機(jī)制切入，尋找新的標(biāo)志物與APACHEⅡ評(píng)分聯(lián)合評(píng)價(jià)膿毒癥預(yù)后，旨在為提高評(píng)估膿毒癥預(yù)后的準(zhǔn)確性提供參考。自噬是近些年受到越來(lái)越多關(guān)注的膿毒癥相關(guān)病理生理機(jī)制[11-13]。自噬是溶酶體降解蛋白質(zhì)、細(xì)胞器并進(jìn)行再利用的過(guò)程，適度的自噬有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，使細(xì)胞在感染、應(yīng)激等病理因素作用下存活。在膿毒癥的發(fā)病過(guò)程中存在免疫功能抑制，多項(xiàng)臨床研究證實(shí)膿毒癥患者外周血淋巴細(xì)胞減少且淋巴細(xì)胞的自噬減弱[8-9]；另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示激活自噬能夠促進(jìn)膿毒癥小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞存活[14]，Ying等[15]的研究顯示抑制自噬能夠促進(jìn)膿毒癥小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞中自噬基因Beclin-1的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞的自噬程度，與對(duì)照組比較，膿毒癥組外周血中Beclin-1的表達(dá)明顯減少，與國(guó)內(nèi)的研究結(jié)果一致[8-9]，表明膿毒癥發(fā)病過(guò)程中淋巴細(xì)胞的自噬受到抑制。

隨著膿毒癥病情的加重，預(yù)后也相應(yīng)變差、病死率相應(yīng)升高。研究證實(shí)，膿毒癥死亡患者外周血中Beclin-1的表達(dá)水平低于存活患者[8]；結(jié)合已有基礎(chǔ)研究證實(shí)自噬對(duì)淋巴細(xì)胞的保護(hù)作用進(jìn)行分析，膿毒癥發(fā)病過(guò)程中淋巴細(xì)胞自噬減弱不利于細(xì)胞存活、造成淋巴細(xì)胞減少及免疫功能抑制，進(jìn)而導(dǎo)致膿毒癥病情加重、病死率增加。本研究進(jìn)一步采用Kaplan-Meier曲線及ROC曲線分析了Beclin-1表達(dá)與膿毒癥預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示與Beclin-1高表達(dá)患者比較，低表達(dá)患者的28 d累積病死率明顯增加且Beclin-1表達(dá)對(duì)膿毒癥患者28 d病死具有預(yù)測(cè)價(jià)值。此結(jié)果與Beclin-1介導(dǎo)自噬對(duì)淋巴細(xì)胞的保護(hù)作用吻合，表明Beclin-1表達(dá)減少與膿毒癥病死率增加有關(guān)。

膿毒癥預(yù)后的影響因素復(fù)雜，其中APACHEⅡ評(píng)分是目前公認(rèn)的膿毒癥預(yù)后影響因素[1-3,16]，本研究中Kaplan-Meier曲線及ROC曲線分析也驗(yàn)證了APACHEⅡ評(píng)分對(duì)膿毒癥患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。但使用單一指標(biāo)對(duì)預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià)仍有一定的局限性，本研究將采用Beclin-1聯(lián)合APACHEⅡ評(píng)分的方式對(duì)膿毒癥的預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià)。經(jīng)COX回歸分析，Beclin-1及APACHEⅡ評(píng)分是膿毒癥預(yù)后的影響因素，在此基礎(chǔ)上通過(guò)Logistic回歸產(chǎn)生Beclin-1聯(lián)合APACHEⅡ評(píng)分的方程、以此作為評(píng)價(jià)預(yù)后的新指標(biāo)，該新指標(biāo)對(duì)膿毒癥患者28 d病死具有預(yù)測(cè)價(jià)值，且預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積優(yōu)于單一指標(biāo)。

綜上所述，膿毒癥患者外周血自噬基因Beclin-1表達(dá)減少且與28 d病死率增加有關(guān)，Beclin-1聯(lián)合APACHEⅡ評(píng)分用于評(píng)估膿毒癥患者的預(yù)后具有更優(yōu)的預(yù)測(cè)價(jià)值，為今后評(píng)估老年膿毒癥病情、研究膿毒癥發(fā)病機(jī)制提供了新思路、新靶點(diǎn)。但是，本研究的樣本量相對(duì)較少，仍需在今后的研究中繼續(xù)增加樣本量尋找更優(yōu)的截點(diǎn)以提高聯(lián)合指標(biāo)的敏感度和特異度。