汪鴿，韓延華

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性40 歲之前，由于卵巢功能減退引起的一系列異常表現(xiàn)的臨床綜合征，主要特征為月經(jīng)紊亂，包括月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)（4 個月以上），同時伴有促性腺激素升高，連續(xù)2 次FSH 水平＞25 U/L（間隔4 周），以及波動性雌激素降低［1］。POI 患者可能會伴隨出現(xiàn)血脂異常、血壓波動、骨質(zhì)疏松、心血管疾病及不孕癥等，現(xiàn)已成為全球備受關(guān)注的問題。既往研究表明，本病發(fā)病率約為1%，30 歲前女性發(fā)病率為1‰［2］，并呈現(xiàn)逐年上升趨勢。中醫(yī)藥在對本病的治療有較好的臨床療效，因此探討顆粒細(xì)胞凋亡在POI 發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制，以及中醫(yī)藥對POI 的干預(yù)作用，具有重要意義。

1 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是指在一定的生理或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞接受機(jī)體刺激信號后出現(xiàn)的一種主動的、受凋亡相關(guān)基因控制的細(xì)胞程序性死亡［3］。這是多細(xì)胞生物整個生命過程中不可缺少的環(huán)節(jié)，對器官組織的生長發(fā)育、免疫以及非正常細(xì)胞的清除具有重要意義［4］。細(xì)胞凋亡有嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制，以維系各組織器官的發(fā)育和穩(wěn)定，是多細(xì)胞生物中一種高度保守的機(jī)制，一般由特定因子觸發(fā)引起，表現(xiàn)出細(xì)胞皺縮，隨后出現(xiàn)密集的染色質(zhì)凝結(jié)、核碎片、細(xì)胞質(zhì)微泡，最終細(xì)胞分裂成凋亡小體，被鄰近的細(xì)胞或巨噬細(xì)胞迅速吞噬和消化［5］。當(dāng)細(xì)胞凋亡機(jī)制出現(xiàn)異常時，會引起細(xì)胞過度增殖或過度凋亡，從而導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生［6］。參與凋亡調(diào)控和執(zhí)行的途徑及基因產(chǎn)物可能是疾病過程中診斷和治療干預(yù)的優(yōu)秀靶點(diǎn)。因此，探討POI 的細(xì)胞凋亡機(jī)制對其防治有重要作用。

2 卵巢顆粒細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)POI的內(nèi)在機(jī)制

卵泡發(fā)育的各個階段均有細(xì)胞凋亡的發(fā)生和參與，其在卵巢疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。卵泡主要由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞組成，其中顆粒細(xì)胞是卵巢的基礎(chǔ)功能單位，位于卵母細(xì)胞透明帶外側(cè)，支持卵母細(xì)胞生長、發(fā)育和成熟，卵母細(xì)胞指導(dǎo)顆粒細(xì)胞的增殖、分化，參與了卵泡發(fā)育、成熟及排卵的整個過程。顆粒細(xì)胞在閉鎖卵泡中的凋亡早于卵母細(xì)胞，是卵泡閉鎖的發(fā)起者［7］。作為卵巢正常生理功能的重要部分，卵泡閉鎖可以清除不正常的組織，然而，一旦顆粒細(xì)胞凋亡機(jī)制失調(diào)，在卵母細(xì)胞未成熟的情況下引起大量卵泡閉鎖，且閉鎖速度快于生理代謝速度時，會過早耗盡卵巢儲備［8-9］，進(jìn)而造成POI。在動物實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者將卵泡的數(shù)目減少、閉鎖增多，間質(zhì)增生，散在慢性炎細(xì)胞浸潤，卵巢組織萎縮作為卵巢早衰大鼠造模成功依據(jù)，而這些大鼠竇前及竇狀囊泡數(shù)減少，顆粒細(xì)胞層明顯減少處于凋亡狀態(tài)［10］。電泳實(shí)驗(yàn)顯示，在閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞中分離出的DNA 片段呈梯帶圖案，這也是細(xì)胞凋亡的特征性標(biāo)志［11］。HUANG 等［12］發(fā)現(xiàn)卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細(xì)胞層紊亂，而干預(yù)后能夠逆轉(zhuǎn)這些指標(biāo)，并糾正凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，由此可見顆粒細(xì)胞的異常在POI 的發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用。而顆粒細(xì)胞凋亡也是程序性死亡，由不同的凋亡調(diào)控分子活化Caspase 級聯(lián)，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。

目前主要有3 條途徑介導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡的發(fā)生，分別是死亡受體介導(dǎo)途徑、線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。

2.1 死亡受體介導(dǎo)途徑

死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是介導(dǎo)凋亡發(fā)生的重要途徑之一，又被稱為外源性凋亡途徑，是指細(xì)胞外信號所誘導(dǎo)的凋亡途徑，該受體也是腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族中的一員。細(xì)胞外有富含半胱氨酸的區(qū)域，與其配體相結(jié)合共同誘導(dǎo)凋亡；細(xì)胞內(nèi)有一名為死亡區(qū)域（deathdomain，DD）的結(jié)構(gòu)［13-14］，擁有蛋白水解功能。DD 首先啟動死亡信號，并進(jìn)行傳導(dǎo)，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡［15］。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的眾多死亡受體中，具有介導(dǎo)凋亡信號傳導(dǎo)功能的主要有3條：Fas/FasL、TNFR和TRAIL。

Fas/FasL 途徑：Fas 是細(xì)胞表面重要的死亡受體，是跨膜糖蛋白，其配體為FasL，F(xiàn)as 受到刺激后與其配體相結(jié)合，導(dǎo)致3 個Fas 受體分子聚集形成三聚體，使Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）構(gòu)象發(fā)生了變化，激活FADD［16］。FADD 的N 端是死亡效應(yīng)域（DED），C 末端是DD，DED 與pro-Caspases-8 的DED 相連接［17］，形成了一個重要的誘導(dǎo)凋亡的平臺——死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體（DISC），激活下游的效應(yīng)因子Caspase 水解靶蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［18］。

TNFR 途徑：TNF 主要通過TNFR1 和TNFR2 兩種受體介導(dǎo)其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。TNFR1 表達(dá)于幾乎所有細(xì)胞類型中，其胞內(nèi)區(qū)含有DD，可以引起細(xì)胞凋亡，而TNFR2的胞質(zhì)區(qū)不含DD，故無法引起凋亡［19］。TNF通過DD 與TNFR1 結(jié)合后，募集銜接蛋白FADD 和TRADD，TRADD、FADD 與pro-Caspase-8 形成DISC，激活pro-Caspase-8，進(jìn)而激活下游Caspase 活性誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生［16］。而TNFR2則會通過NF-κB 誘導(dǎo)抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄［20］。因此TNFR 可能誘導(dǎo)凋亡及抗凋亡兩種不同的信號途徑，最終結(jié)果如何，取決于雙方信號水平的強(qiáng)弱及時機(jī)的不同［21］。

TRAIL 途徑：TRAIL 有兩個死亡受體——DR4/5，又稱功能型受體，他們的結(jié)構(gòu)類似，其細(xì)胞內(nèi)有傳遞凋亡信號的DD。TRAIL 可以通過與DR4/5 結(jié)合的方式來傳遞凋亡信號。TRAIL 與表達(dá)在細(xì)胞膜表面的DRs結(jié)合后活化成三聚體，募集FADD［22］。隨后FADD通過DED 之間的相互作用結(jié)合凋亡起始因子pro-Caspase-8，形成DISC［23］，激活為Caspase-8并通過兩種途徑來傳遞死亡信號。一種是外源性凋亡途徑，Caspase-8 活化后，可以直接激活下游Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，啟動凋亡執(zhí)行蛋白酶Caspase-3 促使細(xì)胞凋亡。另一種是內(nèi)源性凋亡途徑，需要依賴線粒體來完成凋亡誘導(dǎo)過程，又稱線粒體依賴型通路，活化的Caspase-8 切割Bid 為tBid 形式，轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)，作用于線粒體膜上，使其通透性增加，釋放細(xì)胞色素C（Cyt C）和一些凋亡誘導(dǎo)因子到胞漿中，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生［24］。

綜上，F(xiàn)as/FasL、TNFR和TRAIL 3條途徑共同交匯于Caspase-8激活下游因子而發(fā)生凋亡。但目前對死亡受體的相關(guān)研究尚未成熟，很多內(nèi)在的機(jī)制仍不完善，未來需要對受體信號調(diào)節(jié)做進(jìn)一步研究。

2.2 線粒體途徑

卵泡的成功發(fā)育取決于多種因素，包括受體和激素之間的協(xié)調(diào)表達(dá)、細(xì)胞因子刺激、最佳pH 值和充足的能量供應(yīng)。而線粒體是細(xì)胞能量的主要提供者，在細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［25］。

當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，線粒體膜通透性增加，并增加活性氧（ROS）的數(shù)量，線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激共同誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡［26］。進(jìn)而使得卵泡發(fā)育異常，發(fā)生閉鎖，進(jìn)一步發(fā)展引起POI。此外作為參與線粒體動力學(xué)的最重要蛋白質(zhì)之一，線粒體融合基因2（mitofusin2，Mfn2）在調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)和維持線粒體DNA 穩(wěn)定性方面起著不可或缺的作用。它是一種位于線粒體外膜的保守的Dynamin 樣GTP 酶，通過調(diào)節(jié)其融合和裂變過程來影響線粒體的結(jié)構(gòu)和功能［27-28］。Mfn2 通過調(diào)節(jié)其呼吸鏈，線粒體膜電位以及細(xì)胞代謝和細(xì)胞凋亡來維持正常的哺乳動物細(xì)胞功能［29-30］，因此Mfn2 的較低表達(dá)會增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力，這可能導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡［31-32］。Mfn2 在維持線粒體DNA 的完整性中起重要作用，其可能通過線粒體氧化磷酸化影響顆粒細(xì)胞的功能。有研究結(jié)果顯示小鼠組織中Mfn2水平的降低會引起線粒體形態(tài)的改變，推測Mfn2 可能使濾泡發(fā)育紊亂，從而通過調(diào)節(jié)線粒體功能和能量代謝，導(dǎo)致POI［33］。研究顯示卵巢早衰患者線粒體DNA含量比正常人的低［34］。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核細(xì)胞中重要的膜性細(xì)胞器，它可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，同時通過對鈣的貯存與釋放參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)糖基化修飾過強(qiáng)、感染、炎癥等刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白增多或鈣離子濃度發(fā)生變化，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［35］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）是細(xì)胞的一種自我保護(hù)性措施，能加強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理蛋白質(zhì)的能力，恢復(fù)其穩(wěn)定狀態(tài)，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活［36］。當(dāng)ERS 過于強(qiáng)烈和持久，UPR 不能抵抗，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)不能恢復(fù)時，則發(fā)生細(xì)胞凋亡。其激活細(xì)胞凋亡主要表現(xiàn)在兩個方面。首先，ERS 主要通過活化CHOP 和JNK 兩個重要的中間信號分子傳導(dǎo)，最終由Caspase-12執(zhí)行細(xì)胞凋亡命令［37］。其次，細(xì)胞通過感應(yīng)胞漿內(nèi)高濃度的Ca2+激活鈣依賴性蛋白酶，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡，同時，高濃度Ca2+又可以作用于線粒體使其膜電位改變，釋放Cyt C，與胞質(zhì)中人凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf1）結(jié)合，進(jìn)一步激活Caspase-3 和Caspase-7，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［38］。

吳玉萍［39］通過建立順鉑誘導(dǎo)POI小鼠模型和體外順鉑刺激卵巢顆粒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停Y(jié)果顯示順鉑可激發(fā)顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，損傷卵巢結(jié)構(gòu)，誘發(fā)顆粒細(xì)胞凋亡增多而導(dǎo)致POI 的發(fā)生，運(yùn)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑后，顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激得以緩解，顆粒細(xì)胞凋亡率降低，最終緩解POI的程度。

3 中醫(yī)藥調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡治療POI

隨著POI 研究的進(jìn)一步深入，中醫(yī)藥調(diào)節(jié)卵巢功能，延緩POI 的內(nèi)在機(jī)制受到越來越多臨床工作者的關(guān)注，針對單味中藥提取物、中藥復(fù)方及中醫(yī)其他治法對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用開展了諸多研究，且療效良好。

3.1 中藥單體提取物

李育等［40］觀察山茱萸多糖對自然衰老雌性小鼠卵巢功能的改變，發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖組與空白對照組相比在電鏡下可見到各級生長卵泡，顆粒細(xì)胞多而厚，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，證實(shí)山茱萸多糖具有抗衰老作用，能夠明顯改善自然衰老雌性小鼠的卵巢功能。馬蔚蓉等［41］采用雷公藤苷灌胃制備POI 小鼠，發(fā)現(xiàn)模型小鼠血清抗氧化物SOD、CAT 水平降低，顆粒細(xì)胞中的Nrf-2、HO-1 表達(dá)降低，ROS 水平上升，提示存在氧化應(yīng)激。予金絲桃苷治療后，POI 小鼠卵泡數(shù)和黃體數(shù)均增加，卵巢病理損傷減輕，血清FSH 水平降低，E2、AMH、SOD、CAT 水平升高，卵巢顆粒細(xì)胞中的氧化相關(guān)指標(biāo)（Nrf-2、HO-1）和凋亡相關(guān)指標(biāo)（p-PI3K、p-Akt、Bcl-2）表達(dá)上升，氧化相關(guān)因子ROS 水平降低，凋亡相關(guān)因子Caspase-3 和Bax 表達(dá)下降，TUNEL顯示細(xì)胞凋亡水平降低。提示金絲桃苷具有抗氧化、抗凋亡作用，并通過相關(guān)因子來減少POI 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，增加了各級卵泡數(shù)，一定程度上修復(fù)了卵巢病理損傷，改善了卵巢儲備。

3.2 中藥復(fù)方

王玲［42］通過對經(jīng)方左歸丸的研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸可以通過抑制AZAb 的產(chǎn)生和抑制Fas 介導(dǎo)的卵泡細(xì)胞凋亡使自身免疫性POF 模型小鼠的Bcl-2 增加，F(xiàn)aL降低，細(xì)胞凋亡率明顯下降，從而改善小鼠卵巢及免疫功能。劉慧萍等［43］研究顯示，補(bǔ)腎活血方組（熟地黃、山茱萸、紫石英、補(bǔ)骨脂、菟絲子、生地黃、桑寄生、烏藥、雞內(nèi)金、澤瀉、土鱉蟲、覆盆子、路路通、澤蘭、桔梗、水蛭和甘草）小鼠Fas mRNA 表達(dá)水平明顯低于模型組。補(bǔ)腎活血方通過抑制Fas、FasL 基因的表達(dá)和提高E2，降低LH、FSH 的水平，從而改善卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡達(dá)到治療作用。張麗娟等［44］研究了二仙湯對順鉑所致模型組小鼠的影響，灌胃后二仙湯組BXA 蛋白表達(dá)量減少，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，凋亡的卵泡顆粒細(xì)胞減少，E2含量升高，說明二仙湯可通過抑制順鉑減輕卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，改變E2與FSH 含量，促進(jìn)卵泡生長，促進(jìn)卵巢功能的恢復(fù)。譚貝加等［45］研究發(fā)現(xiàn)，寧心紅杞膠囊能夠增加卵泡顆粒細(xì)胞中線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量，并改善其形態(tài)，改善顆粒細(xì)胞功能，延緩卵巢衰老。

3.3 中醫(yī)其他療法

盧巖等［46］運(yùn)用盧氏隔藥灸臍法治療POI 大鼠，大鼠卵巢Bcl-2 蛋白和mRNA 表達(dá)顯著升高，Bax 蛋白和mRNA 表達(dá)明顯降低，提示隔藥灸臍可以通過抑制卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡來改善卵巢功能。曹俊紅針刺大鼠腎俞、足三里和三陰交穴治療圍絕經(jīng)期大鼠，與未接受針刺的大鼠對比發(fā)現(xiàn)，針刺治療后大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Fas mRNA 表達(dá)明顯降低，而Bcl-2 mRNA 表達(dá)明顯提高［47］。鄭艷華等［48］發(fā)現(xiàn)低頻電針能夠降低大鼠卵巢組織中Bax/Bcl-2 比值，卵巢染色切片發(fā)現(xiàn)接受針刺的大鼠卵巢可見多個黃體存在，囊性卵泡減少，顆粒細(xì)胞層明顯增厚，推測針灸可能是通過線粒體途徑和死亡受體途徑抑制卵巢細(xì)胞凋亡，改善卵巢微環(huán)境，從而延緩卵巢早衰的進(jìn)程。

綜上可見，中醫(yī)藥對POI 的治療均以補(bǔ)腎為基本原則，腎藏精，主生殖，為先天之本，元?dú)庵I氣盛則天癸至，月事來潮，腎為卵巢功能盛衰、月經(jīng)行止、卵泡發(fā)育的主導(dǎo)，故選用補(bǔ)腎填精之中藥和腧穴。研究中亦發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎能提高免疫功能，增加卵巢血流，改善卵巢微環(huán)境，提升卵巢功能，促進(jìn)卵泡發(fā)育。故補(bǔ)腎益精是促卵泡發(fā)育，治療POI的根本大法。

4 展望

近年來對POI機(jī)制的研究不斷深入，已經(jīng)證實(shí)POI與凋亡、自噬、氧化應(yīng)激等機(jī)制相關(guān)，目前激素替代療法（HRT）是經(jīng)典的治療方案，但激素治療會增加乳腺癌、血栓性疾病和肝腎代謝異常等風(fēng)險。越來越多實(shí)驗(yàn)研究證明中醫(yī)藥在改善卵巢功能方面有著較好的效果，體現(xiàn)了中醫(yī)藥多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)［49］。本文介紹了介導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致POI 的3 種途徑及中醫(yī)藥通過抑制凋亡分子降低顆粒細(xì)胞凋亡率，改善卵巢功能的作用，可以為POI 的防治提供思路。補(bǔ)腎貫穿治療本病之始終，符合現(xiàn)代中醫(yī)婦科通過調(diào)整腎-天癸-沖任-胞宮生殖軸的理論思想，能夠改善卵巢功能，提高卵子質(zhì)量，促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟，為臨床治療POI提供了更多的可能性。但目前研究領(lǐng)域主要停留在細(xì)胞因子的相關(guān)研究上，加大中醫(yī)藥與凋亡機(jī)制的研究，將是未來研究的重點(diǎn)和方向［50］，這對治療POI、改善相關(guān)癥狀、提高生育率都有十分重要的意義。