趙洪猛 曹旭晨

乳腺癌是根據(jù)腫瘤生物學(xué)的分子特征指導(dǎo)治療決策的典范。通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）的表達(dá)差異，可將乳腺癌進(jìn)行簡(jiǎn)便粗略的分類(lèi)。PAM50（prediction analysis of microarray 50）分類(lèi)系統(tǒng)首次進(jìn)行了乳腺癌較為精確完整的分子分型，該系統(tǒng)將乳腺癌分為管腔A型（Luminal A）、管腔B型（Luminal B）、HER-2過(guò)表達(dá)型（HER-2-enriched）和基底樣型（Basal-like）不同的固有亞型[1]。但單純將乳腺癌進(jìn)行絕對(duì)的分型并不能完全解釋乳腺癌預(yù)后的差異。與分子分型理論不同，腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（intratumoral heterogeneity，ITH）是指在單個(gè)腫瘤中存在多個(gè)不同亞型，且不同亞型存在動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化。本文將對(duì)乳腺癌ITH的驅(qū)動(dòng)因素和臨床意義的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ITH的驅(qū)動(dòng)因素

1.1 細(xì)胞狀態(tài)異質(zhì)性

正常乳腺分化具有復(fù)雜的層級(jí)結(jié)構(gòu)，最頂端為乳腺干細(xì)胞，可在生理刺激下再生或分化。通過(guò)正常乳腺細(xì)胞分化層級(jí)架構(gòu)建立細(xì)胞狀態(tài)模型，有助于解釋單個(gè)腫瘤內(nèi)可能存在的多種細(xì)胞狀態(tài)。Yeo等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞狀態(tài)譜中，乳腺癌亞型具有可塑性，不同亞型間可相互轉(zhuǎn)化。該研究對(duì)3種不同的乳腺癌小鼠模型（MMTV-PyMT、MMTV-Neu和BRCA1-Null）進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在每種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了乳腺癌多種亞型存在的證據(jù)，提示一個(gè)復(fù)雜的腫瘤組織可能具有多種細(xì)胞狀態(tài)，可在乳腺腫瘤內(nèi)誘導(dǎo)異質(zhì)性。另外，腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）在腫瘤進(jìn)展及治療耐藥中發(fā)揮重要作用。目前認(rèn)為，CSC是存在于腫瘤組織中小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞亞群，通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂，產(chǎn)生保留有相同性質(zhì)的CSC以及不同分化程度、占腫瘤大部分的非致瘤性腫瘤細(xì)胞[3]。Saha等[4]研究發(fā)現(xiàn)多種不同的CSC分子標(biāo)記物，如CD44+/CD24-/low、ALDH+、CD133+和PROCR+等。CSC標(biāo)記物異質(zhì)性可能是一種微環(huán)境特異性行為，也可能是由于不同的空間和時(shí)間因素導(dǎo)致。因此，多種細(xì)胞狀態(tài)可能賦予CSC不同表型，進(jìn)而導(dǎo)致ITH[5]。

1.2 腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等組成，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblast，CAF）是TME的主要組成部分，通過(guò)產(chǎn)生促腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)、生成生長(zhǎng)因子、調(diào)節(jié)腫瘤免疫、調(diào)節(jié)化療耐藥和促進(jìn)轉(zhuǎn)移來(lái)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[6]。CAF可直接或間接影響乳腺癌表型的表達(dá)。近期研究表明，CD63+CAF通過(guò)分泌富含miR-22的外泌體，下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中ER的表達(dá)，導(dǎo)致TAM耐藥[7]。Roswall等[8]研究發(fā)現(xiàn)，基底樣亞型乳腺癌的血小板衍生生長(zhǎng)因子-CC（platelet derived growth factor-CC，PDGF-CC）呈現(xiàn)高表達(dá)，與CAF存在旁分泌交互通路，PDGF-CC的表達(dá)可能決定了腫瘤的分子亞型。另外，CAF本身的異質(zhì)性也會(huì)導(dǎo)致腫瘤治療耐藥的不同。在乳腺癌不同分子亞型中，4種類(lèi)型的CAF表達(dá)存在差異，如CAF-S1和CAF-S4在三陰性乳腺癌（triplenegative breast cancer，TNBC）中的表達(dá)更多[9]。CAFS1亞型可通過(guò)上調(diào)CD25HighFOXP3HighT細(xì)胞和增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）能力來(lái)誘導(dǎo)免疫抑制環(huán)境，進(jìn)而影響免疫治療療效。CAF異質(zhì)性及其對(duì)腫瘤治療耐藥的作用是未來(lái)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。

1.3 克隆進(jìn)化

遺傳因素在ITH的發(fā)展中也起著不可或缺的作用。研究發(fā)現(xiàn)，1例轉(zhuǎn)移性ER+/HER-2+乳腺癌患者行超過(guò)3年的靶向治療后，出現(xiàn)了由克隆進(jìn)化引起的時(shí)間異質(zhì)性[10]。該研究發(fā)現(xiàn)ctDNA可預(yù)測(cè)克隆進(jìn)化，不同部位轉(zhuǎn)移病灶的亞克隆突變與治療反應(yīng)直接相關(guān)。對(duì)克隆進(jìn)化研究較充分的一個(gè)重要通路是Wnt信號(hào)通路。Cleary等[11]首次證明，Wnt信號(hào)誘導(dǎo)的混合譜系腫瘤符合單個(gè)祖細(xì)胞產(chǎn)生的層級(jí)結(jié)構(gòu)，與產(chǎn)生基底樣型或管腔型亞克隆的多克隆細(xì)胞相符。Wnt信號(hào)通路在驅(qū)動(dòng)乳腺癌細(xì)胞不同表型中的作用，為防止克隆進(jìn)化和ITH形成提供了一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。

1.4 代謝重編程

代謝重編程（metabolic reprogramming）是惡性腫瘤的標(biāo)志之一。腫瘤細(xì)胞的代謝重編程是為了適應(yīng)腫瘤對(duì)于物質(zhì)、能量的需求，其中有多種代謝通路參與，包括葡萄糖代謝、谷氨酰胺代謝及脂質(zhì)代謝等。與前述驅(qū)動(dòng)因素導(dǎo)致腫瘤基因表型的差異不同，代謝重編程主要引起代謝原料及產(chǎn)物的變化，大多是由于大分子翻譯后修飾的結(jié)果[12]。不同的腫瘤之間以及腫瘤內(nèi)同樣存在著代謝異質(zhì)性（空間異質(zhì)性）并導(dǎo)致不同腫瘤的療效差異；而腫瘤從癌前病變發(fā)展成浸潤(rùn)性癌，進(jìn)而轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，代謝表型及代謝依賴(lài)性也都在發(fā)生改變（時(shí)間異質(zhì)性）[13]。因此，腫瘤中廣泛存在的代謝異質(zhì)性，也成為驅(qū)動(dòng)ITH的重要因素之一。

2 ITH的臨床意義

2.1 空間異質(zhì)性對(duì)腫瘤原發(fā)病灶的影響

在臨床上，同一腫瘤的不同區(qū)域可通過(guò)免疫組織化學(xué)法顯示出ER、PR和HER-2不同水平的表達(dá)。通過(guò)對(duì)8個(gè)乳腺癌原發(fā)病灶及4種細(xì)胞系行單細(xì)胞測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)存在大量不同突變譜的亞克隆[14]。質(zhì)譜流式成像技術(shù)（imaging mass cytometry，IMC）也被用于空間異質(zhì)性的研究。通過(guò)對(duì)352例乳腺癌患者行IMC檢測(cè)及單細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的表型異質(zhì)性在空間上局限于不同的區(qū)域，具有高度空間異質(zhì)性表型的患者預(yù)后較差[15]。針對(duì)ITH的治療策略必須足夠廣泛而強(qiáng)大，以對(duì)抗源自這種異質(zhì)性的阻力。推薦的解決方案包括聯(lián)合治療、利用乘客突變、根除“致命”克隆、適應(yīng)性治療、靶向TME和免疫治療等[16]。

2.2 時(shí)間異質(zhì)性的對(duì)轉(zhuǎn)移病灶的影響

乳腺癌亞型的分子特征并非恒定不變，不同亞型間可相互轉(zhuǎn)化。通過(guò)對(duì)原發(fā)病灶與轉(zhuǎn)移病灶的比較，可最好地理解導(dǎo)致ITH的時(shí)間演變。Priedigkeit等[17]對(duì)20例乳腺癌原發(fā)病灶和腦轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在13例HER-2-患者中，3例腦轉(zhuǎn)移病灶為HER-2+，不僅表明亞型之間可動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化，也提示對(duì)轉(zhuǎn)移病灶行靶向治療的潛力。雖然HER-2-原發(fā)病灶到HER-2+腦轉(zhuǎn)移病灶之間的轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不清楚，但可能是因大腦中的微環(huán)境有利于HER-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。亞型之間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化并不限于腦轉(zhuǎn)移。一項(xiàng)針對(duì)390例乳腺癌患者的臨床研究，比較了原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶的分子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ER、PR和HER-2的表達(dá)在原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶間頻繁地轉(zhuǎn)化[18]。該研究的原發(fā)病灶與轉(zhuǎn)移病灶中的ER、PR和HER-2分別在18.3%、40.3%和13.7%患者中出現(xiàn)不一致，而這些轉(zhuǎn)化取決于轉(zhuǎn)移病灶的微環(huán)境，在骨和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的ER轉(zhuǎn)化率較高，而肝臟的ER轉(zhuǎn)化率較低。Garcia-Recio等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在Luminal A型腫瘤的一組患者中，雖存在HER-2+轉(zhuǎn)移病灶，但對(duì)靶向HER-2治療仍無(wú)效。在該研究中，內(nèi)分泌治療引起獲得性耐藥并誘導(dǎo)HER-2+表型表達(dá)，但在抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4（fibroblast growth factor receptor 4，F(xiàn)GFR4）后，HER-2+表型恢復(fù)為更惰性的Luminal A型。乳腺癌亞型之間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化是腫瘤治療耐藥和轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制，在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床決策中需充分考慮這些因素的影響。

2.3 ITH對(duì)治療耐藥的影響

腫瘤間和ITH均被認(rèn)為可介導(dǎo)治療耐藥。Guarneri等[20]檢測(cè)107例HER-2+乳腺癌患者的病理反應(yīng)率，與行化療聯(lián)合靶向治療的患者相比，行單純的新輔助化療的患者出現(xiàn)HER-2表達(dá)缺失的比例更高，HER-2表達(dá)缺失與復(fù)發(fā)率增加有關(guān)，提示腫瘤動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化成為化療耐藥的表型。在一項(xiàng)日本的新輔助化療研究中，大多數(shù)乳腺癌患者僅行單純的化療方案，有21.4%患者的腫瘤初始HER-2+在新輔助治療后轉(zhuǎn)化為HER-2-[21]。該研究進(jìn)一步表明了表型的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化與耐藥的關(guān)系。此外，代謝重編程也參與到HER-2+乳腺癌的耐藥過(guò)程。利用脂肪酸合酶（FASN）抑制劑，可使曲妥珠單抗或拉帕替尼耐藥的乳腺癌細(xì)胞恢復(fù)敏感性[22]。而另有研究證實(shí)，二甲雙胍可通過(guò)多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的代謝，進(jìn)而對(duì)抗HER-2+乳腺癌的靶向耐藥[23]。TNBC患者的腫瘤本質(zhì)上存在明顯異質(zhì)性，在化療敏感的TNBC腫瘤中存在化療耐藥亞群。TNBC固有的異質(zhì)性提供了更多樣化的細(xì)胞群，可以從中獲得化療耐藥。

腫瘤的進(jìn)化也是導(dǎo)致乳腺癌治療耐藥的原因之一。Brady等[24]利用全外顯子組、單細(xì)胞RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，4例轉(zhuǎn)移性ER+乳腺癌患者有克隆進(jìn)化。已存在的耐藥表型，包括增強(qiáng)的間質(zhì)/生長(zhǎng)信號(hào)（促進(jìn)耐藥）和降低的抗原呈遞/腫瘤壞死因子-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（免疫抑制），成為治療后的主要表型。Kim等[25]利用單細(xì)胞DNA和RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，TNBC耐藥患者適應(yīng)性基因組的選擇和轉(zhuǎn)錄重編程具有克隆持久性。在HER-2過(guò)表達(dá)的亞型中，使用2種不同的抗HER-2藥物（拉帕替尼和曲妥珠單抗）治療的患者誘導(dǎo)出低增殖性的Luminal A表型[26]。為克服ITH導(dǎo)致的耐藥，需要不同分子機(jī)制中關(guān)鍵靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和新型靶向藥物的研發(fā)，也會(huì)將乳腺癌的分子靶向治療推向一個(gè)更高的層面。

3 結(jié)語(yǔ)

ITH促進(jìn)了疾病進(jìn)展和治療耐藥，確定其分子驅(qū)動(dòng)因素（尤其是TME）并了解對(duì)轉(zhuǎn)移和耐藥的影響，將對(duì)未來(lái)的治療方法進(jìn)行指導(dǎo)。以單細(xì)胞分辨率分析腫瘤（如轉(zhuǎn)錄組分析）揭示了僅進(jìn)行腫瘤的整體分析而被忽視的異質(zhì)性，有助于確定驅(qū)動(dòng)耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)以及對(duì)保留細(xì)胞結(jié)構(gòu)關(guān)系的單細(xì)胞分析（如類(lèi)器官模型）等新技術(shù)的出現(xiàn)，將進(jìn)一步擴(kuò)展對(duì)乳腺腫瘤異質(zhì)性的理解，有助于開(kāi)發(fā)個(gè)體化的靶向治療新策略。