李 濱 趙健烽 馮麗萍 黃建民 馬德蓉

（1江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)工程學(xué)院 江蘇連云港 222000 2江蘇江山聚源生物技術(shù)有限公司 江蘇泰州 214500）

膠原蛋白是利用酸、酶等提取介質(zhì)從動物組織中提取的大分子蛋白質(zhì)，因其具有無毒、易降解、易吸收、低抗原性等特性，深受生物醫(yī)學(xué)及日用化學(xué)領(lǐng)域青睞，被廣泛用作手術(shù)縫合線、止血海綿、人工皮膚、人工血管、人角膜、藥物載體等[1]。但動物來源的大分子膠原蛋白仍存在一些問題[2]：1）存在潛在的傳染病危險，包括動物源及人源性傳染?。ɡ?，艾滋病等）；2）存在引起機體排斥反應(yīng)炎癥的風(fēng)險；3）排斥反應(yīng)導(dǎo)致的高吸收率使治療頻次增加，成本增加。此外，動物源膠原蛋白的提取過程還存在高成本、重污染、獲取率低等缺陷，因此，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組膠原蛋白（recombinant human collagen，RHC）受到廣泛關(guān)注[3]。

重組膠原蛋白的生產(chǎn)工藝為：將來自人體膠原蛋白的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后進行酶切，再通過特定序列的整理縫合、與特定表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli）或畢赤酵母（Pichia pastoris）中[1-2]，獲得相對較高的表達(dá)量；通過發(fā)酵、分離、純化手段生產(chǎn)生物重組膠原蛋白[3-8]。因其具有良好的生物學(xué)相容性、細(xì)胞黏附性、促進新細(xì)胞形成和止血功能[3]，對重組膠原蛋白在創(chuàng)傷修護類化妝品中的作用機理研究，有助于將此類蛋白質(zhì)推廣至日用化妝品領(lǐng)域乃至生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

實驗試劑：血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、氯化鈉（分析純）、氯化鉀（分析純）、EDTA（≥99.5%）、DMSO（≥99.9%）、Weigert鐵蘇木素染色液、天狼星紅染色液、MTT試劑盒（碧云天生物）、細(xì)胞黏附檢測試劑盒（上海康朗生物）、成纖維細(xì)胞（原代培養(yǎng)）、表皮細(xì)胞（原代培養(yǎng)）、重組膠原蛋白、市售膠原蛋白樣品1（簡稱“市售1”）、市售膠原蛋白樣品2（簡稱“市售2”）、動物膠原蛋白、RGD肽（Arg-Gly-Asp多肽，一種已被報道的細(xì)胞粘附序列，可明顯增加細(xì)胞黏附性）。

儀器：96孔板（Nunc-96，賽默飛世爾，中國）、Franz擴散池（Permergear，世聯(lián)博研，美國）、酶標(biāo)儀（MR-96A，貝登醫(yī)療，南京）、低速冷凍離心機（RC3B PLUS，SORVALL，美國）、光學(xué)顯微鏡（DM3000 LED，徠卡，德國）、石蠟包埋機（EG1150H，徠卡，德國）、切片機（KD-3368AM，世紀(jì)科信，北京）、移液器（F1 Clip Tip，賽默飛世爾，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 促細(xì)胞生長實驗 將活性好的細(xì)胞制作成單細(xì)胞懸浮液并統(tǒng)計數(shù)量，使細(xì)胞密度為104個/mL，接種于96孔板，每孔中加入細(xì)胞懸浮液200 μL，生長至細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的待測樣品（0.0001%、0.0005%、0.0025%、0.0125%、0.0625%、0.3125%，注：如果有效，可繼續(xù)下調(diào)濃度），每個樣品設(shè)置5個重復(fù)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h（每72 h更換一次含膠原蛋白樣品的培養(yǎng)液）。

至每個時間點，向?qū)?yīng)的孔中加入20 μL MTT溶液（用pH=7.4的PBS配制），再培養(yǎng)4 h，停止。

快速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，棄去上清液，每孔添加150 μL DMSO，振蕩10 min溶解MTT結(jié)晶。

用酶聯(lián)檢測儀檢測各孔在490 nm處的吸光值（OD490值），同時設(shè)置無細(xì)胞孔作為對照組進行調(diào)零，取6孔平均值。

以培養(yǎng)時間與吸光值為坐標(biāo)軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.2 細(xì)胞遷移實驗

1）細(xì)胞鋪板：以記號筆均勻地分割6孔板，中間間隔0.5～1 cm，每個孔至少橫穿3條線。每孔中大約加入5×105個/mL細(xì)胞，過夜后可將孔鋪滿。

2）劃痕實驗：第2天使用移液器吸頭垂直于橫線進行劃痕，用PBS清洗細(xì)胞3次，洗脫被劃下的細(xì)胞，加入至含有RHC的無血清培養(yǎng)基中，作為對照組；加入至含有實驗樣品（市售1和市售2）的培養(yǎng)基中，作為實驗組，最終濃度為0.05%。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，取樣時間分別為0 h、6 h、24 h。

3）數(shù)據(jù)處理：計算不同時間段之間細(xì)胞整體遷移的距離，得出平均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差，建立直角坐標(biāo)系，以時間為橫軸，遷移距離為縱軸作圖，計算公式如下：

式中：Si表示每個時間長度細(xì)胞整體遷移的距離；S0表示0時距離長度；St表示每個時間點的距離長度。

1.2.3 細(xì)胞黏附實驗

1）包被：將100 μL包被液加入96孔板，2～8℃條件下過夜。移除包被液，用洗滌液洗滌2～3次。

2）細(xì)胞接種：胰酶消化處理的待測細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，用相應(yīng)培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，按5×104個/mL細(xì)胞，接種于96孔板；同時加入含膠原蛋白樣品，RHC終濃度為0.05%和0.01%，設(shè)置5個重復(fù)。設(shè)立對照組，即未加樣品的細(xì)胞懸液組；設(shè)置含有RGD肽的陽性對照組。放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。取出培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)基，洗滌2～3次，每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)基。

3）黏附率檢測：96孔板每孔加入10 μL細(xì)胞染色液B，在37℃孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm各孔的吸光值（OD450值）。各重復(fù)孔的OD450值取平均數(shù)，計算細(xì)胞黏附率的公式如下：

1.2.4 透皮性實驗

1）制樣：取制備好的離體豬皮，用擴散池進行透皮實驗。供給液分為對照組和實驗組。

2）組織切片：用4%多聚甲醛固定上述豬皮24 h，用自來水高流速沖洗12 h，后依次浸泡在75%、85%、95%Ⅰ、95%Ⅱ的乙醇中各1 h，進行脫水處理。然后浸泡于1∶1的無水乙醇及二甲苯混合液中30 min，二甲苯Ⅰ中15 min，二甲苯Ⅱ中15 min，進行透明化處理。再進行浸蠟處理，分別浸泡于石蠟Ⅰ中1 h，石蠟Ⅱ中過夜，石蠟Ⅲ中1 h。用石蠟包埋機進行包埋，修蠟后，在-20℃的冰箱中過夜保存。最后，用切片機將切片橫向及縱向切成5 mm切片，40℃展片，62℃烤片。

3）天狼星紅染色：

①染色前先脫蠟：水，二甲苯Ⅰ中10 min，二甲苯Ⅱ中10 min，無水乙醇Ⅰ中2 min，無水乙醇Ⅱ中2 min，95%乙醇2 min，85%乙醇2 min，75%乙醇2 min，流水沖洗。

②染色時用weigert鐵蘇木素染色液將組織切片染色10～20 min，自來水沖洗5～10 min，用蒸餾水清洗1次。隨后使用天狼星紅染液染色1 h，流水沖洗后，去除染液。

③染色后脫水，浸泡于95%Ⅰ、95%Ⅱ的乙醇中各5 min，無水乙醇Ⅰ中5 min，無水乙醇Ⅱ中5 min，二甲苯Ⅰ中5 min，二甲苯Ⅱ中5 min透明。

④將中性樹膠滴于載玻片組織上，用蓋玻片覆蓋，覆蓋時應(yīng)先接觸一邊，后逐漸覆蓋，可有效避免產(chǎn)生氣泡。

4）顯微鏡觀察拍照：在普通光學(xué)顯微鏡下，觀察分析實驗組和對照組在顯微鏡下的組織切片，并拍照。紅色為膠原纖維，藍(lán)色為細(xì)胞核，黃色為肌纖維。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞生長實驗

2.1.1 RHC促進細(xì)胞生長的起效量實驗 對比各組細(xì)胞生長，分析RHC促進成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞生長的最低起效量濃度。圖1結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的生長趨勢相似。與對照組相比，當(dāng)RHC濃度≥0.0025%時，實驗組均可促進細(xì)胞的生長；而當(dāng)RHC濃度＜0.0025%時，其生長情況與對照組大致相同。這證明RHC促進細(xì)胞（成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞）生長的起效量為0.0025%。

2.1.2 RHC與市售普通膠原蛋白1、2對比實驗本文選用RHC濃度為0.01%，該濃度可促進細(xì)胞生長，采用實驗方法1.1.2得到實驗結(jié)果如圖2所示，RHC組的細(xì)胞生長速率明顯快于市售普通膠原蛋白1、2組，表明RHC促進細(xì)胞生長的性能優(yōu)于市售普通膠原蛋白1、2。

2.1.3 表皮細(xì)胞生長形態(tài)學(xué)變化 如圖3所示，在倒置顯微鏡下，接種1 d，各組表皮細(xì)胞呈球形，大小均勻，邊界清晰；在接種2～4 d內(nèi)，細(xì)胞逐漸貼壁生長，形狀呈眼球形，可觀察到細(xì)胞核，細(xì)胞數(shù)量快速增長并連接成片狀，各組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異；與空白對照組比，其他各組細(xì)胞增長量明顯，其中RHC組表皮細(xì)胞密度最大，分布均勻。

2.2 細(xì)胞遷移實驗 根據(jù)實驗組和對照組不同時間點細(xì)胞整體遷移距離，分析RHC及其他樣品促進細(xì)胞遷移的能力。

本實驗主要為劃痕實驗，通過顯微鏡觀察不同時間內(nèi)“傷口”的愈合程度，即細(xì)胞的遷移（圖4）。圖5統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，RHC組在6 h的細(xì)胞遷移距離大于其他組在24 h的遷移距離，而24 h后，RHC組的細(xì)胞遷移距離遠(yuǎn)高于其他對照組，證明RHC促進細(xì)胞遷移能力優(yōu)于市售普通膠原蛋白。

此外，本研究還采用以人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞為代表的單層體外實驗?zāi)Ｐ停▽嶒灧椒ㄖ形大w現(xiàn)這部分），測定了2種化妝品原料（海洋膠原蛋白）體外促進創(chuàng)面愈合的能力。在體外系統(tǒng)中，通過產(chǎn)品促進損傷組織愈合的能力評價修復(fù)效果。

以0.1%濃度為例，在相同時間內(nèi)，RHC的細(xì)胞修復(fù)能力比海洋膠原蛋白更加突出。圖6數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)過t檢驗，2 h后RHC組細(xì)胞遷移變化率呈顯著性差異，且24 h后RHC的細(xì)胞修復(fù)比海洋膠原蛋白高21.1%。因此，RHC在細(xì)胞修復(fù)方面的效果比海洋膠原蛋白更加顯著，且起效速度更快，2 h內(nèi)即有顯著效果。

2.3 細(xì)胞黏附實驗 根據(jù)各組的黏附率，分析并比較RHC與市售普通膠原蛋白1、2及RGD肽的細(xì)胞黏附能力。

如表1所示，RHC的促細(xì)胞黏附性能明顯優(yōu)于市售普通膠原蛋白，且RHC促細(xì)胞黏附性能與濃度相關(guān)，RHC濃度越大，細(xì)胞黏附增強，這一性質(zhì)對不同種類的細(xì)胞無較大差異。當(dāng)RHC濃度達(dá)到0.05%時，細(xì)胞黏附率已高達(dá)45%，根據(jù)已報導(dǎo)文獻[9]：細(xì)胞黏附率大于40%說明材料已具有優(yōu)良的細(xì)胞黏附性能。

表1 不同濃度RHC的細(xì)胞黏附情況匯總（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.4 透皮性實驗

2.4.1 皮膚中RHC的吸收利用情況 通過對照組與實驗組的染色，比較2組內(nèi)表皮RHC含量。由內(nèi)表皮RHC含量差異，得出皮膚中RHC的吸收利用量。

在顯微鏡下觀察對照組和實驗組的切片并拍照（圖7），可發(fā)現(xiàn)實驗組中紅色所占面積更大，表明涂抹過RHC溶液的豬皮中膠原蛋白含量更多，即豬皮吸收了一定的RHC溶液，使其膠原蛋白含量上升，高于動物膠原蛋白對照組。

2.4.2 RHC在皮膚深度方向上的吸收量分布由實驗組與對照組不同深度處的染色顯色差異，可分析皮膚不同深度對于膠原蛋白的吸收情況。

實驗組中不同深度的組織切片，紅色分布較為一致，顏色不隨深度的變化而變化（圖8）。對照組中，顏色亦不隨深度的變化而改變。但在不同深度下，實驗組的紅色分布多于對照組，這說明在一定時間后，豬皮在吸收RHC后可達(dá)到一個平衡的狀態(tài)，其吸收的膠原蛋白分布均勻。

圖9顯示，實驗組縱向紅色分布較為均勻，顏色不隨縱向位置的不同而發(fā)生較大變化，結(jié)果與圖7一致。而對照組（10倍濃度動物膠原）中，顏色隨縱向位置的不同有較大的變化，證明動物膠原在皮膚中滲透是不均一的；隨著濃度增加（100倍濃度動物膠原），染料顏色加深，說明動物膠原透過皮膚的量增加。但同實驗組比（從縱向及橫向2個方面），動物膠原的滲透性能是弱于RHC的。本實驗證明，RHC具有更強的透皮性能，且在皮膚的分散性更均勻。

3 討論

細(xì)胞生長實驗中，RHC促進細(xì)胞生長的起效量為0.0025%，優(yōu)于市售普通膠原蛋白。重組膠原蛋白比普通膠原蛋白在分子量方面具有一定優(yōu)勢，有研究表明，膠原蛋白分子量為1 500～3 000 Da時，更容易被人體吸收利用。重組膠原蛋白在基因構(gòu)建時，可通過控制氨基酸含量實現(xiàn)小分子量重組膠原蛋白的生產(chǎn)。本研究所用重組膠原蛋白分子量約2 000 Da，相比于市售的大分子膠原蛋白，重組膠原蛋白在促進細(xì)胞生長方面具有明顯優(yōu)勢。

促細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示，24 h內(nèi)，RHC促進細(xì)胞遷移能力優(yōu)于市售普通膠原蛋白；細(xì)胞黏附性方面，RHC濃度越高，黏附性越強；與動物膠原蛋白相比，RHC具有更優(yōu)異的透皮性能。重組膠原蛋白具有與普通膠原蛋白相同的三螺旋結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，本研究所用重組膠原蛋白在構(gòu)建過程中加入了更多的親水性基團與活性基團，這些基團有效提高了重組膠原蛋白的親水性與生物活性。親水性基團可與皮膚中的水分結(jié)合達(dá)到保濕效果，也有效增強了細(xì)胞黏附性。同時強活性使得重組膠原蛋白具有強滲透性，可透過角質(zhì)層與皮膚上層細(xì)胞結(jié)合，參與和改善皮膚細(xì)胞的代謝，增強皮膚中原有膠原蛋白的活性。因此，重組膠原蛋白在促細(xì)胞遷移、促細(xì)胞黏附與透皮性方面都展現(xiàn)出優(yōu)于普通膠原蛋白的性能。綜上，從生物相容性方面分析，RHC展現(xiàn)出的優(yōu)良性能，為其在表皮修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能性。

總體上，重組膠原蛋白應(yīng)用前景廣闊，其高穩(wěn)定性、易擴大生產(chǎn)、高生物相容性等特點均是其作為組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品的實施基礎(chǔ)，研究者也將重組膠原蛋白用于創(chuàng)面修復(fù)、角膜替代物等再生醫(yī)療領(lǐng)域，已取得了一定的臨床效果[10-14]，故對重組膠原蛋白的開發(fā)研究在未來依然是生物材料領(lǐng)域熱點研究方向之一。