劉勝楠 陳 卓

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)在全球常見的癌癥中排名第3，每年大約有9%的癌癥相關(guān)死亡病例與CRC相關(guān)且CRC患者的5年總體生存率只有65%[1～3]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)是一種在各種組織中普遍存在的保守的表觀遺傳程序，其中在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中EMT可以增強腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力，使其獲得干細胞特性和細胞凋亡抗性[4,5]。目前已有多項研究表明EMT參與了CRC的進程，例如SPNS2通過上調(diào)PTEN和介導(dǎo)AKT通路的失活抑制EMT并降低CRC細胞的轉(zhuǎn)移，高表達的ZEB2通過增強EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序上調(diào)ERCC1的表達以激活核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair, NER)通路，從而導(dǎo)致CRC的化療耐藥性和肝轉(zhuǎn)移[6,7]。

circRNA是一類沒有3′聚腺苷化尾巴和5′帽狀結(jié)構(gòu)的以共價閉合環(huán)為主要特征的非編碼RNA[8]。circRNA起源于親本基因的外顯子或者內(nèi)含子，其中外顯子circRNA占主要部分且優(yōu)先定位于細胞質(zhì)中，在細胞質(zhì)中它們可以作為miRNA的海綿影響基因的表達或者直接結(jié)合蛋白調(diào)控其功能[9]。circRNA的異常表達在幾乎所有癌癥中都有發(fā)現(xiàn)，circNDUFB2通過破壞IGF2BPs的穩(wěn)定性激活抗腫瘤免疫來抑制非小細胞肺癌的進展，N6-甲基腺苷誘導(dǎo)的circ1662通過增強YAP1的核易位促進結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[10,11]。

本研究篩選出在CRC中明顯高表達的hsa_circ_0102049，hsa_circ_0102049通過增強EMT促進CRC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。此外，同時分析出與hsa_circ_0102049結(jié)合的miR-96-5p以及其下游靶標AK3，證明hsa_circ_0102049通過miR-96-5p/AK3軸促進CRC細胞的EMT。

材料與方法

1.實驗材料：HCT116和DLD-1細胞系購自中國科學(xué)院細胞庫(上海)。McCoy′s 5A和RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，青鏈霉素、脫脂奶粉和4%多聚甲醛購自江蘇Vicmed公司，胎牛血清購自浙江天杭生物公司， RIPA細胞裂解液、PMSF、結(jié)晶紫染液和BCA蛋白濃度檢測試劑購自上海碧云天公司，Silentfect Lipid轉(zhuǎn)染試劑購自美國Bio-Rad公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑、qPCR試劑和ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑購自江蘇諾唯贊公司，siRNA試劑購自上海吉瑪公司， Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司，PVDF膜和Millicell小室購自德國Merck公司，hsa_circ_0102049、miR-96-5p、AK3和GAPDH引物購自上海生工公司，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH抗體購自美國Proteintech公司，HRP-山羊抗兔 IgG和HRP-山羊抗小鼠 IgG購自北京博奧龍公司。

2.GEO數(shù)據(jù)庫分析：通過R中的GEOquery包下載GSE126094表達矩陣并將探針名注釋為基因名，隨后通過stringr、reshape2、ggplot2、ggfortify包對數(shù)據(jù)均一化處理和檢查并使用limma包分析差異表達的circRNA。

3.細胞培養(yǎng)：HCT116和DLD-1細胞分別置于McCoy′s 5A和RPMI 1640培養(yǎng)基中并添加10%胎牛血清和100μg/ml青鏈霉素進行培養(yǎng)，兩個細胞系均置于含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中。

4.細胞轉(zhuǎn)染：HCT116和DLD-1細胞生長至30%的比例時，將Silentfect Lipid和siRNA按照2∶1的比例使用無血清培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)染，6h后更換為完全培養(yǎng)基，待細胞繼續(xù)生長48h收取進行實驗。本研究使用的siRNA及對照序列如下：si- hsa_circ_0102049#1: 5′- GGAAAATTGAAAGAGTCTGAT -3′;si- hsa_circ_0102049#2: 5′- GATGGAAAATTGAAAGAGTCT -3′;si-Ctrl: 5′-UUCUCCGAACG-UGUCACGUTT-3′。

5.CCK-8實驗：細胞轉(zhuǎn)染后48h使用胰酶消化收集，進行細胞計數(shù)后向96孔板的每個孔中分別加入含4000個細胞的完全培養(yǎng)基200μl，每組各加6個復(fù)孔，24、48、72、96h后加入CCK-8液孵育2h并測量測量吸光度(A450)。

6.遷移侵襲實驗：實驗前2h小室放入24孔板中，將Matrigel基質(zhì)膠和無血清培養(yǎng)基按照1∶9的比例加入至小室上層并放入37℃培養(yǎng)箱備用，細胞轉(zhuǎn)染后48h使用胰酶收集并計數(shù)，每個小室上層加入含10萬細胞的無血清培養(yǎng)基200μl，小室下層則加入含20%血清的培養(yǎng)基800μl。在24和48h后分別收取添加和未添加基質(zhì)膠的小室置于4%多聚甲醛固定20min并置于結(jié)晶紫染色液中染色10min，使用棉簽擦去小室上層細胞并晾干后置于顯微鏡拍照。

7.RNA提取和實時定量PCR：細胞轉(zhuǎn)染48h后使用TRIzol提取總RNA，使用相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及qPCR試劑置于Roche LC96儀器檢測目標RNA表達水平，其中使用GAPDH作為內(nèi)參并用2-△△cq進行數(shù)據(jù)計算。本研究使用的引物序列如下：hsa_circ_0102049-正向引物:5′-CCATTCCTGTTTCACCAACA -3′。hsa_circ_0102049-反向引物:5′-TGAGA-CCTTGAGGCGTTTTT-3′。miR-96-5p-正向引物: 5′-GCGTTTGGCACTAGCACATT-3′。miR-96-5p-反向引物: 5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。AK3-正向引物: 5′-GGCAGAAGCCCTAGATAGAGC-3′。AK3-反向引物: 5′-GCAGTAAGGCGTTGTTTAATGAC-3′。GAPDH-正向引物: 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′。GAPDH-反向引物: 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

8.蛋白免疫印跡：細胞轉(zhuǎn)染48h后消化收集，使用含1%PMSF的RIPA細胞裂解液提取總蛋白并使用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定和配平，配置10%的SDS-page，按照每組蛋白20μg進行上樣電泳及轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后置于5%的脫脂牛奶中室溫封閉2h，將膜裁剪至合適大小置于一抗中4℃孵育過夜，隨后在相應(yīng)二抗中室溫孵育1h并使用ECL發(fā)光試劑盒檢測各蛋白表達量變化，使用GAPDH作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1.hsa_circ_0102049在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中表達量比較：通過對GEO數(shù)據(jù)庫中GSE126094數(shù)據(jù)集的分析，以logFC>2或<-2以及P<0.05為條件共篩選出245個差異表達的circRNA，其中包括8個高表達的circRNA和237個低表達的circRNA，選取|logFC|>3的circRNA繪制表達熱圖，詳見圖1。由于hsa_circ_0102049是所有circRNA中表達最高且表達差異最大的(logFC=6.44344，P=1.07×10-10)，因此后續(xù)研究選取了hsa_circ_0102049作為研究指標并探尋了hsa_circ_0102049對CRC細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。

圖1 hsa_circ_0102049在結(jié)直腸癌和癌旁組織中表達熱圖

2.敲低hsa_circ_0102049后CRC細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力比較：在HCT116和DLD-1細胞系中敲低hsa_circ_0102049后(P<0.05，圖2A)，兩株細胞的增殖能力減弱(P<0.05，圖2B)且遷移和侵襲能力降低(P<0.05，圖3)。結(jié)果表明hsa_circ_0102049可以促進CRC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

圖2 敲低hsa_circ_0102049抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖

圖3 敲低hsa_circ_0102049抑制結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲

3.敲低hsa_circ_0102049后CRC細胞中EMT標志物表達量比較：在HCT116和DLD-1細胞系中敲低hsa_circ_0102049后，兩株細胞中EMT相關(guān)標志物E-cadherin的表達量升高，而N-cadherin和Vimentin的表達量降低(P<0.05，圖4)。結(jié)果表明hsa_circ_0102049通過增強EMT促進CRC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

圖4 敲低hsa_circ_0102049抑制結(jié)直腸癌細胞的EMT

4.hsa_circ_0102049的下游分子檢測：通過miRanda和Targetscan數(shù)據(jù)庫分析可以與hsa_circ_0102049結(jié)合的miRNA以探尋hsa_circ_0102049介導(dǎo)EMT變化的機制，篩選出評分較高的miR-96-5p(圖5A)，隨后使用Targetscan預(yù)測miR-96-5p的mRNA靶標，其中AK3評分最高且AK3已被證實與CRC的發(fā)生有關(guān)(圖5B)[12]。在HCT116和DLD-1細胞系中敲低hsa_circ_0102049后，miR-96-5p的表達量升高而AK3的表達量降低(P<0.05，圖5C)。結(jié)果顯示，hsa_circ_0102049通過miR-96-5p/AK3軸促進CRC細胞的EMT進展。

圖5 hsa_circ_0102049下游分子檢測

討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn),circRNA由于具有對RNase高度抗性、以組織和發(fā)育階段特異性的方式表達以及存在于各種組織和體液中等特征，使得circRNA 具有更長的半衰期和更強的穩(wěn)定性從而可以作為多種癌癥的診斷或預(yù)測生物學(xué)標志物。例如，血清中circ-FAF1和circ-ELP3的表達水平可以作為乳腺癌診斷的新型潛在生物學(xué)標志物，circ-PVT1和circ-001569的高表達預(yù)示結(jié)直腸癌的不良預(yù)后，在胃癌患者組織和血漿中低表達的hsa_circ_0001811預(yù)示著更好的預(yù)后[13～15]。除此以外，circRNA也被確定參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程，例如hsa_circ_0005273通過海綿化miR-200a-3p上調(diào)YAP1表達并抑制Hippo通路促進乳腺癌的腫瘤發(fā)生，circ-0007841通過抑制miR-151-3p活性促進MEX3C的表達加速卵巢癌的發(fā)展[16,17]。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC中高表達的hsa_circ_0102049在功能上通過促進CRC細胞的EMT進程發(fā)揮增強CRC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力的作用。

circRNA作為癌癥發(fā)生、發(fā)展的重要調(diào)控因子，主要通過吸附并降解miRNA以增加miRNA靶基因的表達、結(jié)合并調(diào)控蛋白的功能或表觀遺傳修飾、直接調(diào)節(jié)同源基因的表達等發(fā)揮作用。在結(jié)直腸癌中，hsa_circ_0001666通過miR-576-5p/PCDH10軸抑制結(jié)直腸癌的進展，circ-0006174通過調(diào)節(jié)miR-138-5p/MACC1軸加速結(jié)直腸癌的進展，circ-GALNT16通過增強hnRNPK的SUMO化來增加hnRNPK-P53復(fù)合物的形成以抑制結(jié)直腸癌的進展，circ-SIRT1通過招募和結(jié)合eIF4A3促進結(jié)直腸癌增殖和EMT，hsa_circ_0026628通過靶向同源基因SP1激活Wnt/β-catenin通路促進結(jié)直腸癌的發(fā)展[18～22]。

本研究通過miRanda和Targetscan數(shù)據(jù)庫篩選出與hsa_circ_0102049結(jié)合的miR-96-5p及其下游靶基因AK3，發(fā)現(xiàn)敲低hsa_circ_0102049導(dǎo)致miR-96-5p的表達量升高和AK3表達量降低，表明hsa_circ_0102049通過miR-96-5p/AK3軸促進CRC細胞的EMT進程以增強細胞增殖和轉(zhuǎn)移。AK3為腺苷酸激酶，主要定位于線粒體基質(zhì)中參與腺嘌呤代謝[23]。然而對于AK3在腫瘤中的研究較少，目前已知AK3可以抑制肝癌和乳腺癌的進展和促進慢性淋巴細胞白血病的進程[24～26]。早發(fā)性結(jié)直腸癌患者顯示出具有AK3的雜合性缺失，對于AK3與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展之間的具體聯(lián)系尚需進一步研究[12]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0102049可以通過海綿化miR-96-5p增加AK3的表達，從而促進CRC細胞的EMT進程以增強細胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究較為詳細地描述了hsa_circ_0102049的調(diào)控模式，并且提示hsa_circ_0102049可以作為結(jié)直腸癌潛在的診斷和治療靶標。