徐勝前 王超君 潘德標 葉冠雄 葉海林 秦 勇

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常見惡性疾病之一，每年約有84.1萬例新增HCC患者，死亡約78.2萬例,是全球癌癥相關(guān)死亡的第3大原因，占原發(fā)性肝癌的75%～85%，預(yù)后較差[1,2]。肝細胞肝癌5年生存率大約為53.3%，其發(fā)生率高、侵襲轉(zhuǎn)移力強，明顯影響患者的長期生存[3]。因此，抑制肝癌患者的肝癌細胞轉(zhuǎn)移對于治療肝細胞癌至關(guān)重要。

最近發(fā)現(xiàn)一種屬于NEDD-4樣蛋白家族的E3泛素連接酶，它被稱為WWP2，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[4]。研究報道，WWP2在胃癌組織中高表達，與胃癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)，WWP2通過下調(diào)腫瘤抑制因子(phosphatase and tensin homolog,PTEN)促進胃癌細胞的增殖，這可能為胃癌提供新的潛在治療靶點[5]。此前的研究中發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中，無論是在mRNA水平還是蛋白水平,WWP2都有顯著性表達，敲除細胞中的WWP2會抑制細胞增殖，使細胞停滯在G1期，并誘導(dǎo)細胞凋亡，但具體基因調(diào)控機制尚不清楚[6,7]。因此, 本研究集中研究WWP2沉默在肝癌細胞系黏附、侵襲和遷移的作用機制，期望為WWP2作為肝癌臨床診治輔助標志物提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.細胞培養(yǎng)與穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建：從中國科學(xué)院細胞庫(上海)獲得肝癌細胞株(MHCC97H、LM3、SMCC7721、HepG2、Hep3B、Huh7、BEL-7404)進行此項研究。用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。WWP2shRNA表達載體從基爾頓生物科技有限公司(中國上海)購買。將shRNA序列克隆到慢病毒載體pLVX-AcGFP-C1中。把scramble shRNA克隆到的pLVX-AcGFP-C1慢病毒載體中，作為陰性對照(shNC)。依據(jù)說明書用脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen Life Technologies公司)將構(gòu)建物與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，然后進行慢病毒包裝、純化、收集和感染，轉(zhuǎn)染48h后，收集病毒，用來感染BEL-7404 肝癌細胞，每20MOI的病毒加8μg/ml聚凝胺(美國Sigma-Aldrich公司)，感染48h后檢測。

2.實時定量PCR：用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取7種肝癌細胞的總RNA，于-80℃儲存。用cDNA合成試劑盒合成互補DNA(美國Thermo Fisher Scientific公司)。使用標準的SYBR Green PCR試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行實時熒光定量PCR。實時定量PCR檢測基因的表達水平。所用的引物序列如下：WWP2，上游引物：5′-GAGATGGACAACGAGAAG-3′ ，下游引物：5′-CTCCTCAATGGCATACAG-3′；GAPDH，上游引物：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游引物：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′；相對定量是通過不同基因的信號與GAPDH信號比較得出。該實驗重復(fù)3次。

3.體外增殖實驗：細胞增殖實驗是通過細胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8，日本Dojindo公司)評估測定。將細胞按照5×103個的初始密度種于96孔板中，隨后用pLVX-AcGFP-C1-WWP2shRNA (shWWP2)感染細胞過夜。在指定的時間點，每孔加入10μl 的CCK-8溶液，之后細胞再孵育1h。用酶標儀(美國Bio-Rad公司)在450nm測定細胞增殖情況。該實驗重復(fù)3次。

4.體外細胞凋亡實驗：流式細胞儀(美國碧迪生物科技公司)檢測細胞凋亡，異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)的雙染法，按照廠家的說明使用。細胞接種于6孔板中，用shWWP2感染細胞72h。72h之后收集細胞，再用FITC和PI孵育后，采用流式細胞儀檢測分析結(jié)果。該實驗重復(fù)3次。

5.體外黏附實驗：細胞經(jīng)shWWP2處理后，按照每孔1×105個細胞的密度，接種于纖維連接蛋白包被的12孔板中，孵育1h。棄上清液和細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Gibco公司)洗滌2次。用4%多聚甲醛(美國Gibco公司)固定細胞15min后，Giemsa染色(美國Gibco公司)30min。在顯微鏡(日本Olympus公司)下，放大400倍觀察細胞的形態(tài)及細胞計數(shù)。該實驗重復(fù)3次。

6.體外侵襲實驗：按照產(chǎn)品使用說明用Matrigel(美國Becton Dickinson公司)包被Transwell孔(德國Greiner Bio-One公司)，進行入侵實驗的檢測。采用shWWP2處理細胞，血清饑餓12h，然后再用DMEM重懸。用500μl無血清DMEM培養(yǎng)基將1×105個細胞接種于Transwell小孔的上面。小孔下面加入600μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，小孔上面的細胞用 Q-tip去除。用PBS清洗黏附在小孔下面膜表面的細胞，用4%多聚甲醛固定和0.5%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡(日本Olympus公司)下，放大400倍觀察細胞的形態(tài)及細胞計數(shù)。該實驗重復(fù)3次。

7.體外遷移實驗：細胞Transwell遷移實驗根據(jù)前人的研究方法進行[8]。細胞經(jīng)過shWWP2處理后，用胰蛋白酶消化，清洗，用DMEM培養(yǎng)基重懸。將含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入到Transwell小室下面，用無血清的培養(yǎng)基將每孔加入5×104個細胞接種在Transwell小室上面。然后將細胞放置在37℃培養(yǎng)箱孵育24h。濾過的(小室下面)細胞用4%甲醇固定，用0.5% methylrosanilnium氯化物溶液染色30min。小室上面的細胞用 Q-tip去除。在顯微鏡(日本Olympus Corporation公司)下，放大400倍觀察細胞的形態(tài)及細胞計數(shù)。該實驗重復(fù)3次。

8.Western blot法檢測：根據(jù)標準的實驗步驟進行Western blot法檢測分析，首先提取肝癌組織和相應(yīng)的癌旁組織及肝癌細胞系中的總蛋白，然后用BCA蛋白試劑盒(美國Pierce公司)檢測總蛋白的濃度。在10%SDS-PAGE 膠進行蛋白質(zhì)電泳， 轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 1h。PVDF膜先用抗體WWP2、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2、caspase7、caspase8、Bax和GAPDH的抗體4℃孵育過夜，次日，用 HRP 標記的羊抗鼠IgG和 HRP 標記的羊抗兔 IgG 二抗室溫孵育1～2h。ECL 液反應(yīng)，Kodak X線膠片壓片，放入自動洗片機中顯影、定影，最后用圖像軟件進行分析。Bcl-2、Bax 購自美國Santa Cruz公司，GAPDH 購自美國Cell Signaling Technology公司，其他均購自英國Abcam公司。所有使用的一抗都是1∶1000濃度稀釋。

結(jié) 果

1.沉默肝癌細胞系中的WWP2：研究分別在mRNA和蛋白水平上比較了7種肝癌細胞系(MHCC97H、Huh7、BEL-7404、 SMCC7721、LM3、HepG2和Hep3B)中WWP2的基因表達情況，7種肝癌細胞系均出現(xiàn)WWP2的表達，其中BEL-7404細胞和Huh7細胞中WWP2的表達量高于其他5種細胞(P<0.001,圖1)，考慮本實驗選擇的7種肝癌細胞系的不同類別和背景存在基因WWP2的表達差異，故研究選用BEL-7404和Huh7兩種肝癌細胞系來做后續(xù)的實驗。研究檢測了WWP2特異性shRNA的mRNA和蛋白表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BEL-7404細胞和Huh7細胞分別轉(zhuǎn)染shWWP2后，WWP2mRNA的表達與蛋白的表達水平均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,圖2),說明兩種細胞中WWP2蛋白表達的減少與WWP2mRNA的減少是一致的。

圖1 篩選WWP2高表達肝癌細胞株

圖2 肝癌細胞系BEL-7404和Huh7穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞構(gòu)建成功

2.在BEL-7404細胞和Huh7細胞中沉默WWP2會抑制細胞增殖并抑制細胞凋亡：結(jié)果顯示，shWWP2組在 48h和 72h時的A值均低于 shNC組 (0.525±0.011 vs 0.771±0.004,0.586±0.008 vs 1.033±0.009)，BEL-7404細胞和Huh7細胞在轉(zhuǎn)染shWWP2 72h后，細胞的增殖明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,圖3)。此外，流式細胞儀檢測了BEL-7404細胞和Huh7細胞中細胞凋亡率，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染shNC組的細胞比較，BEL-7404細胞和Huh7細胞在轉(zhuǎn)染shWWP2 72h后，細胞凋亡率明顯上升(38.533±0.058 vs 3.533±0.153，P<0.001，圖4)。

圖3 沉默WWP2后可抑制肝癌BEL-7404細胞和Huh7細胞的增殖

圖4 流式細胞術(shù)檢測肝癌BEL-7404細胞和Huh7細胞的凋亡率

3.WWP2沉默會抑制BEL-7404細胞和Huh7細胞的黏附、侵襲及轉(zhuǎn)移：如圖5所示，與shNC組比較，shWWP2大大抑制了BEL-7404細胞和Huh7細胞的細胞黏附能力(P<0.001)，與shNC組比較，shWWP2大大抑制了BEL-7404細胞和Huh7細胞的細胞侵襲能力(P<0.001)，與轉(zhuǎn)染shNC組比較，BEL-7404細胞和Huh7細胞分別轉(zhuǎn)染shWWP2后，侵入過濾膜的的細胞數(shù)目明顯減少(P<0.001,圖6)。在細胞遷移實驗中發(fā)現(xiàn)，BEL-7404細胞和Huh7細胞轉(zhuǎn)染shWWP2后，與轉(zhuǎn)染shNC組比較，其遷徙能力明顯受到抑制(P<0.001,圖7),這些結(jié)果表明，WWP2是參與細胞侵襲、轉(zhuǎn)移及黏附相關(guān)的重要調(diào)節(jié)因素。

圖5 WWP2沉默對肝癌細胞黏附能力的影響(結(jié)晶紫,×400)

圖6 WWP2沉默對肝癌細胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫,×400)

圖7 WWP2沉默對肝癌細胞遷移能力的影響(結(jié)晶紫,×400)

4.WWP2通過內(nèi)在途徑抑制BEL-7404細胞和Huh7細胞凋亡:為了檢測WWP2調(diào)節(jié)BEL-7404細胞和Huh7細胞凋亡的分子機制，用Western blot法檢測caspase7、caspase8、Bax及Bcl-2的表達，與轉(zhuǎn)染shNC比較,轉(zhuǎn)染shWWP2后,BEL-7404細胞和Huh7細胞中促凋亡蛋白caspase7、caspase8的蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,表1，表2)，此外，筆者還檢測了抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax的表達，與轉(zhuǎn)染sh-NC比較，轉(zhuǎn)染shWWP2的BEL-7404細胞和Huh7細胞中Bcl-2蛋白水平降低(P<0.01,表1)，Bax表達增加(P<0.01,表1，表2)。以上數(shù)據(jù)表明，WWP2沉默可誘導(dǎo)內(nèi)源性BEL-7404細胞凋亡。

5.沉默WWP2，上調(diào)PTEN的蛋白水平表達，下調(diào)p-Akt的蛋白水平：為了檢測WWP2調(diào)控BEL-7404細胞和Huh7細胞黏附、侵襲及遷移的可能分子機制,用 Western blot 法檢測p-Akt和總Akt的表達，與轉(zhuǎn)染shNC比較，轉(zhuǎn)染shWWP降低了BEL-7404細胞和Huh7細胞中p-Akt的蛋白表達(P<0. 01)、Akt的表達水平不變，上調(diào)了PTEN的表達(P<0.01)，詳見表1、表2。

表1 WWP2沉默在肝癌細胞BEL-7404中基因蛋白表達水平

表2 WWP2沉默在肝癌細胞Huh7中基因蛋白表達水平

討 論

肝癌是導(dǎo)致癌癥死亡的五大主要原因之一[9,10]。肝癌的發(fā)生具有種族和區(qū)域差異性，高發(fā)于發(fā)展中國家，中國每年新增肝癌病例數(shù)占全世界的1/2以上[11]。肝癌早期癥狀不明顯、進展快，確診時多數(shù)已進入中晚期。因此，尋找肝癌特異性的分子靶點，可能會成為對肝癌早期診斷、判斷治療效果、預(yù)后評價等的一種經(jīng)濟而有效的方法。最新研究表明WWP2是一種泛素連接酶，它在小鼠體內(nèi)促進PTEN的降解，考慮到PTEN在腫瘤發(fā)展中的重要作用，WWP2可能是一個在抗癌治療中微調(diào)PTEN水平的潛在靶點[12]。盡管有很多的數(shù)據(jù)表明WWP2對腫瘤的形成存在重要影響，但在肝癌中WWP2的異常表達及潛在作用機制仍不是很清楚，值得進一步研究。

本研究評估了肝癌細胞系中WWP2的表達情況，并發(fā)現(xiàn)WWP2mRNA 和蛋白在BEL-7404細胞系和Huh7細胞系中高表達，且在肝癌BEL-7404細胞和Huh7細胞中沉默WWP2導(dǎo)致WWP2mRNA 和蛋白的表達水平明顯下降,因此，選擇肝癌細胞BEL-7404和Huh7作為后續(xù)研究對象。WWP2能夠調(diào)控細胞的凋亡并且在細胞的腫瘤形成中具有重要作用[13]。細胞凋亡相關(guān)蛋白 Bax 和 Bcl-2則分別發(fā)揮促凋亡和抗凋亡作用，被稱為“線粒體凋亡途徑”，caspase 途徑和線粒體途徑共同參與調(diào)節(jié)細胞的凋亡[14]。本研究結(jié)果提示，在肝癌BEL-7404細胞系和Huh7細胞系中沉默WWP2會導(dǎo)致細胞增殖明顯下降，細胞凋亡增加，蛋白印跡實驗發(fā)現(xiàn)caspase7、caspase8活性增強、促凋亡蛋白Bax 表達上升，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達下降，說明WWP2可能通過內(nèi)源性凋亡途徑促進腫瘤細胞增殖，減少腫瘤細胞凋亡。

入侵和遷移通常是腫瘤晚期的表現(xiàn)，而復(fù)發(fā)多提示患者預(yù)后不良，因此，控制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移將有助于患者預(yù)后的改善[15]。在正常培養(yǎng)的BEL-7404細胞和Huh7細胞中，WWP2顯著性表達，然而，使WWP2沉默后，細胞黏附、侵襲及轉(zhuǎn)移活性與對照組比較，明顯受到抑制，已知PTEN是一種腫瘤抑制基因，在許多腫瘤中表達缺失，具有雙重特異性磷酸酶活性[16]。研究已證實PTEN表達減少誘導(dǎo)了Akt磷酸化，使PI3K/Akt/mTOR通路處于激活狀態(tài)，抑制肝癌細胞的生長、遷移和侵襲[17,18]。研究表明，WWP2在不同類型腫瘤的發(fā)病機制中起重要作用,WWP2在多種腫瘤中表達失調(diào)，主要通過PTEN/Akt信號途徑促進腫瘤的發(fā)生[19]。為了進一步闡明WWP2與PTEN/Akt信號通路之間關(guān)系，筆者研究了轉(zhuǎn)染shWWP2后，PTEN/p-Akt在肝癌細胞BEL-7404和Huh7細胞中的表達情況，結(jié)果證實WWP2沉默后降低了p-Akt的蛋白水平，并增加PTEN 的表達，表明WWP2可能通過調(diào)節(jié)PTEN/p-Akt信號通路調(diào)節(jié)肝癌細胞黏附、侵襲及轉(zhuǎn)移，促進腫瘤細胞存活，與Fang等[20]的研究結(jié)論一致。

綜上所述，筆者研究證實沉默WWP2可抑制肝癌BEL-7404細胞和Huh7細胞增殖、黏附、侵襲和遷移，并促進細胞凋亡，其作用機制可能通過上調(diào)PTEN、下調(diào)p-Akt的表達來完成。然而，其具體的機制還需要體內(nèi)實驗研究來進一步闡述。總之，WWP2及其相關(guān)的分子可能成為治療肝癌的一個潛在靶標。