徐彥楠 趙 青 趙俊霞 周娜靜 高 品 周晨明

胃癌全世界范圍內(nèi)發(fā)生率最高的癌癥之一，多數(shù)患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)已處于中晚期，5年相對生存率僅為20%左右[1]。目前臨床上采取的放療、化療手段是治療惡性腫瘤的有效方法，但是化療藥物的效能會因一系列的不良反應(yīng)而受限，故尋找或合成更為安全有效的抗腫瘤藥物依然是擺在醫(yī)藥工作者面前的迫切任務(wù)[2]。近年來研究表明，一些來自動植物的提取物能影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)信號通路而表現(xiàn)出抗腫瘤作用，且毒性不良反應(yīng)較小，因而備受醫(yī)藥工作者的關(guān)注[3]。異牛肝菌素(iso-suillin)是從褐環(huán)粘蓋牛肝菌(suillus luteus)子實(shí)體中分離純化得到的一種化合物，具有較強(qiáng)的生物活性，能夠有效的抑制KB細(xì)胞、P-388細(xì)胞、NSCLC-N6等腫瘤細(xì)胞系的生長，且對正常人的淋巴細(xì)胞無明顯毒性[4,5]。目前有關(guān)iso-suillin作用于癌癥細(xì)胞的相關(guān)研究主要集中在人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞和人慢性髓系白血病K562細(xì)胞等，有關(guān)iso-suillin對人胃癌BGC-823細(xì)胞的作用及分子機(jī)制國內(nèi)外報(bào)道較少。鑒于此，本研究選取iso-suillin，探究其對人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以期為iso-suillin成為一種潛在的抗腫瘤藥物提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

材料與方法

1.材料：人胃癌BGC-823細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)。iso-suillin由河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，濃度≥98%，實(shí)驗(yàn)前用完全培養(yǎng)液稀釋為3種濃度，即12.5、25.0和50.0μg/ml。DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，青霉素和鏈霉素購自上海依赫生物科技有限公司，碘化丙啶(PI)染色液(含Rnase)購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，RIPA裂解液購自上海貝博生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司，Hoechst 33342檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，兔抗人p21、p53單克隆抗體、兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)抗體、兔抗人CDK4單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，內(nèi)參照兔β-actin多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

2.儀器：流式細(xì)胞儀(型號：AccuriC6，美國BD公司)；全自動酶標(biāo)儀(型號：ELX900，美國Bio-Tek公司)；熒光倒置顯微鏡(型號：BX51，日本Olympus公司)；雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(型號：Odyssey，美國LI-COR公司)。

3.細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代：以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)含10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，置飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)至80%～90%密度時，傾去培養(yǎng)液，用3ml PBS洗滌細(xì)胞2次，加入5ml 0.04% EDTA消化液，混勻后吸去胰酶溶液，37℃放置5min，再加入2ml含10% FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)至80%～90%密度待用。

4.CCK-8法測定細(xì)胞增殖：取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整胞懸液內(nèi)細(xì)胞濃度至1×105個/毫升，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl，每組設(shè)置6個復(fù)孔。將接種好的培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)組分別加入12.5、25.0、50.0μg/ml iso-suillin處理，對照組以等量0.9%NaCl注射液處理，72h后傾去培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)基100μl，每孔避光加入20μl CCK-8試劑，避光培養(yǎng)1.5h后，用酶標(biāo)儀測450nm波長處96孔板上各孔吸光度(A)值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值)×100%。

5.流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測細(xì)胞周期分布：取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整胞懸液內(nèi)細(xì)胞濃度至1×105個/毫升，接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后實(shí)驗(yàn)組分別加入12.5、25.0、50.0μg/ml iso-suillin處理，對照組以等量0.9%NaCl注射液處理，繼續(xù)培養(yǎng)，72h后傾去培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗滌2次，預(yù)冷75%乙醇于4℃固定過夜，離心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，加入500μl 50μg/ml的PI染色工作液(含Rnase)，4℃避光孵育0.5h，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，F(xiàn)lowjo7.6.5軟件分析計(jì)算G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞分布。

6.Western blot法檢測p21、p53、cyclinD1、CDK4蛋白表達(dá)：培養(yǎng)72h后，傾去培養(yǎng)液，終止培養(yǎng)并收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入200μl預(yù)冷的RIPA裂解液，4℃裂解60min，提取各組細(xì)胞總蛋白，將蛋白質(zhì)溶液與等量上樣緩沖液混合，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉3h，分別加入(1∶800)兔抗人p21、p53單克隆抗體、cyclinD1抗體、CDK4單克隆抗體，4℃過夜，TBS漂洗1次，采用二抗(1∶2000羊抗兔HRP)標(biāo)記，37℃溫育2h，TBS漂洗3次，在NC膜上滴加混合好的化學(xué)發(fā)光液，室溫孵育3min，把NC膜放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行發(fā)光、照相，測定各蛋白條帶的積分吸光度值(IA)，以p21、p53、cyclinD1、CDK4蛋白條帶的IA與相對應(yīng)的β-actin條帶IA的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

7.Hoechst 33342熒光染色觀察細(xì)胞凋亡：干預(yù)72h后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min，去固定液，用PBS洗滌3min，洗2次，吸盡液體，加Hoechst染色液，室溫染色10min后吸盡染液，用PBS洗滌3min，洗2次，每孔加入適量的熒光淬滅劑，于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照，細(xì)胞核明顯濃縮為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量×100%。

結(jié) 果

1.各組細(xì)胞增殖抑制率比較：各干預(yù)組細(xì)胞A值、細(xì)胞增殖抑制率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨時間延長，12.5μg/ml劑量組、25.0μg/ml劑量組和50.0μg/ml劑量組A值均減小，細(xì)胞增殖抑制率均升高(P<0.05)；隨時間延長，對照組A值增大(P<0.05)；與對照組比較，12.5μg/ml劑量組、25.0μg/ml劑量組和50.0μg/ml劑量組不同時刻的A值更小，細(xì)胞增殖抑制率更高，且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)(P<0.05)，詳見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較

2.各組細(xì)胞周期分布比較：干預(yù)72h后，各組細(xì)胞G0/G1期、S期比例組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，12.5μg/ml劑量組、25.0μg/ml劑量組和50.0μg/ml劑量組G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，并且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)(P<0.05)，詳見表2、圖1。

表2 各組細(xì)胞周期分布比較

3.各組p21、p53、cyclinD1、CDK4蛋白相對表達(dá)量比較：干預(yù)72h后，各組p21、p53、cyclinD1、CDK4蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，12.5μg/ml劑量組、25.0μg/ml劑量組和50.0μg/ml劑量組p21、p53蛋白相對表達(dá)量更高，cyclinD1、CDK4蛋白相對表達(dá)量更低，且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)(P<0.05)，詳見圖2、圖3。

圖2 各組p21、p53、cyclinD1、CDK4蛋白相對表達(dá)量

圖3 各組p21、p53、cyclinD1、CDK4蛋白相對表達(dá)量比較

4.各組細(xì)胞凋亡比較：Hoechst 33342熒光染色顯示，隨著iso-suillin濃度增加，亮藍(lán)色細(xì)胞越來越多，染色質(zhì)凝聚，并有凋亡小體出現(xiàn)，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變(圖4)。對照組與12.5μg/ml劑量組、25.0μg/ml劑量組、50.0μg/ml劑量組細(xì)胞凋亡率分別為6.51%±0.86%，19.41%±2.28%，48.76%±1.52%，65.84%±2.69%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，12.5μg/ml劑量組、25.0μg/ml劑量組、50.0μg/ml劑量組細(xì)胞凋亡率升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

圖4 Hoechst 33342熒光染色觀察iso-suillin誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況(×200)

討 論

GLOBOCAN最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年全球胃癌新發(fā)病例約103.3萬例，死亡病例約78.3萬例，其發(fā)生率和病死率分別位于惡性腫瘤第5位和第2位[6]。我國是胃癌高發(fā)國，發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45.0%[7]。因此胃癌的防治工作仍任重道遠(yuǎn)。目前臨床上治療癌癥主要采取放、化療的方式，但與此同時會產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，30%～80%的癌癥患者對化療藥物產(chǎn)生了耐藥性[8]。因此，尋找安全有效的抗腫瘤藥物成為攻克腫瘤的熱點(diǎn)研究課題。

胃癌細(xì)胞的特征主要是細(xì)胞增殖失控與凋亡受阻，細(xì)胞凋亡通過處理受損或衰老的細(xì)胞來維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)，是維持機(jī)體正常生命活動必不可少的程序[9]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其生長是目前多數(shù)抗腫瘤藥物的主要作用機(jī)制[10]。iso-suillin在體外對多種腫瘤細(xì)胞系表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可強(qiáng)烈誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖抑制效果甚至優(yōu)于順鉑，且毒性不良反應(yīng)較低[11]。Wang等[12]研究顯示，iso-suillin可通過線粒體途徑和死亡受體途徑相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)對K562細(xì)胞的增殖抑制作用，可作為一種抗白血病潛在治療方法。最新研究發(fā)現(xiàn)，iso-suillin可將人肺癌A549細(xì)胞周期阻滯于G1期，有效抑制其增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與p53蛋白磷酸化有關(guān)，此外該研究還粗略檢查了大鼠體質(zhì)量變化和一些重要器官的毒性，未發(fā)現(xiàn)iso-suillin的顯著毒性不良反應(yīng)[13]。體外和體內(nèi)抗腫瘤作用表明，iso-suillin可作為腫瘤生長抑制劑。

為探究iso-suillin對胃癌細(xì)胞是否具有同樣的增殖抑制作用，本研究將其作用于人胃癌BGC-823細(xì)胞中，并檢測iso-suillin對人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，隨作用時間延長及給藥濃度的提高，iso-suillin對細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，且呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性。進(jìn)一步對細(xì)胞周期分布情況進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，12.5μg/ml劑量組、25.0μg/ml劑量組和50.0μg/ml劑量組細(xì)胞G0/G1期的比例及凋亡率均升高，而S期比例降低，可見iso-suillin可使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，抑制其增殖，并促進(jìn)其凋亡。對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，12.5μg/ml劑量組、25.0μg/ml劑量組和50.0μg/ml劑量組p21、p53蛋白相對表達(dá)量更高，cyclinD1、CDK4蛋白相對表達(dá)量更低，且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。p53基因是一種抑癌基因，可通過抑制細(xì)胞的增殖參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，而p21是目前已知具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白，是p53基因最重要的下游基因之一，其表達(dá)產(chǎn)物p21蛋白可以通過依賴或不依賴p53途徑發(fā)揮細(xì)胞周期阻滯、抑制DNA復(fù)制、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等功能[14,15]。

cyclinD1是一種作用于G1期的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，對腫瘤形成有直接作用，其過度表達(dá)可導(dǎo)致G1期縮短，加速細(xì)胞進(jìn)入S期，進(jìn)而造成細(xì)胞分裂、增殖速度加快，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變[16]。有研究顯示CDK4在胃癌細(xì)胞中有明顯的擴(kuò)增或異常表達(dá)，可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展[17]。在本研究中，隨iso-suillin劑量增加，p21、p53蛋白相對表達(dá)量隨之增高，而cyclinD1、CDK4蛋白相對表達(dá)量隨之降低。p21蛋白通過直接結(jié)合cyclin-CDK復(fù)合物而抑制其活性，阻礙Rb蛋白磷酸化進(jìn)程，無法釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子家族，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期，影響DNA復(fù)制[18]。由此可見，iso-suillin通過上調(diào)p21、p53蛋白，下調(diào)cyclinD1和CDK4蛋白相對表達(dá)量發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，對細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著iso-suillin濃度的增加，被染成亮藍(lán)色的細(xì)胞越來越多，染色質(zhì)凝聚，并有凋亡小體出現(xiàn)，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，再次表明iso-suillin可促進(jìn)人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡。

綜上所述，iso-suillin可上調(diào)人胃癌BGC-823細(xì)胞p21、p53蛋白表達(dá)和下調(diào)cyclinD1、CDK4蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，但是否還存在其他的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。