陳 浩 朱孫煒 王重鈺 陳嘉宜 翟 暉 胡偉玲 吳仲敏 倪桂蓮

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是個(gè)體經(jīng)歷創(chuàng)傷事件后出現(xiàn)的一種以闖入性創(chuàng)傷情感記憶、高警覺性和回避為主要臨床表現(xiàn)的精神障礙[1]。海馬是PTSD病生機(jī)制的關(guān)鍵腦區(qū)，PTSD患者海馬體積縮小，功能紊亂，海馬神經(jīng)元出現(xiàn)過度自噬和凋亡現(xiàn)象[2～4]；同時(shí)伴隨mTOR信號(hào)通路信號(hào)分子活性改變[5]。但確切的機(jī)制尚不明確。當(dāng)前臨床抗PTSD藥物起效慢、有效率低、不良反應(yīng)多，迫切需要研發(fā)低毒高效的防治PTSD 藥物[6]。烏靈菌粉(xylaria nigripes，XN)是真菌烏靈參經(jīng)現(xiàn)代技術(shù)加工制成的純中藥制劑，具有調(diào)節(jié)抑郁、焦慮及神經(jīng)官能癥等作用，且不良反應(yīng)少，但XN 對(duì)PTSD 樣行為有無調(diào)節(jié)作用鮮見報(bào)道[7]。本實(shí)驗(yàn)通過制備PTSD大鼠模型，觀察XN對(duì)PTSD大鼠行為學(xué)和海馬神經(jīng)元自噬與凋亡的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，為中醫(yī)藥防治PTSD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1．動(dòng)物與耗材、試劑： SPF級(jí)SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量為180～220g，由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物合格證編號(hào)為20210421Aazz0619999987, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2021-0013。兔抗Beclin1、LC3B、caspase3、mTOR、p-mTOR 抗體購(gòu)自愛博泰克生物技術(shù)公司；免疫印跡、反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；XN購(gòu)自浙江佐力藥業(yè)股份有限公司；動(dòng)物行為學(xué)設(shè)備購(gòu)自上海吉量軟件有限公司。

2.動(dòng)物分組和疾病模型構(gòu)建：實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、PTSD 組和XN組，每組30只。采用單一連續(xù)應(yīng)激聯(lián)合足底電刺激方法構(gòu)建PTSD大鼠模型，即2h束縛禁錮，持續(xù)20min強(qiáng)迫游泳，乙醚麻醉至昏迷，待大鼠自然蘇醒，30min后，置于電擊箱中，給予15個(gè)循環(huán)的足底電擊，每次電擊參數(shù)為：電流強(qiáng)度 0.8mA， 電擊時(shí)間 10s，間歇時(shí)間10s。電擊結(jié)束后大鼠放回原環(huán)境飼養(yǎng)。造模結(jié)束后，XN組大鼠灌服XN(0.8g/kg，溶于0.9%NaCl注射液)，對(duì)照組及PTSD組灌服等體積0.9%NaCl注射液，每天1次，每次灌胃容積為 5ml/kg，分別在連續(xù)灌服的第7天和第14天時(shí)檢測(cè)干預(yù)效果。

3.行為學(xué)評(píng)估干預(yù)效果：(1)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)用來評(píng)價(jià)大鼠自主探索能力。曠場(chǎng)箱的底面由4個(gè)中央格和12 個(gè)外周格組成。測(cè)試時(shí)將大鼠放置于中央格位置，攝像頭自動(dòng)記錄大鼠在曠場(chǎng)箱內(nèi)5min的運(yùn)動(dòng)總距離、直立總次數(shù)、進(jìn)入中央格次數(shù)。(2)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)用來評(píng)估大鼠焦慮程度。實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠在迷宮內(nèi)可以自由活動(dòng)，從大鼠四爪均進(jìn)入開臂時(shí)開始計(jì)時(shí)，記錄5min內(nèi)進(jìn)入開臂時(shí)間百分比和進(jìn)入開臂次數(shù)百分比，計(jì)算焦慮指數(shù)，焦慮指數(shù)=1-[1/2(開臂時(shí)間/總時(shí)間)+1/2(進(jìn)入開臂的次數(shù)/總的探索次數(shù))]。(3)僵立實(shí)驗(yàn)：僵立行為為大鼠表達(dá)恐懼情緒的一種方式。測(cè)試時(shí)大鼠放置在原造模電擊箱中，不通電流,間隔10s測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)試4min，出現(xiàn)僵立行為者為陽性，用木僵率表示，木僵率(%)=僵立行為陽性次數(shù)/總次數(shù)×100%。

4.海馬組織Tunel染色：行為學(xué)檢測(cè)后各組大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉，左心室插管，4%多聚甲醛灌注內(nèi)固定，取腦，選擇海馬區(qū)域進(jìn)行冠狀位石蠟包埋切片，片厚5μm，按照Tunel染色試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞(細(xì)胞核呈棕色)數(shù)量，計(jì)算5個(gè)高倍視野下凋亡細(xì)胞的平均值。

5.海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3免疫熒光染色：取上述切片4套，依次經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，檸檬酸鈉抗原修復(fù)，山羊血清封閉后，其中3套切片分別滴加兔抗Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3(1∶800)Ⅰ抗，4℃孵育過夜，PBS液漂洗3次；切片入FITC熒光Ⅱ抗(1∶300)室溫避光孵育2h，PBS液漂洗3次；DAPI復(fù)染，PBS液漂洗3次，PBS甘油封片；熒光顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)Beclin1、LC3Ⅱ和caspase3標(biāo)記陽性神經(jīng)元。第4套切片不加Ⅰ抗，用于陰性對(duì)照。

6．海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3、mTOR和p-mTOR蛋白水平檢測(cè)： 大鼠斷頭取新鮮海馬組織，稱重，取50mg 海馬組織加入適量的RIPA裂解液，勻漿后，離心10min，收集上清液，BCA 試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，依次上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2h，加入目標(biāo)蛋白Ⅰ抗(1∶1500)或GAPDH Ⅰ抗(1∶1500)，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入Ⅱ抗(1∶3000)，室溫孵育2h，TBST漂洗，ECL顯色。采用Image圖像軟件分析蛋白質(zhì)條帶灰度值，計(jì)算各組大鼠目的蛋白Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3相對(duì)表達(dá)量，即目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)含量。

7.海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3、mTOR mRNA水平檢測(cè):采用Trizol方法抽取大鼠海馬組織總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA后按熒光定量 PCR 試劑盒操作說明進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各基因及其內(nèi)參的擴(kuò)增引物序列詳見表1。

表1 引物序列

結(jié) 果

1.行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較：(1)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組比較，PTSD 組大鼠在曠場(chǎng)箱5min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)總路程、直立總次數(shù)和進(jìn)入中央格次數(shù)均顯著減少(P均<0.01)；與PTSD 組比較，XN組大鼠曠場(chǎng)箱內(nèi)各指標(biāo)值均有顯著增加(P均<0.01),詳見表2。(2)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組比較，PTSD 組大鼠在高架十字迷宮內(nèi)進(jìn)入開臂次數(shù)和時(shí)間百分比均顯著減少(P均<0.01)，而焦慮指數(shù)顯著增加(P均<0.01)，與PTSD 組比較，XN組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)和時(shí)間百分比均顯著增加，焦慮指數(shù)顯著降低(P均<0.01)，詳見表3。(3)僵立行為實(shí)驗(yàn)：PTSD 組大鼠在原電擊箱內(nèi)刻板的蹲伏姿勢(shì)增多，警覺性增強(qiáng)，木僵率較對(duì)照組顯著上升(P<0.01)；XN組大鼠刻板的蹲伏動(dòng)作減少，木僵率顯著降低(P<0.01)，詳見表4。

表2 大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表3 大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表4 大鼠僵立實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.海馬組織Tunel染色結(jié)果：Tunel陽性神經(jīng)元的細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，實(shí)驗(yàn)第7天和第14天時(shí)PTSD組大鼠海馬組織內(nèi)Tunel陽性神經(jīng)元的數(shù)量均顯著高于對(duì)照組(P均<0.01)，XN組則明顯低于同時(shí)段PTSD組(P<0.01)，詳見圖1。

圖1 海馬CA1區(qū)Tunel陽性神經(jīng)元的分布和數(shù)量(Tunel染色，標(biāo)尺=50μm，n=5)

3.海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3熒光標(biāo)記陽性神經(jīng)元：與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)第7天和第14天時(shí)PTSD組大鼠海馬組織內(nèi)Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3陽性神經(jīng)元均顯著增多(P均<0.05)，XN組上述陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著少于PTSD組(P<0.05)，但略多于對(duì)照組，詳見圖2。

圖2 海馬CA1區(qū)Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3標(biāo)記陽性神經(jīng)元(免疫熒光，標(biāo)尺=50μm，n=5)

4.海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3、mTOR和p-mTOR蛋白水平：PTSD組大鼠海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3和mTOR蛋白水平均顯著高于對(duì)照組，p-mTOR蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；XN組大鼠海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3和mTOR蛋白水平均顯著低于PTSD組(P<0.01)，p-mTOR蛋白水平顯著高于PTSD組(P<0.01)，詳見圖3。

圖3 海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3、mTOR、p-mTOR蛋白水平和p-mTOR/mTOR比值比較

5.海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3和mTOR mRNA水平：實(shí)驗(yàn)第7天和第14天時(shí)PTSD組大鼠海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3和mTOR mRNA水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)；XN組大鼠海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3、mTOR mRNA水平顯著低于同時(shí)段PTSD組(P<0.01)，詳見圖4。

圖4 海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ、caspase3、mTOR mRNA水平

討 論

XN是從珍稀藥用真菌烏靈參中分離獲得的菌種粉末，屬純中藥制劑，現(xiàn)代研究表明，XN具有鎮(zhèn)靜催眠、改善認(rèn)知、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、抗抑郁、改善聽覺、抗輻射等作用，臨床主要用于治療失眠以及各種疾病伴隨的焦慮、抑郁癥狀[8]。但XN對(duì)PTSD行為有無調(diào)節(jié)作用，文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用單一連續(xù)應(yīng)激聯(lián)合足底電刺激方法構(gòu)建PTSD動(dòng)物模型，在造模后的第7天和第14天采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮和僵立行為實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠行為學(xué)變化，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PTSD組大鼠在曠場(chǎng)箱內(nèi)運(yùn)動(dòng)總距離、直立總次數(shù)和進(jìn)入中央格次數(shù)明顯低于對(duì)照組，XN組大鼠上述指標(biāo)均高于PTSD組，提示XN具有提高大鼠探索行為能力作用[9]；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中PTSD組大鼠在開放臂內(nèi)停留時(shí)間及進(jìn)入開放臂次數(shù)等指標(biāo)顯著低于對(duì)照組，表明造模結(jié)束后大鼠出現(xiàn)了焦慮行為，大鼠回避面對(duì)空曠的開放臂，為PTSD大鼠的核心癥狀之一。XN組與PTSD組比較指標(biāo)升高，說明XN具有減緩PTSD大鼠焦慮行為效應(yīng)；僵立行為是大鼠重現(xiàn)于原應(yīng)激環(huán)境時(shí)，出現(xiàn)過度警覺和刻板的木僵行為，實(shí)驗(yàn)中PTSD組大鼠僵立行為次數(shù)顯著多于對(duì)照組，而XN組明顯少于PTSD組，說明XN能夠減輕PTSD大鼠的恐懼癥狀。上述行為學(xué)測(cè)試結(jié)果表明XN對(duì)大鼠PTSD樣行為有明顯調(diào)節(jié)效果。

PTSD的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，研究認(rèn)為，PTSD的發(fā)生與海馬神經(jīng)元程序性死亡如凋亡與自噬密切相關(guān)[10,11]。LC3Ⅱ是檢測(cè)自噬的分子指標(biāo)，其表達(dá)水平在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性，Beclin1是細(xì)胞自噬的特異性標(biāo)志物，不僅能促進(jìn)細(xì)胞自噬，還參與細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)[12,13]。袁楊等[14]研究發(fā)現(xiàn)PTSD大鼠海馬組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA均有明顯變化，隋竹欣等[15]研究發(fā)現(xiàn)PTSD大鼠應(yīng)激后海馬神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的細(xì)胞自噬。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTSD大鼠海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA表達(dá)異常升高，和上述研究結(jié)果相吻合。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，XN能明顯降低海馬組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA的表達(dá)，對(duì)PTSD大鼠海馬自噬有顯著改善作用。caspase3是caspase家族中最重要的核心酶，是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[16]。本研究顯示，PTSD組大鼠海馬組織caspase3陽性神經(jīng)元顯著增多，caspase3蛋白及mRNA 的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，而XN組大鼠caspase3 陽性神經(jīng)元減少，caspase3 蛋白及mTOR的表達(dá)則顯著降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明XN可能通過抑制caspase3的過度激活和表達(dá)而修復(fù)PTSD受損的海馬神經(jīng)元。

大量實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，mTOR信號(hào)通路在介導(dǎo)海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)、增殖、分化的生命活動(dòng)進(jìn)程中起重要作用，該通路的關(guān)鍵分子mTOR是一個(gè)重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在進(jìn)化上非常保守，mTOR分子的激活，將導(dǎo)致下游幾個(gè)靶點(diǎn)的磷酸化，對(duì)細(xì)胞自噬和凋亡起著負(fù)調(diào)控作用[17,18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTSD組大鼠海馬組織mTOR蛋白磷酸化水平較對(duì)照組明顯降低，而XN組則顯著高于PTSD組，筆者推測(cè)XN可能是通過激活mTOR分子磷酸化，抑制海馬神經(jīng)元過度凋亡和自噬，進(jìn)而調(diào)節(jié)PTSD樣行為。

綜上所述，PTSD大鼠出現(xiàn)探索行為能力下降及焦慮恐懼水平升高，同時(shí)出現(xiàn)海馬神經(jīng)元自噬和凋亡增強(qiáng)，mTOR蛋白磷酸化水平降低。XN有效改善PTSD大鼠行為學(xué)改變，其機(jī)制可能與激活海馬mTOR蛋白磷酸化，調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元自噬及凋亡相關(guān)聯(lián)，海馬mTOR分子活化后具體通過哪條途徑調(diào)控神經(jīng)元自噬及凋亡，值得深入研究。