黃 銳 周 源 賀 清 白 楊 周禮平

糖尿病性心肌病是糖尿病患者的并發(fā)癥之一，其特征包括心室擴張、心肌纖維化、心臟肥大等心肌結(jié)構(gòu)改變[1]。糖尿病性心肌病的發(fā)生可能與心肌細(xì)胞的凋亡、炎癥、代謝、氧化應(yīng)激等相關(guān)，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因[2]。然而，糖尿病性心肌病的發(fā)病機制尚不清楚，確定糖尿病性心肌病的病理生理機制和潛在的治療靶點是其防治研究的重要方向。心肌細(xì)胞凋亡和功能下降是糖尿病心肌病形成的重要機制，阻斷心肌細(xì)胞凋亡并促進其活力對治療糖尿病心肌病具有重要臨床意義[3～5]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類RNA轉(zhuǎn)錄本，長度大于200個核苷酸[6]。雖然lncRNA沒有蛋白質(zhì)編碼功能，但其能夠通過多種作用機制調(diào)控特定基因的表達(dá)和定位，在細(xì)胞的生理和病理過程發(fā)揮顯著的生物學(xué)功能[7～9]。lncRNA與糖尿病及其并發(fā)癥的是糖尿病研究領(lǐng)域的熱點[10]。RP11-1C8.5是一個尚未被報道研究的lncRNA，其基因含有一個外顯子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度為4597個核苷酸。本研究通過檢測不同高糖濃度培養(yǎng)下的心肌HCM細(xì)胞中RP11-1C8.5的表達(dá)，旨在觀察RP11-1C8.5與高糖濃度的相關(guān)性，通過感染RP11-1C8.5干擾腺病毒，探討敲減RP11-1C8.5對心肌細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)控及可能的作用機制。

材料與方法

1.細(xì)胞系與主要試劑:人心肌細(xì)胞系HCM購自美國ATCC公司。胎牛血清和心肌細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。RP11-1C8.5干擾腺病毒(干擾序列為ATGGCATTTACAGAATAACAAAT，結(jié)合位點為175～197)和對照重組腺病毒購自北京索萊寶科技有限公司。LipofectamineTM3000、CCK-8試劑盒購自美國Invitrogen公司。細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。miR-181a-5p mimic和NC mimic購自廣州銳博生物科技有限公司。RP11-1C8.5野生型和突變型雙熒光素酶報告基因pGL3質(zhì)粒購自上海和元生物技術(shù)股份公司。一抗Bax、caspase3、Bcl-2、CED-9、GAPDH購自美國Millipore公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和感染:在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，心肌細(xì)胞系HCM培養(yǎng)在含10%胎牛血清的心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中，使用5.5、10.0、13.9、22.2、33.3mmol/L葡萄糖孵育處理24h，qPCR檢測RP11-1C8.5的表達(dá)水平。在33.3mmol/L葡萄糖培養(yǎng)的HCM細(xì)胞融合度為80%時，將RP11-1C8.5干擾腺病毒和對照重組腺病毒感染心肌細(xì)胞，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)32h，進行后續(xù)實驗。

3.qPCR檢測:采用TRIzol法從人心肌HCM細(xì)胞中提取總RNA，加入反轉(zhuǎn)錄試劑進行反轉(zhuǎn)錄，合成后的cDNA進行qPCR反應(yīng)。qPCR反應(yīng)體系為0.5μg總RNA、1μl上游引物、1μl下游引物、5μl 5×SYBR Green。采用2-ΔΔCt方法計算RP11-1C8.5、miR-181a-5p相對表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參檢測RP11-1C8.5的表達(dá)；以U6為內(nèi)參檢測miR-181a-5p的表達(dá)。引物序列如下，miR-181a-5p正向引物:CGGCAACATTCAACGCTGT，反向引物:GTCCAGGCTCCGAGGTATTC；GAPDH正向引物:ACATCGCTGAGACACCATG，反向引物:TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG；RP11-1C8.5正向引物:GCCCAGAGTGTCCATTCACT，反向引物:CATCTCCTTCTGGGACTCCA。U6正向引物:CACGCTTGGGC-AGCACATATACT，反向引物:ACGCATCACGAATCTGCGTGTC。

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測:胰酶消化收集對照組和實驗組HCM細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS溶液洗4次，用配好的binding buffer結(jié)合緩沖液重懸HCM細(xì)胞，每100μl細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC試劑5μl，避光染色3h。每100μl細(xì)胞懸液中加入PI試劑5μl，避光染色30min，通過流式細(xì)胞儀檢測兩組HCM細(xì)胞的凋亡率。

5. CCK-8法檢測:將對照組和實驗組HCM細(xì)胞制備成均勻的細(xì)胞懸液，將每組單細(xì)胞懸液以6×103個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。在細(xì)胞接種后第1～5天分別終止培養(yǎng)，加入30 微升/孔CCK-8試劑，搖床混勻，在培養(yǎng)箱中孵育3.5h。采用全自動酶標(biāo)儀測定每孔在450nm波長處的吸光度(A)值，即HCM細(xì)胞相對活力。

6.生物信息學(xué)方法預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?根據(jù)生物信息學(xué)軟件starBase v2.0預(yù)測的RP11-1C8.5與miR-181a-5p的結(jié)合序列，將此野生型序列及突變型序列插入pGL3質(zhì)粒構(gòu)建雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒。將復(fù)蘇的HCM細(xì)胞鋪至24孔板，分別共轉(zhuǎn)染200ng RP11-1C8.5-wt、200ng RP11-1C8.5-mut或200ng NC mimic、200ng miR-181a-5p mimic。24h后收集細(xì)胞，分別檢測螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶發(fā)光強度，兩者比值即可反映RP11-1C8.5與miR-181a-5p相互結(jié)合的能力。

7. Western blot法檢測:向?qū)φ战M和實驗組HCM細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，低溫裂解30min，離心提取蛋白上清液。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，采用4%脫脂牛奶進行封閉。加入所需監(jiān)測蛋白的抗體，稀釋比例如下，一抗Bax(1∶5000)、caspase3(1∶3000)、Bcl-2(1∶3000)、CED-9(1∶3000)、GAPDH(1∶5000)，4℃過夜孵育。加入相應(yīng)二抗(1∶9000)，室溫孵育3h，通過ECL發(fā)光試劑盒進行顯影。

結(jié) 果

1.RP11-1C8.5在高糖培養(yǎng)心肌細(xì)胞中的表達(dá):qPCR結(jié)果顯示，與正常葡萄糖濃度(5.5mmol/L)比較，10.0、13.9、22.2和33.3mmol/L葡萄糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)的心肌HCM細(xì)胞中RP11-1C8.5表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，RP11-1C8.5表達(dá)與葡萄糖濃度梯度呈正相關(guān)(r=0.98，P<0.01)，其中在33.3mmol/L葡萄糖濃度培養(yǎng)HCM細(xì)胞中的表達(dá)最高(P<0.01，圖1)。

圖1 高糖培養(yǎng)心肌細(xì)胞中RP11-1C8.5的表達(dá)

2.RP11-1C8.5干擾腺病毒對HCM細(xì)胞中RP11-1C8.5表達(dá)的影響:RP11-1C8.5干擾腺病毒和對照腺病毒感染HCM細(xì)胞后，倒置熒光顯微鏡可見綠色熒光蛋白，提示腺病毒感染HCM細(xì)胞充分。對照組和實驗組HCM細(xì)胞中RP11-1C8.5表達(dá)分別為8.68±1.47和1.04±0.58，RP11-1C8.5在實驗組HCM細(xì)胞中表達(dá)含量顯著降低(P<0.01，圖2)。

圖2 RP11-1C8.5干擾腺病毒和對照腺病毒感染HCM細(xì)胞的效率(×40)

3.敲減RP11-1C8.5對HCM細(xì)胞凋亡的影響:流式細(xì)胞術(shù)顯示，RP11-1C8.5干擾腺病毒和對照腺病毒感染HCM細(xì)胞后，實驗組和對照組HCM細(xì)胞凋亡率分別為7.85%±2.67%和16.33%±2.82%，與對照組比較，敲減RP11-1C8.5明顯抑制HCM細(xì)胞的凋亡(P<0.01，圖3)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測敲減RP11-1C8.5對HCM細(xì)胞凋亡的影響

4.敲減RP11-1C8.5對HCM細(xì)胞活力的影響:CCK-8法結(jié)果顯示，從2天起，實驗組HCM細(xì)胞活力明顯高于對照組，敲減RP11-1C8.5明顯促進HCM細(xì)胞的活力(P<0.05，圖4)。

圖4 CCK-8檢測敲減RP11-1C8.5對HCM細(xì)胞活力的影響

5.RP11-1C8.5與miR-181a-5p相互作用的鑒定:通過生物信息學(xué)starBase v2.0軟件預(yù)測(圖5)，RP11-1C8.5序列的4546-4562區(qū)域與miR-181a-5p存在結(jié)合位點，結(jié)合評分為0.992。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，共轉(zhuǎn)染RP11-1C8.5-wt與miR-181a-5p mimic的相對熒光素酶活性相對于NC mimic顯著降低(P<0.01)，將結(jié)合位點突變后，兩組相對熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖6)。

圖5 生物信息學(xué)預(yù)測RP11-1C8.5的作用機制

圖6 雙熒光素酶報告基因鑒定RP11-1C8.5與miR-181a-5p的相互作用

6.敲減RP11-1C8.5對miR-181a-5p表達(dá)的影響: qPCR結(jié)果顯示，實驗組和對照組HCM細(xì)胞miR-181a-5p的表達(dá)分別為0.30±0.15和1.02±0.22，敲減RP11-1C8.5可顯著促進miR-181a-5p的表達(dá)(P<0.01)。

7.敲減RP11-1C8.5對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響: Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗組HCM細(xì)胞促凋亡蛋白Bax、caspase3表達(dá)降低，抗凋亡蛋白Bcl-2、CED-9表達(dá)增加(圖7)。

圖7 Western blot法檢測相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)情況

討 論

lncRNA是由外顯子或內(nèi)含子通過剪切形成的非編碼RNA，廣泛存在于真核細(xì)胞[11]。lncRNA通過調(diào)控基因的可變剪切和轉(zhuǎn)錄過程，參與細(xì)胞的各種生物學(xué)過程[12]。研究顯示，lncRNA廣泛影響心血管疾病如心肌纖維化、心室肥厚、心肌炎的進程[13～15]。lncRNA在糖尿病心肌病中的作用備受關(guān)注。Ni等[16]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)lncRNA ZFAS1能夠抑制心肌細(xì)胞的凋亡和鐵死亡，減緩糖尿病心肌病的進展，miR-150-5p是lncRNA ZFAS1的靶基因。Xiao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIAT在糖尿病患者血清以及高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中的表達(dá)均升高，沉默lncRNA MIAT后心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)因子IL-1、IL-18表達(dá)水平下調(diào)，lncRNA MIAT通過調(diào)控心肌細(xì)胞焦亡參與糖尿病心肌病的進展。RP11-1C8.5是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在心肌細(xì)胞中的作用未見報道。

本研究顯示，與正常葡萄糖濃度比較，經(jīng)過高糖培養(yǎng)后的心肌HCM細(xì)胞中RP11-1C8.5表達(dá)顯著上調(diào)，且其表達(dá)水平與葡萄糖濃度呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，提示RP11-1C8.5可能參與糖尿病心肌病的病理改變。為進一步明確RP11-1C8.5在糖尿病心肌病進展中的作用，本研究采用腺病毒感染技術(shù)在HCM細(xì)胞中沉默RP11-1C8.5表達(dá)。敲減RP11-1C8.5表達(dá)后，HCM細(xì)胞的凋亡率明顯降低、細(xì)胞活力明顯升高，同時促凋亡蛋白Bax、caspase3表達(dá)降低，抗凋亡蛋白Bcl-2、CED-9表達(dá)增加，提示RP11-1C8.5參與糖尿病心肌病的進展。已有研究證實，lncRNA通過海綿吸附下游微小RNA(miRNA)，通過降低miRNA表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為[18～20]。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測與雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，證實了RP11-1C8.5與miR-181a-5p的結(jié)合作用。Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p在高糖處理的心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，miR-181a-5p可顯著抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，促進心肌細(xì)胞活力，抑制心肌細(xì)胞炎癥和凋亡。本研究進一步證實，在高糖培養(yǎng)的HCM細(xì)胞中敲減RP11-1C8.5可顯著升高miR-181a-5p的表達(dá)水平，表明RP11-1C8.5通過結(jié)合miR-181a-5p在糖尿病心肌病中發(fā)揮作用。

綜上所述，RP11-1C8.5在高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲減RP11-1C8.5可通過上調(diào)miR-181a-5p表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞的凋亡并促進心肌細(xì)胞的活力。敲減RP11-1C8.5可能是阻斷糖尿病心肌病發(fā)展的有效策略。