朱 奕 李世豪 劉宏偉

膀胱癌(bladder cancer，BCa)是人類泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1]。2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，BCa新發(fā)病例約573000例，死亡病例約213000例[2]。高齡、吸煙、感染、接觸致癌物和部分職業(yè)暴露等均是BCa發(fā)生的危險(xiǎn)因素[3]。BCa的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多機(jī)制的過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前針對(duì)BCa的治療包括手術(shù)治療、放化療、免疫治療等，但總體治愈率仍不理想[4, 5]。因此，了解BCa發(fā)生的分子機(jī)制，發(fā)掘其潛在的治療靶點(diǎn)對(duì)BCa的臨床治療至關(guān)重要。

microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約為20～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小RNA，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡和代謝等方面發(fā)揮重要作用[6,7]。miR-181b-5p在多種腫瘤中異常表達(dá)，并且在不同的腫瘤中表現(xiàn)出雙重特性，既可以作為癌基因，也可以作為抑癌基因。例如，miR-181b-5p在非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中表達(dá)均上調(diào)，具有成為肺癌和乳腺癌診斷標(biāo)志物的潛力[8, 9]。miR-181b-5p在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，作為抑癌miRNA靶向下游Bcl-2基因，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺的化療敏感度[10]。這表明miR-181b-5p在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用具有組織特異性，然而miR-181b-5p在BCa中的作用尚未闡明。

抑癌基因Cylindromatosis(CYLD)是 USP 去泛素化酶家族的成員，其翻譯產(chǎn)物是一種去泛素化酶，具有從特定底物中去除多聚泛素鏈的強(qiáng)大能力，能夠通過(guò)去泛素化調(diào)控Wnt/β-catenin、TGF-β、NF-κB和JNK等信號(hào)通路[11]。CYLD突變或表達(dá)失調(diào)是包括癌癥在內(nèi)的多種疾病發(fā)生的重要因素。例如，CYLD的表達(dá)在鼻咽癌組織和細(xì)胞中均顯著降低，過(guò)表達(dá)CYLD能夠通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑抑制抑癌因子NDRG1泛素化和降解，上調(diào)NDRG1水平，抑制鼻咽癌的進(jìn)展[12]。研究表明，通過(guò)小干擾 RNA沉默CYLD或促癌 miRNA 下調(diào) CYLD的表達(dá)，胃癌、膀胱癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移能力增加[11]。

本研究探討miR-181b-5p在BCa細(xì)胞中的作用及對(duì)CYLD的靶向調(diào)控作用，期待為BCa治療提供新的靶點(diǎn)。

材料與方法

1.細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)材料：人膀胱尿路上皮癌細(xì)胞株(T24、UM-UC-3、5637)和人膀胱上皮永生化細(xì)胞(SV-HUC-1)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；miR-181b-5p 模擬物和CYLD siRNA由蘇州吉瑪基因股份有限公司設(shè)計(jì)合成。miR-NC sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，miR-NC antisense： 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；miR-181b-5p模擬物 sense：5′-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3′，miR-181b-5p模擬物 antisense：5′-CCACCGACAGCAAUGAAUGUUUU-3′；si-CYLD-1 sense：5′-GGGCUUGCAAUGUAUGAGUTT-3′，si-CYLD-1 antisense：5′-ACUCAUACAUUGCAAGCCCTT-3′；si-CYLD-2 sense：5′-GGUUCAUCCAGUCAUAAUATT-3′，si-CYLD-2 antisense：5′-UAUUAUGACUGGAUGAACCTT-3′；Lipofectamine RNAimax轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司；RNAiso Plus，PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green premix Ex Taq試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。miRNA熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。Dual-LumiTM雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CYLD和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：T24、5637和UM-UC-3細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，SV-HUC-1細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的F-12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)。放置于5% CO2濃度、37℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前1天，將T24和UM-UC-3細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，每孔2×105個(gè)。待次日細(xì)胞生長(zhǎng)融合至孔板面積70%～80%，按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為對(duì)照組和miR-181b-5p組以及對(duì)照組、CYLD-1組、CYLD-2組。

3.RNA提取和qRT-PCR：將T24、UM-UC-3、5637和SV-HUC-1細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，24h后提取各細(xì)胞系的總RNA并測(cè)定濃度。在T24和UM-UC-3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染對(duì)照組、miR-181b-5p組和CYLD-1組、CYLD-2組，24h后提取各組的總RNA并測(cè)定濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。miRNA定量PCR檢測(cè)所需引物采用加尾法設(shè)計(jì)，miR-181b-5p上游引物：5′-AACATTCATTGCTGTCGGTGGGT-3′，下游引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。內(nèi)參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；CYLD上游引物：5′-GCCTCCCAAACTTGCCTTTA-3′，CYLD下游引物：5′-TGGATTGTGGTTGTGAGTCAA-3′；GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，GAPDH下游引物：5′- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt統(tǒng)計(jì)分析。

4.CCK-8實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染24h后，待T24和UM-UC-3細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，將各組細(xì)胞消化離心后重新懸浮為單個(gè)細(xì)胞，以每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，放置于5% CO2濃度、37℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在第0～5天同一時(shí)間點(diǎn)向每孔加入10μl CCK-8試劑，然后繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)放置2h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm時(shí)各孔的吸光度(A)值，Graphpad prism 8軟件繪制細(xì)胞增殖曲線。

5.克隆形成實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染24h后，待T24和UM-UC-3細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，將各組細(xì)胞胰酶消化離心后重新懸浮為單細(xì)胞，以每孔500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，放置于5% CO2濃度、37℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7～10天。期間多次觀察，待細(xì)胞集落形成，吸掉舊培養(yǎng)基，多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，放在自來(lái)水下緩慢沖洗掉結(jié)晶紫，等待6孔板自然干燥后拍照。

6.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染24h后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24和UM-UC-3細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞并用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，在24孔板下室中加入600μl血清濃度為10%的完全培養(yǎng)基，將Transwell小室放置于24孔板內(nèi)，小室內(nèi)加入200μl的細(xì)胞重懸液，每個(gè)小室8×104個(gè)細(xì)胞，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。T24和UM-UC-3細(xì)胞分別培養(yǎng)約18h和24h后將小室用多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色，然后放在自來(lái)水下緩慢沖洗小室，待小室干燥后在顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。

7.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：將凍存于-80℃的基質(zhì)膠提前取出放置于4℃解凍。次日，按照基質(zhì)膠和無(wú)血清培養(yǎng)基1∶5的比例配成稀釋液，將Transwell小室放在24孔板內(nèi)，吸取50μl基質(zhì)膠稀釋液鋪于小室內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)2～3h使之凝固。凝固后在下室加入600μl完全培養(yǎng)基，小室內(nèi)加入200μl細(xì)胞重懸液，每個(gè)小室8×104個(gè)細(xì)胞。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后取出，后續(xù)固定、染色步驟同上。

8.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：采用starbase在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-181b-5p潛在的靶基因CYLD以及結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建CYLD 3′-UTR雙熒光素酶野生型質(zhì)粒wt-CYLD和突變型質(zhì)粒mut-CYLD。將wt-CYLD和mut-CYLD與miR-181b-5p 模擬物和對(duì)照共轉(zhuǎn)染T24和UM-UC-3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24h后吸盡舊培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，然后按照說(shuō)明書加入細(xì)胞裂解液，充分裂解后，取20μl樣品，加入100μl螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑，混勻后室溫孵育5min，然后使用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，再加入100μl海腎熒光素酶檢測(cè)試劑，混勻后進(jìn)行酶標(biāo)儀化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，根據(jù)測(cè)得值進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)后續(xù)分析。

9.Western blot法檢測(cè)：轉(zhuǎn)染48h后，提取對(duì)照組和miR-181b-5p組的總蛋白質(zhì)并測(cè)定濃度，30μg蛋白加入SDS-PAGE凝膠孔中，電泳2h后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶封閉1h，并在4℃條件下孵育一抗(CYLD抗體稀釋濃度為1∶1000，GAPDH抗體稀釋濃度為1∶10000)過(guò)夜。次日孵育二抗1h，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光與曝光，以GAPDH為內(nèi)參，用Image-J軟件分析各組灰度值。

結(jié) 果

1.miR-181b-5p在膀胱上皮永生化細(xì)胞和BCa細(xì)胞中的表達(dá)情況：qRT-PCR檢測(cè)miR-181b-5p在SV-HUC-1細(xì)胞和T24、5637、UM-UC-3細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與SV-HUC-1比較，miR-181b-5p在T24、5637、UM-UC-3細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05，圖1)。

圖1 miR-181b-5p在膀胱上皮永生化細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.過(guò)表達(dá)miR-181b-5p促進(jìn)BCa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲：轉(zhuǎn)染miR-181b-5p 模擬物后，qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，在T24和UM-UC-3細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，miR-181b-5p組miR-181b-5p的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2A)，提示轉(zhuǎn)染成功。CCK-8檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-181b-5p后對(duì)T24和UM-UC-3細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，miR-181b-5p組的細(xì)胞增殖能力顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2中B、C)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-181b-5p組的細(xì)胞集落數(shù)顯著多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2中D、E)，表明過(guò)表達(dá)miR-181b-5p后，T24和UM-UC-3細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，miR-181b-5p組的細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2中F～I(xiàn))。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-181b-5p對(duì)BCa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

3.miR-181b-5p與CYLD 3′-UTR結(jié)合負(fù)調(diào)控CYLD的表達(dá)：利用starbase在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-181b-5p與CYLD的3′-UTR含有互補(bǔ)的核苷酸序列(圖3A)，隨后構(gòu)建了CYLD 3′-UTR雙熒光素酶野生型質(zhì)粒wt-CYLD和突變型質(zhì)粒mut-CYLD。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在T24和UM-UC-3細(xì)胞中，與對(duì)照組+wt-CYLD組比較，miR-181b-5p組+wt-CYLD組的熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3B、C)。然而，miR-181b-5p組+mut-CYLD組的熒光素酶活性相較于對(duì)照組+mut-CYLD組無(wú)明顯變化(P>0.05)，提示miR-181b-5p 與CYLD 3′-UTR之間存在結(jié)合位點(diǎn)。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-181b-5p調(diào)控CYLD的表達(dá)水平，qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-181b-5p組的CYLD mRNA水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3D)。Western blot法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-181b-5p組的CYLD蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3中E、F)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-181b-5p對(duì)靶基因CYLD有負(fù)性調(diào)控作用。

圖3 miR-181b-5p對(duì)靶基因CYLD的影響

4.沉默CYLD促進(jìn)BCa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲：沉默CYLD后，采用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較， CYLD-1組和CYLD-2組的CYLD表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4A)，提示沉默CYLD轉(zhuǎn)染成功。CCK-8結(jié)果顯示，沉默CYLD顯著促進(jìn)膀胱癌T24和UM-UC-3細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4中B、C)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CYLD-1組和CYLD-2組細(xì)胞集落形成數(shù)目增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4中D～F)。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，CYLD-1組和CYLD-2組的細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4中G～J)。以上結(jié)果表明沉默CYLD能夠促進(jìn)BCa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

圖4 沉默CYLD對(duì)BCa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

討 論

BCa是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，盡管近些年BCa的發(fā)生率和病死率呈下降趨勢(shì)，但仍嚴(yán)重威脅人們的生命健康[13]。隨著對(duì)BCa分子生物學(xué)的認(rèn)識(shí)不斷提高，人們發(fā)現(xiàn)miRNA與BCa的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，以期從分子水平闡釋BCa的發(fā)病機(jī)制[14]。研究表明miRNA參與BCa的增殖、遷移、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和耐藥等多種生物學(xué)過(guò)程，甚至認(rèn)為miRNA可作為BCa早期診斷和預(yù)后評(píng)估的重要標(biāo)志物[15, 16]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181b-5p在胃癌患者血清和胃癌細(xì)胞中表達(dá)升高，下調(diào)miR-181b-5p的表達(dá)后可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖[17]。此外，miR-181b-5p在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、膽管癌、腦膠質(zhì)瘤和結(jié)直腸癌中均有不同程度的異常表達(dá)[8～10,18,19]。然而，miR-181b-5p在BCa中的作用和機(jī)制尚不明確。

本研究比較了膀胱上皮永生化細(xì)胞和BCa細(xì)胞中miR-181b-5p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，miR-181b-5p在BCa細(xì)胞中的表達(dá)量顯著升高，表明miR-181b-5p可能參與了BCa的發(fā)生、發(fā)展。隨后，本研究進(jìn)一步探討了miR-181b-5p在BCa中的生物學(xué)作用，采用體外轉(zhuǎn)染法過(guò)表達(dá)miR-181b-5p后，可顯著增加T24和UM-UC-3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，表明miR-181b-5p在BCa中發(fā)揮明顯的促癌作用。miRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合到靶基因的3′-UTR，導(dǎo)致靶基因降解或翻譯抑制[20～22]。本研究采用生物信息網(wǎng)站starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)CYLD是miR-181b-5p的潛在靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-181b-5p能夠與CYLD的3′-UTR結(jié)合，過(guò)表達(dá)miR-181b-5p后在mRNA和蛋白質(zhì)水平抑制CYLD的表達(dá)，進(jìn)一步證明CYLD是miR-181b-5p的靶基因。

CYLD是一種去泛素化酶，在多種癌癥中屬于腫瘤抑制基因，其抑癌功能的喪失與胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌和多發(fā)性骨髓瘤等多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[11, 23]。研究表明，CYLD在BCa組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均下降，過(guò)表達(dá)CYLD后通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制BCa細(xì)胞的增殖、遷移和細(xì)胞周期S期的聚集[24]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默CYLD的表達(dá)后，BCa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著增加，表明CYLD在BCa中起著抑癌基因的作用。

綜上所述，miR-181b-5p在BCa細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)負(fù)調(diào)控CYLD的表達(dá)促進(jìn)BCa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究在一定程度上闡述了miR-181b-5p與BCa發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，表明miR-181b-5p可能成為BCa治療的新靶點(diǎn)。