周 倩 胡曉晴 熊 娟 范國華

肺移植是治療終末期呼吸系統(tǒng)疾病的的唯一手段[1]。肺缺血再灌注是指在供肺的冷缺血基礎(chǔ)上，進(jìn)一步恢復(fù)血流灌注導(dǎo)致的肺組織損傷加重的現(xiàn)象，其是導(dǎo)致肺移植功能障礙的主要原因。目前觀點(diǎn)認(rèn)為導(dǎo)致肺缺血再灌注損傷的主要機(jī)制主要包括氧化應(yīng)激、無菌性炎癥、肺組織細(xì)胞的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡及自噬異常[2, 3]。在獲取供肺和植入受者體內(nèi)再灌注之間的這段時(shí)間內(nèi)，肺暴露于缺血和嚴(yán)重缺氧的環(huán)境中，導(dǎo)致肺組織能量大量消耗，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時(shí)釋放大量損傷相關(guān)分子(damage-associated molecular patterns, DAMPs)，誘發(fā)肺巨噬細(xì)胞炎癥激活和焦亡[4]；另一方面，研究表明自噬激活可通過改善血-氣屏障來減輕肺缺血再灌注損傷[5]。因此，靶向抑制焦亡或激活自噬的化合物具有治療肺缺血再灌注損傷的潛力。

阿格拉賓是一種從青蒿中分離出的無色結(jié)晶的雙環(huán)化合物，具有多種藥理活性，包括抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡及抗腫瘤等[6]。研究表明，阿格拉賓可通過抑制NLRP3炎癥小體活化，激活自噬最終減少胰腺β細(xì)胞凋亡并預(yù)防2型糖尿病發(fā)生[7]。但阿格拉賓在肺缺血再灌注損傷中是否同樣發(fā)揮保護(hù)作用目前尚未見報(bào)道。本研究通過建立左肺門夾閉構(gòu)建了小鼠肺缺血再灌注損傷模型，同時(shí)觀察并探討了阿格拉賓預(yù)處理對(duì)小鼠肺損傷表型的影響及潛在機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)小鼠：8～10周齡，體質(zhì)量23.4～25.8g的雄性C57/B6小鼠購自湖北省預(yù)防科學(xué)院動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度22±1℃，濕度55%±5%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和管理批號(hào)：WDRM20180401。本研究中所有動(dòng)物相關(guān)操作均獲得武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法將實(shí)驗(yàn)小鼠分為4組，依次為對(duì)照組、阿格拉賓組、缺血再灌注組和治療組，每組小鼠數(shù)量為10只。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：阿格拉賓(純度：99.17%，批號(hào)：HY-16059)購自MedChemExpress(中國)公司；一抗IL-1β(批號(hào)：ab254360)、MCP-1(批號(hào)：ab7202)、TNF-α(批號(hào)：ab215188)、NLRP3(批號(hào)：ab263899)、ASC(批號(hào)：ab283684)、Beclin1(批號(hào)：ab207612)、ATG7(批號(hào)：ab52472)、GAPDH(批號(hào)：ab8245)、羊抗兔IgG(批號(hào)：ab52947)購自英國Abcam公司。

3.肺缺血再灌注損傷模型的建立：參考既往文獻(xiàn)報(bào)道的方式，缺血再灌注組小鼠術(shù)前12h禁食、禁水，戊巴比妥鈉(2%)60mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉。麻醉誘導(dǎo)成功后，取仰臥位固定于保溫平板，左側(cè)胸部剃毛并消毒鋪巾。使用特制靜脈留置針進(jìn)行氣管插管，固定套管于小鼠上切牙。依次打開皮膚、筋膜及肌肉后，使用顯微血管鉗夾閉左肺門1h，隨后松開顯微血管鉗再灌注2h。再灌注結(jié)束后使用眼科剪游離左肺門，獲取肺組織標(biāo)本。治療組小鼠在肺門夾閉前1h給予阿格拉賓(5μg/kg)腹腔注射。

4.HE染色評(píng)估小鼠肺病理損傷：取小鼠左肺組織于多聚甲醛(4%)中固定1天，分別用自來水合蒸餾水沖洗，并使用梯度乙醇脫水，制成蠟塊后切片。將得到的肺組織切片在溫箱中烘烤1h后，使用梯度乙醇脫水、二甲苯脫蠟、蘇木精-伊紅染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。同時(shí)對(duì)各組小鼠肺損傷情況進(jìn)行評(píng)分，具體如下：0分：肺組織正常；1分：損傷<25%；2分：損傷為25%～50%(不含)；3分：損傷為50%～75%；4分：損傷>75%。

5. Western blot法檢測(cè)：每組隨機(jī)選取5只小鼠的左肺下葉進(jìn)行相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)。首先，使用超聲裂解法提取小鼠肺組織中總蛋白，并通過BCA法對(duì)各樣本蛋白進(jìn)行定量。配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，取50μg蛋白樣品上樣電泳。電泳結(jié)束后，將還有凝膠中的總蛋白轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜上，并使用脫脂奶粉(5%)進(jìn)行封閉。封閉完成后，分別使用相應(yīng)的一抗稀釋液對(duì)目的條帶進(jìn)行孵育，4℃過夜。次日，使用等滲緩沖鹽溶液TBST洗膜3次后，二抗室溫孵育1h。ECL顯色后，最后使用Image Lab對(duì)各泳道的灰度值進(jìn)行半定量。

結(jié) 果

1.阿格拉賓對(duì)缺血再灌注小鼠肺病理損傷的影響: HE染色結(jié)果顯示，肺缺血1h，再灌注2h小鼠肺組織出現(xiàn)了明顯的病理損傷，表現(xiàn)為肺組織中大量炎性細(xì)胞浸潤、肺水腫及肺泡腔中出現(xiàn)一定量的紅細(xì)胞，同時(shí)小鼠肺損傷評(píng)分明顯升高(P<0.05)；阿拉格賓干預(yù)可明顯減輕小鼠肺病理損傷，降低肺損傷評(píng)分(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果(×200)及肺損傷評(píng)分

2.阿格拉賓對(duì)缺血再灌注小鼠肺炎性反應(yīng)的影響: Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，缺血再灌注可明顯上調(diào)小鼠肺組織中IL-1β、MCP-1和TNF-α的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)；而單獨(dú)給予阿拉格賓預(yù)處理對(duì)對(duì)照組小鼠肺組織中IL-1β、MCP-1和TNF-α的蛋白表達(dá)無明顯影響(P>0.05)；相反，阿拉格賓預(yù)處理可明顯抑制缺血再灌注小鼠肺組織中IL-1β、MCP-1和TNF-α的蛋白表達(dá)(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織中IL-1β, MCP-1和TNF-α的蛋白表達(dá)

3.阿格拉賓對(duì)缺血再灌注小鼠肺組織焦亡水平的影響: Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，缺血再灌注可明顯上調(diào)小鼠肺組織中NLRP3和ASC的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)；而單獨(dú)給予阿拉格賓預(yù)處理對(duì)對(duì)照組小鼠肺組織中NLRP3和ASC的蛋白表達(dá)無明顯影響(P>0.05)；相反，阿拉格賓預(yù)處理可明顯抑制缺血再灌注小鼠肺組織的焦亡水平(P<0.05)，詳見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織中NLRP3和ASC的蛋白表達(dá)

4.阿格拉賓對(duì)缺血再灌注小鼠肺組織自噬水平的影響: Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，缺血再灌注可明顯抑制小鼠肺組織中自噬水平，表現(xiàn)為肺組織中Beclin1和ATG7的蛋白下調(diào)(P<0.05)；而阿拉格賓預(yù)處理可明顯上調(diào)缺血再灌注小鼠肺組織中Beclin1和ATG7的蛋白表達(dá)，上調(diào)自噬(P<0.05)，詳見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織中Beclin1和ATG7的蛋白表達(dá)

討 論

肺移植是目前治療終末期呼吸系統(tǒng)疾病的最有效策略[1]。然而，長期以來供肺不足仍是一個(gè)阻礙肺移植發(fā)展的關(guān)鍵的問題。研究統(tǒng)計(jì)，約80%的供肺由于各種原因無法達(dá)到移植標(biāo)準(zhǔn)。而剩余的20%供肺盡管可以達(dá)到移植標(biāo)準(zhǔn)，但由于移植術(shù)后再灌注的“二次打擊”，造成移植物失功，這也是肺移植患者圍手術(shù)期死亡的主要原因之一[9～11]。為了降低肺移植后的移植物失功，越來越多的研究開始聚焦肺缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制并尋找具有肺保護(hù)作用的天然化合物。本項(xiàng)研究揭示小分子天然化合物阿格拉賓在肺缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的保護(hù)作用，具有明顯的抑制焦亡和激活自噬的潛力。

天然免疫介導(dǎo)的無菌性炎癥在器官缺血再灌注后的組織損傷中發(fā)揮重要作用，這種無菌性炎癥的激活與模式識(shí)別受體密切相關(guān)[12]。肺泡巨噬細(xì)胞是在肺泡中主要駐留的免疫細(xì)胞，一旦它們表面的DAMPs被識(shí)別時(shí)，天然免疫和肺組織無菌性炎癥將會(huì)被激活[13]。在肺缺血再灌注早期，常駐的肺泡巨噬細(xì)胞可控制炎癥。然而，當(dāng)宿主反應(yīng)不能恢復(fù)穩(wěn)態(tài)時(shí)，炎性反應(yīng)會(huì)不受控制地?cái)U(kuò)展并發(fā)展為急性肺損傷和(或)急性呼吸窘迫綜合征[14]。焦亡是一種重要的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，是指伴隨炎性因子大量釋放所誘發(fā)的細(xì)胞炎性死亡。NLRP3炎性小體的活化是導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的重要機(jī)制之一。而NLRP3炎性小體活化的前體是NLRP3、ASC和Pro-caspase1的正確裝配。一旦NLRP3炎性小體組裝成功并被激活，細(xì)胞可迅速產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)并發(fā)生炎癥性死亡[15～17]。因此，抑制NLRP3炎性小體的形成或激活是減輕肺損傷的重要策略。本研究發(fā)現(xiàn)阿格拉賓預(yù)處理可顯著抑制缺血再灌注小鼠肺組織中NLRP3和ASC的蛋白表達(dá)水平，表明阿格拉賓具有抗焦亡的潛力。

自噬作為一種細(xì)胞質(zhì)質(zhì)量控制的代謝性過程，具有重要的細(xì)胞保護(hù)和抗炎作用。在天然免疫、無菌性感染和有菌性感染相關(guān)的炎癥中，自噬可清除破壞細(xì)胞的無菌刺激物、入侵的病原體及受損或衰老的細(xì)胞器[18, 19]。既往研究表明，在肺缺血再灌注損傷中，肺組織自噬水平被明顯抑制，使用自噬激動(dòng)劑或外源性藥物上調(diào)自噬可明顯減輕肺病理損傷并改善肺功能[5]。在本研究中，阿格拉賓預(yù)處理可顯著上調(diào)缺血再灌注小鼠肺組織中Beclin1和ATG7的蛋白表達(dá)，發(fā)揮自噬激活作用。

阿格拉賓作為一種小分子天然化合物，可通過抑制NLRP3炎性小體發(fā)揮重要的抗炎活性[6]。此外，阿格拉賓還抑制IFN-γ、IL-2、IL-1β、IL-18和TNF-α的合成，這些與COVID-19的發(fā)病密切相關(guān)。毒理學(xué)研究顯示阿格拉賓未表現(xiàn)出任何致畸性、胚胎毒性和誘變性。上述證據(jù)提示阿格拉賓具有一定的臨床轉(zhuǎn)化潛力。本研究數(shù)據(jù)顯示，阿格拉賓預(yù)處理可明顯改善肺缺血再灌注小鼠肺組織損傷，降低肺組織焦亡水平，同時(shí)激活自噬。但阿格拉賓調(diào)控焦亡和自噬的直接作用靶點(diǎn)還需開展進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。