楊 碩 郭 滿 張 浩

據(jù)2020年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因，其轉(zhuǎn)移部位多為骨、肝臟、腦、肺臟等[1]。對(duì)于發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的患者，若未得到及時(shí)治療其生存期僅為4～8個(gè)月，得到治療的乳腺癌肝轉(zhuǎn)移患者生存期也僅為18～24月[2]。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，靶向治療成為近年來(lái)乳腺癌肝轉(zhuǎn)移診治的熱點(diǎn)，本研究旨在為乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的早期診治提供可靠的理論依據(jù)。

垂體同源框配對(duì)同源域轉(zhuǎn)錄因子1(pituitary homeobox paired homeodomain transcription 1, PITX1)在成年垂體細(xì)胞分化以及肢體發(fā)育中發(fā)揮重要作用[3]。此外，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中作為抑癌基因，與胃癌、乳腺癌等多種腫瘤有關(guān)[4,5]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由21～25nt組成的非編碼小RNA，可參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等重要生理過(guò)程，miRNA在多種人類腫瘤中上調(diào)，作為腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物發(fā)揮作用[6]。miR-556-3p是miRNA新的一員，有研究表明，乳腺癌細(xì)胞中miR-556-5p水平較正常乳腺上皮細(xì)胞顯著上調(diào)，其機(jī)制可能為miRNA-556調(diào)控SLC43A3表達(dá)，從而促使乳腺癌發(fā)生侵襲遷徙[7]。目前關(guān)于PITX1、miR-556-3p在乳腺癌肝轉(zhuǎn)移中共同作用的研究甚少。因此，本研究通過(guò)探究PITX1、miR-556-3p在乳腺癌肝轉(zhuǎn)移中的表達(dá)，旨在為乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的早期診斷提供參考依據(jù)。

資料與方法

1.一般資料：以2019年6月～2021年6月在筆者醫(yī)院診治的142例乳腺癌患者為研究對(duì)象，≤35歲59例，>35歲83例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期79例，Ⅲ～Ⅳ期63例；原發(fā)側(cè)：左側(cè)75例，右側(cè)67例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移81例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例；組織學(xué)分級(jí)：1級(jí)37例，2級(jí)49例，3、4級(jí)56例；腫瘤直徑：<2cm 39例，2～5cm 61例，>5cm 42例。孕激素受體(progesterone receptor，PR)陽(yáng)性86例，陰性56例；雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽(yáng)性91例，陰性51例；人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，Her-2)陽(yáng)性53例，陰性89例；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌87例，非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌55例。其中，64例乳腺癌肝轉(zhuǎn)移患者為轉(zhuǎn)移組，78例乳腺癌未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移患者為未轉(zhuǎn)移組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)檢查顯示為乳腺癌肝轉(zhuǎn)移；②近3個(gè)月未接受過(guò)放、化療及內(nèi)分泌治療；③預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；④病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②發(fā)生其他器官轉(zhuǎn)移；③患有傳染性疾??；④不積極配合治療者。本研究經(jīng)患者及家屬簽署知情同意書，且經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：SOP-IRB-KYLW-007)。

2.主要試劑與儀器：兔抗人PITX1抗體購(gòu)自上海群己生物科技有限公司；山羊抗兔lgG H&L(HRP)購(gòu)自美國(guó)SanatCurz公司；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購(gòu)自艾美捷科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)自愛必信(上海)生物科技有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司；miScript SYBR?Green qPCR kit試劑盒購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；PCR儀購(gòu)自上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

3.樣品采集：在手術(shù)過(guò)程中采集各患者癌組織并浸泡于無(wú)液氮RNA樣品組織保存液中，-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

4.免疫組化法檢測(cè)各組織PITX1蛋白水平：首先組織固定利用10%的甲醛進(jìn)行，石蠟常規(guī)包埋、切片(4μm)。對(duì)切片脫蠟、水化、封存。一抗兔抗人PITX1抗體在4℃條件下過(guò)夜孵育，二抗采用山羊抗兔lgG在37℃條件下孵育30min。DAB顯色、蘇木精復(fù)染，進(jìn)一步脫水、封片、鏡檢。

5.結(jié)果評(píng)定：PITX1蛋白表達(dá)采用半定量評(píng)定方法，染色指數(shù)(staining index, SI)為染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例的乘積，SI評(píng)分為0～9分，染色強(qiáng)度：無(wú)染色記0分，淺黃色即弱染色記1分，黃褐色即中染色記2分，棕褐色即強(qiáng)染色記3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例：<25%記0分，25%～50%記1分，51%～75%記2分，>75%記3分。由3名專業(yè)人員評(píng)分后取其平均值，其中SI≤4分為陰性，SI>4分為陽(yáng)性。

6.兩組患者PITX1mRNA、miR-556-3p水平檢測(cè)：在各樣本中加入Trizol試劑提取總RNA，并檢驗(yàn)RNA純度是否符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照miScript SYBR?Green qPCR kit試劑盒說(shuō)明書行qRT-PCR反應(yīng)，qRT-PCR反應(yīng)：95℃ 1min，55℃ 30s和72℃ 45s，30個(gè)循環(huán)，PITX1mRNA、miR-556-3p分別以GAPDH、U6為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔct計(jì)算，詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

結(jié) 果

1.兩組患者一般臨床資料比較：乳腺癌肝轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組患者之間年齡、原發(fā)側(cè)、腫瘤直徑、PR、ER、Her-2比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、病理類型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 兩組患者一般臨床資料比較

2.PITX1在兩組中的表達(dá)情況：轉(zhuǎn)移組患者PITX1陽(yáng)性表達(dá)率32.81%顯著低于未轉(zhuǎn)移組65.38%(χ2=14.922,P<0.05)，詳見表3、圖1。

圖1 PITX1表達(dá)情況(×400)

表3 PITX1在兩組中的表達(dá)情況[n(%)]

3.PITX1mRNA、miR-556-3p在兩組中的表達(dá)水平：與未轉(zhuǎn)移組比較，轉(zhuǎn)移組患者組織PITX1mRNA水平顯著降低(P<0.05)，miR-556-3p水平顯著升高(P<0.05)，詳見表4。

表4 PITX1mRNA、miR-556-3p在兩組中的表達(dá)水平

4.PITX1與miR-556-3p的關(guān)系：生物信息網(wǎng)站starbase(ENCORI)顯示，PITX1與miR-556-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，詳見圖2。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PITX1與miR-556-3p呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.436，P<0.001)，詳見圖3。

圖2 PITX1與miR-556-3p存在結(jié)合位點(diǎn)

圖3 PITX1與miR-556-3p的關(guān)系

5.多因素Logistic回歸分析乳腺癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素：以TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、病理類型、PITX1、miR-556-3p水平為自變量，以乳腺癌患者是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移為因變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，組織學(xué)分級(jí)3～4級(jí)、PITX1陰性是乳腺癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，詳見表5。

表5 多因素Logistic回歸分析乳腺癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素

6.ROC曲線分析PITX1、miR-556-3p對(duì)乳腺癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值：ROC曲線結(jié)果顯示，PITX1、miR-556-3p、二者聯(lián)合對(duì)乳腺癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)價(jià)值的曲線下面積(AUC)分別為0.849(敏感度為81.3%，特異性為92.3%)、0.824(敏感度為85.9%，特異性為83.3%)、0.926(敏感度為90.6%，特異性為82.1%)，詳見表6、圖4。

圖4 ROC曲線分析PITX1、miR-556-3p對(duì)乳腺癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值

表6 PITX1、miR-556-3p對(duì)乳腺癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值

討 論

乳腺癌作為全球女性最常見的惡性腫瘤，對(duì)女性的生命健康造成了嚴(yán)重的威脅。近年來(lái)，乳腺癌的發(fā)生率呈不斷上升的趨勢(shì)，其中，肝轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因之一，且肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后效果仍不容樂(lè)觀，早期診斷并制定精確的治療方案對(duì)延長(zhǎng)乳腺癌肝轉(zhuǎn)移患者的生存期有重要意義[8]。

PITX1是bicoid類的同源域轉(zhuǎn)錄因子，位于染色體5q31，參與胚胎發(fā)育、后肢形成及垂體細(xì)胞分化等生理過(guò)程，另外PITX1失調(diào)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[9]。劉向華等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PITX1在三陰性乳腺癌中呈低表達(dá)，其水平與患者臨床病理特征密切相關(guān)，且表明PITX1高表達(dá)患者的累計(jì)生存率顯著高于低表達(dá)者。Ohira等[11]研究表明，PITX1通過(guò)誘導(dǎo)SOX9表達(dá)而下調(diào)SOX10和SAMMSON水平，從而抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-675在胃癌組織中上調(diào)，并通過(guò)靶向下調(diào)其靶標(biāo)PITX1促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，二者的異常表達(dá)預(yù)測(cè)了胃癌患者較差的預(yù)后。Jiang等[13]研究報(bào)道，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中上調(diào)的miR-1204與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，并通過(guò)下調(diào)PITX1促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。上述研究表明，PITX1在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，但其在乳腺癌及乳腺癌肝轉(zhuǎn)移中的表達(dá)尚未明晰。本研究中乳腺癌肝轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、病理類型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)移組患者PITX1陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于未轉(zhuǎn)移組，且轉(zhuǎn)移組PITX1mRNA水平顯著下調(diào)，提示PITX1參與乳腺癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程。多因素Logistic回歸分析顯示，組織學(xué)分級(jí)3～4級(jí)、PITX1陰性是乳腺癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，提示臨床中應(yīng)重點(diǎn)檢測(cè)上述危險(xiǎn)因素，合理制定治療方案，減少肝轉(zhuǎn)移概率。進(jìn)一步ROC曲線結(jié)果顯示，PITX1預(yù)測(cè)乳腺癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的AUC為0.849(敏感度為81.3%，特異性為92.3%)，提示PITX1對(duì)乳腺癌患者是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移有一定的評(píng)估價(jià)值。

miRNA是一類高度保守的非編碼RNA，通過(guò)與其靶基因特異性相結(jié)合而參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能，miRNA可調(diào)控人類約30%的基因表達(dá)，在腫瘤生物學(xué)發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。miR-556-3p是miRNA家族中重要的一員，梁磊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-556-3p在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)較癌旁組顯著上調(diào)，其機(jī)制可能為miR-556-3p通過(guò)靶向抑制SASH1從而促進(jìn)癌細(xì)胞的活力和生長(zhǎng)。Lu等[16]研究報(bào)道，過(guò)表達(dá)的miR-556-3p通過(guò)靶向DAB2IP而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲和活力。白文輝等[17]研究表明，miR-556-3p在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，過(guò)表達(dá)的circPTPRA通過(guò)靶向下調(diào)miR-556-3p，可抑制癌細(xì)胞MDA-MB-231的生長(zhǎng)和遷移。上述研究表明，miR-556-3p為致癌基因，其通過(guò)與靶基因相結(jié)合調(diào)控細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。

本研究中，與未轉(zhuǎn)移組比較，轉(zhuǎn)移組miR-556-3p水平顯著升高。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PITX1與miR-556-3p呈顯著負(fù)相關(guān)，提示二者可能存在某種關(guān)系共同參與乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。ROC曲線結(jié)果顯示，PITX1、miR-556-3p聯(lián)合預(yù)測(cè)乳腺癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的AUC為0.926(敏感度為90.6%，特異性為82.1%)，并顯著高于各單一指標(biāo)，提示二者聯(lián)合對(duì)乳腺癌患者是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移具有較優(yōu)的預(yù)測(cè)價(jià)值，對(duì)二者水平異常的乳腺癌患者應(yīng)加強(qiáng)病情監(jiān)測(cè)，預(yù)防肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

綜上所述，PITX1、miR-556-3p在乳腺癌肝轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)異常，二者與肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生密切相關(guān)，且對(duì)乳腺癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。今后將擴(kuò)大樣本量，開展深入研究，從而為乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的診治提供理論基礎(chǔ)。