胡定元 徐拓宇 徐 緣 朱浩奇 李盛村 蔣 益 吳 昊

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases, IBD)是一組病因不明的慢性腸道非特異性炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn′s disease, CD)。近20年來(lái)該病在我國(guó)的發(fā)生率呈逐年增高趨勢(shì)[1]。目前認(rèn)為IBD是免疫、環(huán)境、炎癥等因素綜合作用于遺傳易感者，使其發(fā)生針對(duì)自身腸道菌群的異常免疫應(yīng)答，最終出現(xiàn)難以控制的腸道炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，HLA-B27轉(zhuǎn)基因大鼠或IL-10-/-小鼠均會(huì)產(chǎn)生自發(fā)性結(jié)腸炎，但是在腸道無(wú)菌環(huán)境下則不會(huì)發(fā)生腸道炎癥，這提示腸道菌群是IBD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[2,3]。

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferase，F(xiàn)UT)2基因主要負(fù)責(zé)編碼α-(1,2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶[4]。國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FUT2基因是CD的易感基因[5～8]。另有研究顯示，小鼠腸道上皮細(xì)胞FUT2基因條件性敲除后，小鼠結(jié)腸炎癥顯著加重，并發(fā)現(xiàn)腸道菌群組成和功能的變化可能參與其機(jī)制[9]。在小鼠中，α-(1,2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶主要由FUT2基因、FUT1基因和SEC1(secretory blood group 1)基因表達(dá)，本研究擬探討SEC1基因敲除對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠炎癥和腸道菌群的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：采用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)獲得SEC1-/-C57BL/6品系小鼠(賽業(yè)生物科技有限公司)，經(jīng)PCR驗(yàn)證SEC1-/-小鼠基因型后，在無(wú)特定病原體(SPF)環(huán)境中飼養(yǎng)、繁殖，選擇6～8周齡，體質(zhì)量20～22g的SEC1-/-雌鼠和野生型(wild-type, WT) C57BL/6品系小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(浙)2018-0017。

2.主要試劑：葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)(相對(duì)分子質(zhì)量36～50kDa)購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司，蘇木精染液由南京建成生物工程研究所提供，伊紅染液由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。腸道菌群DNA由美國(guó)Omega E.Z.N.A.?細(xì)菌DNA試劑盒提取。采用德國(guó)Leica倒置顯微鏡分析病理切片。16s-rDNA測(cè)序平臺(tái)為美國(guó)illumina MiSeq 測(cè)序系統(tǒng)。

3.實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型構(gòu)建：SEC1-/-小鼠和WT小鼠共同飼養(yǎng)1周后，分為SEC1-/-結(jié)腸炎組(n=14)、WT結(jié)腸炎組(n=15)和健康對(duì)照組(n=6)共3組。前兩組結(jié)腸炎小鼠均給予3%(w/v)DSS自由飲用造模5天，誘導(dǎo)急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，而對(duì)照組小鼠給予普通飲用水。

4. 結(jié)腸炎嚴(yán)重程度評(píng)估：結(jié)腸炎造模開(kāi)始后，每日記錄各組小鼠大便性狀、便血情況、精神狀況和體質(zhì)量變化，按照Hartmann等制定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估小鼠結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index, DAI)。造模后第7天采用頸椎脫臼法使小鼠安樂(lè)死，迅速剖取結(jié)腸，收集各小鼠升結(jié)腸內(nèi)糞便標(biāo)本，然后用預(yù)冷0.9%NaCl溶液沖洗結(jié)腸，取末端結(jié)腸1cm，固定在4%多聚甲醛中，用作蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色)，觀(guān)察結(jié)腸組織病理。

5. 16s-rDNA腸道菌群分析：收集各小鼠升結(jié)腸內(nèi)糞便標(biāo)本(其中SEC1-/-結(jié)腸炎小鼠組和WT結(jié)腸炎小鼠各隨機(jī)選取6只)后，置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。提取結(jié)腸內(nèi)糞便標(biāo)本DNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增： 16s-rDNA V4區(qū)PCR擴(kuò)增引物序列：515-正向引物：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806-反向引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。總反應(yīng)體系50μl，包含30ng DNA樣本，25μl PCR預(yù)混液和4μl PCR引物混合物，引物終濃度為0.08μmol/L。PCR反應(yīng)條件：98℃變性3min；98℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，最后置于4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，采用MiSeq PE250測(cè)序。

結(jié) 果

1.SEC1基因敲除對(duì)結(jié)腸炎小鼠嚴(yán)重程度的影響：飲用DSS后，WT小鼠和SEC1-/-小鼠均逐漸出現(xiàn)腹瀉、便血癥狀等疾病活動(dòng)表現(xiàn)，體質(zhì)量較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)。SEC1-/-結(jié)腸炎小鼠較早出現(xiàn)腹瀉、便血癥狀，飲用DSS第5天開(kāi)始，其疾病活動(dòng)指數(shù)較WT結(jié)腸炎小鼠升高更加明顯(P均<0.05，圖1)。飲用DSS第6天開(kāi)始，與WT結(jié)腸炎小鼠比較，SEC1-/-結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量下降更加顯著(P<0.05，圖2)。飲用DSS第7天，與WT結(jié)腸炎組比較，SEC1-/-結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量顯著下降(87.0%±6.2% vs 77.9%±4.7%，P<0.05)，而疾病活動(dòng)指數(shù)顯著升高(7.3±2.8 vs 9.4±2.6，P<0.05)。進(jìn)一步分析比較腸組織黏膜病理發(fā)現(xiàn)，SEC1-/-結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸黏膜上皮受損、隱窩結(jié)構(gòu)破壞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較WT結(jié)腸炎小鼠更加明顯(圖3)。

圖1 SEC1基因敲除對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠DAI的影響

圖2 SEC1基因敲除對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎體質(zhì)量變化的影響

圖3 野生型結(jié)腸炎和SEC1基因敲除結(jié)腸炎小鼠腸道病理(HE染色)

2.DSS結(jié)腸炎造模對(duì)小鼠腸道菌群的影響：DSS結(jié)腸炎小鼠的OTU個(gè)數(shù)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(194 vs 207，P>0.05，圖4)。雖然兩組的Shannon和chao1指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但DSS結(jié)腸炎小鼠Simpson指數(shù)顯著低于對(duì)照組(0.83 vs 0.91，P<0.05)，提示DSS結(jié)腸炎造模后小鼠腸道菌群alpha多樣性降低。DSS結(jié)腸炎造模后，在菌門(mén)分類(lèi)中，厚壁菌門(mén)和脫硫桿菌門(mén)減少，而變形菌門(mén)和疣微菌門(mén)增加；在菌屬分類(lèi)中，Akkermansia屬和大腸桿菌-志賀菌屬增加，而毛螺菌科屬和梭狀芽孢桿菌屬減少(P均<0.05)。

3.SEC1基因敲除與結(jié)腸炎小鼠腸道菌群組成的相關(guān)性：SEC1-/-結(jié)腸炎小鼠腸道OTU個(gè)數(shù)較WT結(jié)腸炎小鼠顯著增多(305 vs 194，P<0.05，圖4)。SEC1基因敲除后，結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的Shannon和chao1指數(shù)也顯著增加(4.71 vs 4.09；332 vs 207；P均<0.05)，提示菌群多樣性顯著增加。PCA分析表明，SEC1-/-結(jié)腸炎小鼠和WT結(jié)腸炎小鼠腸道菌群組成比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。通過(guò)菌群豐度比較發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠之間某些細(xì)菌在各個(gè)分類(lèi)水平的相對(duì)豐度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在門(mén)分類(lèi)水平，SEC1-/-結(jié)腸炎小鼠腸道中厚壁菌門(mén)(平均豐度值55.25 vs 16.38)、擬桿菌門(mén)(0.02 vs 0.002)、巴氏桿菌門(mén)(1.82 vs 0.09)、放線(xiàn)菌門(mén)(1.60 vs 0.80)、藍(lán)藻菌門(mén)(0.10 vs 0.02)和硝化螺菌門(mén)(0.02 vs 0.01)的豐度增加，而變形菌門(mén)(0.81 vs 27.35)、脫硫桿菌門(mén)(0.55 vs 1.74)、彎曲桿菌門(mén)(0.76 vs 2.64)和疣微菌門(mén)(24.95 vs 33.72)的豐度降低(P均<0.05，圖6)；在屬分類(lèi)水平，乳酸桿菌屬(平均豐度值28.95 vs 2.23)、梭菌屬(0.13 vs 0.01)和糖單胞菌屬(1.82 vs 0.09)顯著增多，而擬桿菌屬(0.12 vs 1.64)、大腸桿菌-志賀菌屬(0.15 vs 22.87)和幽門(mén)螺桿菌屬(0.76 vs 2.64)均顯著減少(P均<0.05，圖7)。進(jìn)一步功能預(yù)測(cè)分析顯示，這些差異表達(dá)的菌群與多種菌群功能相關(guān)，包括糖酵解Ⅲ、8-氨基-7-氧雜壬酸酯生物合成I、乙炔降解、飽和脂肪酸延長(zhǎng)等(P均<0.05)。其中，SEC1敲除后結(jié)腸炎小鼠中參與巖藻糖降解的菌群豐度顯著減少(P<0.05)。

圖4 小鼠腸道菌群OTUs比較

圖5 小鼠腸道菌群組成的主成分分析

圖6 小鼠腸道菌群在菌門(mén)分類(lèi)層面組成的堆積條形圖

圖7 小鼠腸道菌群在菌屬分類(lèi)層面組成的堆積條形圖

討 論

腸道菌群失衡可能是IBD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。臨床研究顯示，IBD患者腸道中擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和雙歧桿菌顯著減少，而大腸桿明顯增加[10]。腸道菌群參與調(diào)節(jié)腸黏膜輔助性T(T-helper, Th)-17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)的比例，而Th17/Treg細(xì)胞失衡被公認(rèn)是IBD發(fā)病的重要機(jī)制之一[11]。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組小鼠比較，WT結(jié)腸炎小鼠腸道菌群Simpson指數(shù)顯著降低，提示腸道菌群α多樣性減少，這也提示腸道菌群組成變化可能與實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎密切相關(guān)。

巖藻糖基化修飾普遍存在于腸道上皮細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，在宿主微生物共生中具有重要作用[12]。腸腔中的巖藻糖也具有調(diào)控菌群定植作用[13]。有研究已經(jīng)表明，巖藻糖基化缺乏能誘發(fā)結(jié)腸炎，而補(bǔ)充巖藻糖乳糖則能改變腸道菌群組成并緩解結(jié)腸炎[14～17]。結(jié)腸炎小鼠服用L-巖藻糖后，結(jié)腸炎病情得以緩解，其機(jī)制可能是調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞極化以及下調(diào)促炎性細(xì)胞因子表達(dá)[16]。國(guó)內(nèi)有研究者也發(fā)現(xiàn)外源性L(fǎng)-巖藻糖能緩解DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，并能抑制小鼠M1巨噬細(xì)胞極化、NLRP3炎性小體和NF-κB信號(hào)通路[16]。對(duì)慢性結(jié)腸炎小鼠的研究還發(fā)現(xiàn)，巖藻糖能通過(guò)恢復(fù)腸道膽汁酸水平和腸道菌群組成緩解結(jié)腸炎[18]。另有研究進(jìn)一步證實(shí)，腸道菌群是L-巖藻糖改善結(jié)腸炎癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[19]。

小鼠SEC1基因又稱(chēng)FUT3、FUT10基因，是小鼠體內(nèi)3種表達(dá)α-(1,2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因之一。在小鼠腸道中，α-(1,2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶主要由FUT2基因表達(dá)[20]。Lin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，給予無(wú)菌小鼠定植菌群后，小鼠小腸中FUT2基因表達(dá)顯著增加，而FUT1和SEC1基因無(wú)明顯變化。FUT2基因在小鼠和人類(lèi)中的研究較為廣泛，但是SEC1基因較少受到關(guān)注。

本研究發(fā)現(xiàn)，SEC1基因敲除后，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠嚴(yán)重程度加重。這與Tang等[9]基于FUT2基因敲除小鼠的研究相似。研究發(fā)現(xiàn)條件性敲除小鼠腸道上皮細(xì)胞FUT2基因后，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥顯著加重、腸道黏膜屏障破壞更加明顯。盡管有研究提示SEC1在小鼠腸道中表達(dá)量和活性極低，本研究發(fā)現(xiàn)SEC1基因敲除還影響結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群組成，使腸道菌群OTU個(gè)數(shù)增加，α多樣性和β多樣性均增加，且影響各個(gè)分類(lèi)水平細(xì)菌的相對(duì)豐度[21]。例如，在門(mén)分類(lèi)水平，SEC1基因敲除結(jié)腸炎小鼠腸道中厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、巴氏桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)和硝化螺菌門(mén)的豐度增多，而變形菌門(mén)、脫硫桿菌門(mén)、彎曲桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)的豐度降低。菌群功能預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，這些菌群差異與糖代謝等多種功能相關(guān)，其中包括巖藻糖降解。這提示SEC1基因仍可能通過(guò)某種機(jī)制影響腸道菌群組成，從而進(jìn)一步影響小鼠結(jié)腸炎癥。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SEC1基因敲除能加重DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠嚴(yán)重程度，并影響結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群組成。然而，其具體機(jī)制仍不明確，有待于開(kāi)展后續(xù)研究予以進(jìn)一步證實(shí)。