王 園 凌 瑞 黃美玲

乳腺癌是威脅女性健康的重要疾病，目前已超肺癌成為世界第一大癌種，尋找新型潛在有效治療靶點對于更好地實現(xiàn)乳腺癌精準(zhǔn)治療意義重大[1]。泛素化修飾是真核生物內(nèi)一種重要的蛋白翻譯后修飾，蛋白泛素化和去泛素化的穩(wěn)態(tài)失衡會導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，包括腫瘤的發(fā)生[2, 3]。在蛋白泛素化穩(wěn)態(tài)研究中，與泛素化修飾相反，細(xì)胞內(nèi)也存在一類去泛素化酶，可以將泛素分子從蛋白上水解。其中泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease, USPs)是最重要的、亞成員最多的去泛素化相關(guān)酶家族[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種USPs在腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤的惡性表型并和腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)[5]。然而，USPs在乳腺癌中的作用及機制鮮有報道[6]。本研究探索USP41對MCF7乳腺癌細(xì)胞的作用效果及機制，旨在為促進(jìn)乳腺癌化療敏感度提供新的作用靶點，為乳腺癌個體化治療提供新的思路。

材料與方法

1.細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)及臨床樣本：人乳腺癌細(xì)胞MCF7購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)，細(xì)胞均經(jīng)過STR分型鑒定。MCF7細(xì)胞使用含10%胎牛血清，10μg/ml胰島素的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞均培養(yǎng)于37℃、5%CO2的環(huán)境中，每3天傳代一次。乳腺癌組織和癌旁組織取自空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院收治的乳腺癌患者。收集組織標(biāo)本后立即液氮冷凍備用。參與的患者在入組前均充分知情，本研究方案獲得了空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(倫理審批號：KY20213157-1)。

2.CCK-8實驗：應(yīng)用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞增殖評估，取對數(shù)生長期細(xì)胞，吸盡培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入1ml胰酶使其與細(xì)胞充分接觸，待細(xì)胞變圓后終止反應(yīng)，將細(xì)胞接種于96孔板，并在37℃、5%CO2條件下孵育過夜。待細(xì)胞貼壁，按分組處理，設(shè)復(fù)孔，孵育48h。棄原培養(yǎng)液，向每孔加100ml配好的CCK-8(1∶10)，溶液孵育3h，在450nm下，用酶標(biāo)儀測定吸光度，每個實驗重復(fù)進(jìn)行3次。

3.細(xì)胞克隆實驗：通過結(jié)晶紫染色進(jìn)行菌落形成實驗。將細(xì)胞以300個/皿的密度接種于6cm培養(yǎng)皿中，并在37℃、95%空氣和5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中孵育。兩周后，用PBS清洗細(xì)胞。菌落用甲醇固定10min，0.5%結(jié)晶紫染色15min。PBS洗滌10次后，倒置顯微鏡(CKX53，日本Olympus公司)下可觀察到明顯的細(xì)胞集落。排除含有少于50個細(xì)胞的菌落。

4.Transwell：使用Transwell小室進(jìn)行Transwell遷移試驗。將無血清培養(yǎng)基中的8×104個細(xì)胞接種到小室的上室中，小室的底部為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。孵育36h后，用甲醇固定細(xì)胞，并用Giemsa染色。然后擦去膜頂面的細(xì)胞，在倒置光學(xué)顯微鏡下檢查下表面的細(xì)胞。在100倍放大下計數(shù)10個隨機視野的細(xì)胞數(shù)量，定量遷移或侵襲細(xì)胞的數(shù)量。

5.RT-qPCR：使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)分離RNA，使用SuperScript Ⅲ(美國Invitrogen公司)和polyN引物，從1μg總RNA中生成cDNA。使用StepOne和StepOne Plus實時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)進(jìn)行qPCR。使用以下公式分析數(shù)據(jù)：R=2-(ΔCt樣品-ΔCt對照品，R：相對表達(dá)水平；ΔCt樣本：基因Δt與平均參考之間的差異；ΔCt對照：對照樣本中基因Ct與平均參考之間的差異)。

6.Western blot：收集細(xì)胞并用RIPA裂解緩沖液(100mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl pH值7.5，1%TritonX-100，1mmol/L EDTA，10mmol/L b-甘油磷酸鹽，2mmol/L釩酸鈉和蛋白酶抑制劑)裂解。使用micro-BCA蛋白測定法(Rockford，美國Pierce公司)測定蛋白濃度。通過12%SDS-PAGE分離40 lg蛋白/泳道，并電印跡到硝酸纖維素(德國Amersham Pharmacia公司)上。然后，用5%脫脂乳封閉膜，用抗USP41(1∶1000，美國Invitrogen公司)、RACK1(1∶1000,美國Proteintech公司)、β-actin(1∶1000,中國Servicebio公司)和GAPDH(1∶1000,美國Proteintech公司)抗體孵育。在冷藏室中用一抗孵育過夜。然后將膜與偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG(1∶5000，美國Sigma公司)的二抗孵育，并使用增強化學(xué)發(fā)光法(ECL，英國Amersham Pharmacia公司)顯色。

7.CoIP-MS：CoIP-MS用于探索與USP41的相互作用蛋白：(1)細(xì)胞裂解液與抗體孵育。(2)免疫復(fù)合物與蛋白A/G瓊脂糖樹脂結(jié)合。(3)去除非相互作用蛋白。(4)洗脫獲得蛋白相互作用復(fù)合物。(5)質(zhì)譜鑒定蛋白相互作用復(fù)合物。富集的免疫共沉淀產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜分析，去除評分為b20的肽，評分越高意味著與二級圖譜的匹配程度越好。在UniPro中檢索并定性比較肽。還評價了UniquePep計數(shù)和覆蓋百分比，作為最終鑒別結(jié)果的輔助指標(biāo)。

結(jié) 果

1.USP41在乳腺癌中顯著高表達(dá)：USP41在乳腺癌樣本及配對的癌旁檢測發(fā)現(xiàn)，USP41在癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(圖1)。

2.USP41促進(jìn)MCF7細(xì)胞增殖：為探索USP41對MCF7細(xì)胞的作用，筆者研究過表達(dá)及敲減USP41(圖2中A、B)。細(xì)胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)USP41過表達(dá)顯著促進(jìn)MCF7細(xì)胞增殖(圖2C)，USP41敲減后抑制細(xì)胞增殖(圖2D)。

圖2 USP41促進(jìn)MCF7細(xì)胞增殖

3.USP41過表達(dá)促進(jìn)MCF7細(xì)胞克隆形成：克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，USP41過表達(dá)顯著促進(jìn)MCF7細(xì)胞克隆形成，USP41敲減后抑制細(xì)胞克隆形成(圖3)。

4.USP41過表達(dá)促進(jìn)MCF7細(xì)胞遷移：細(xì)胞遷移實驗發(fā)現(xiàn)，USP41過表達(dá)顯著促進(jìn)MCF7細(xì)胞遷移，USP41敲減后抑制細(xì)胞遷移(圖3中C、D)。

圖3 USP41促進(jìn)MCF7細(xì)胞生長與遷移

5.USP41過表達(dá)抑制MCF7細(xì)胞凋亡：流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期與凋亡發(fā)現(xiàn)，USP41過表達(dá)顯著抑制MCF7細(xì)胞凋亡，USP41敲減后促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖4中A、B)。細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，USP41可阻滯MCF7細(xì)胞于G0/G1期(圖4中C、D)。

圖4 USP41抑制細(xì)胞凋亡以及阻滯細(xì)胞周期

6.USP41與RACK1直接相互作用：CoIP-MS檢測發(fā)現(xiàn)一系列可以與USP41直接作用的分子。LC-MS/MS下機后，將原始數(shù)據(jù)提交到質(zhì)譜儀連接的Proteinpilot軟件進(jìn)行檢索，過濾掉常見污染蛋白及與之匹配的肽段。最終得到FC>1.5的150個相互作用的分子。通過查閱文獻(xiàn)，筆者研究鎖定了10個可能有價值的分子。本研究針對其中的RACK1分子進(jìn)行功能驗證。研究發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁組織，RACK1在乳腺癌組織中明顯上調(diào)(圖5)。

圖5 USP41可能通過RACK1發(fā)揮作用

7.USP41通過RACK1發(fā)揮作用：抑制USP41表達(dá)發(fā)現(xiàn)RACK1表達(dá)顯著下調(diào)(圖6A)，抑制RACK1可使MCF7的細(xì)胞克隆形成能力明顯下降(圖6B)，細(xì)胞遷移能力亦顯著降低(圖6C)。過表達(dá)USP41，同時敲低RACK1發(fā)現(xiàn)(圖6D)，USP41促進(jìn)MCF7生長、克隆形成和遷移的能力顯著下降(圖6中E～G)，提示USP41可通過RACK1發(fā)揮促癌作用。

圖6 USP41通過RACK1發(fā)揮作用

討 論

USPs可以通過去泛素化穩(wěn)定多個癌基因，促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展和耐藥。Giovinazzi等[7]研究發(fā)現(xiàn)，USP7可調(diào)節(jié)有絲分裂關(guān)鍵調(diào)控分子促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展和對紫杉烷的耐藥。Soyeon等[8]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)USP8可通過去泛素化穩(wěn)定Notch1蛋白，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。USP3在乳腺癌中高表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)[9]。此外，USPs在不同乳腺癌類型中的表達(dá)存在差異，例如USP21在三陰性乳腺癌中表達(dá)顯著高于其他亞型[10]。USP41是USPs家族排名第41位成員，位于22號染色體長臂二區(qū)二帶。目前對USP41的研究相對較少，在TNBC中的作用更是鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，USP41在乳腺癌中顯著上調(diào)并參與調(diào)控MCF7細(xì)胞惡性表型，為促進(jìn)乳腺癌新型分子標(biāo)志物的探索及開發(fā)針對性靶向藥物提供參考。

多功能支架蛋白RACKl是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的必要蛋白，包含Trp-Asp (WD)重復(fù)蛋白家族，是有核細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞，錨定在特定亞細(xì)胞位置[11]。RACK1可結(jié)合并調(diào)節(jié)蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性，參與多種細(xì)胞內(nèi)信號通路。RACK1在不同癌種中可能發(fā)揮不同的功能，既發(fā)揮“抑癌基因”的角色，又具備“原癌基因”功能[12,13]。Fan等[14]研究發(fā)現(xiàn)RACK1可明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。與本研究結(jié)果一致，干擾RACK1可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖能力，提示RACK1對MCF7的惡性表型具有重要調(diào)節(jié)作用。因此，探討RACK1在細(xì)胞內(nèi)蛋白穩(wěn)定性如何調(diào)節(jié)可能是抑制乳腺癌惡性表型的另一個潛在方式。

與乳腺癌相關(guān)的USPs調(diào)節(jié)的信號通路更像是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路，其在介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移方面具有有據(jù)可查的作用[15]。Eichhorn等[16]研究顯示，USP15穩(wěn)定了TGF-β受體ⅰ，并通過激活TGF-β信號促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。2019年，張軍等[17]研究證明，USP4抑制阻止了TGF-β/Smad信號通路的活性。本研究發(fā)現(xiàn)USP41與RACK1相關(guān)。而RACK1被確定為TGF-β1的伴隨調(diào)節(jié)因子[18]。RACK1可以通過抑制TGF-β1/Smad信號通路來抑制瘢痕成纖維細(xì)胞中膠原的合成[19]。RACK1沉默被證明通過抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來減輕腎纖維化[20]。最重要的是，USP41可能通過與RACK1結(jié)合，通過TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮致癌作用。然而，RACK1調(diào)節(jié)乳腺癌的機制廣泛多樣。還需要進(jìn)一步的研究來探索其在USP41介導(dǎo)的乳腺癌進(jìn)展中的作用。

綜上所述，USP41在乳腺癌中顯著上調(diào)，與促進(jìn)MCF7惡性表型相關(guān)，并可能通過上調(diào)RACK1表達(dá)發(fā)揮作用。