付雯雯 吳嘉賀 胡笑容 江 洪

心肌梗死(myocardial infarction, MI)是冠心病中最嚴(yán)重的一種類型，具有高發(fā)生率和高致死率。醫(yī)療救治水平的提高使首次心肌梗死后生存率達(dá)到90%以上。然而，心肌梗死的復(fù)發(fā)率仍居高不下，第1年內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)17.4%[1]。多項臨床研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死的復(fù)發(fā)與患者新生血小板計數(shù)增加密切相關(guān)。血小板內(nèi)富含各種炎性細(xì)胞因子、血小板源性生長因子和血栓素。血小板被激活后通過釋放這些活性顆粒，促進(jìn)炎性細(xì)胞向動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)浸潤、遷移和增殖，加重動脈粥樣斑塊炎性反應(yīng)，甚至導(dǎo)致斑塊破裂，從而導(dǎo)致心肌梗死復(fù)發(fā)[2]。追尋血小板計數(shù)增加的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后骨髓巨核祖細(xì)胞數(shù)量、巨核細(xì)胞數(shù)量和成熟度均增加，形成血小板前體數(shù)量增多，而且巨核細(xì)胞在空間分布上更貼近血管內(nèi)皮[3]。這些結(jié)果提示，巨核細(xì)胞增殖、發(fā)育以及生成血小板計數(shù)增加。進(jìn)一步探索干預(yù)心肌梗死后骨髓巨核細(xì)胞增殖發(fā)育以及血小板過度生成的機(jī)制對于改善心肌梗死預(yù)后具有重要意義。

白細(xì)胞介素33(interleukin-33, IL-33)是屬于IL-1家族的一種炎性細(xì)胞因子，主要表達(dá)于人類血管內(nèi)皮細(xì)胞，以及胃腸道和肺氣道上皮細(xì)胞。IL-33在心肌細(xì)胞中亦有表達(dá)。有研究表明，IL-33對動脈粥樣硬化有保護(hù)作用。額外給予IL-33，可延緩ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化進(jìn)展，體現(xiàn)在冠狀動脈管腔狹窄的嚴(yán)重程度有所減輕，以及保護(hù)性炎性細(xì)胞因子釋放增加，包括IL-4、IL-5和IL-13[4]。另外，IL-33對心肌梗死早期炎性反應(yīng)也有減輕作用。但另有研究表明，IL-33信號可能具有有害作用。急性心肌梗死后，心臟組織IL-33水平升高。心肌梗死小鼠接受IL-33注射后，出現(xiàn)心臟功能惡化、心室重塑加重等不良結(jié)果。同時，IL-33還導(dǎo)致小鼠心肌梗死面積增加，加重心肌細(xì)胞死亡以及心臟破裂致死率[5]。而心肌梗死后的巨核細(xì)胞增殖與血小板過度生成可加重心肌梗死預(yù)后[3,6,7]。關(guān)于IL-33是否影響心肌梗死后巨核細(xì)胞增殖以及生成血小板，目前尚不清楚。本研究旨在探討IL-33對心肌梗死后骨髓巨核細(xì)胞增殖、生成血小板的影響。

材料與方法

1.實驗動物：SPF級C57BL6雄性小鼠，9～11周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006]。所有小鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，保證飲食、清潔。實驗過程嚴(yán)格按照武漢大學(xué)以及武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗規(guī)章制度執(zhí)行。

2.抗體與試劑：CD41-FITC抗體、VE-Cadherin抗體購自美國eBioscience公司，CD42-APC抗體購自美國Biolegend公司。IL-33蛋白購自英國Abcam公司。血小板生成素(thrombopoietin,TPO) ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司。

3.心肌梗死模型的建立： C57BL6小鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，后背位固定，氣管插管連接小動物呼吸機(jī)，頻率120次/分鐘，潮氣量150μl。連接多導(dǎo)儀，持續(xù)記錄心電圖、心率變化。緊靠胸骨正中于左側(cè)第4肋間打開胸腔，暴露心臟，剪開心包膜，于左心耳與肺動脈圓錐中點至心尖連線中上1/3處用穿有8-0縫合線的彎針勾繞并結(jié)扎冠狀動脈左前降支(left anterior descending,LAD)，造成心肌梗死，以心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高以及心肌表面局部由紅潤變成發(fā)紺，則心肌梗死模型成功。逐層縫合胸腔，麻醉復(fù)蘇。

4.IL-33蛋白預(yù)處理：IL-33處理組小鼠經(jīng)腹腔注射IL-33蛋白(50μg/kg)連續(xù)14天，對照組小鼠腹腔注射同等劑量磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)連續(xù)14天。然后兩組小鼠分別進(jìn)行心肌梗死造模。

5.骨髓免疫熒光染色：3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠后，頸椎脫臼處死小鼠，取股骨經(jīng)4%多聚甲醛浸泡固定后，液氮凍存。冷凍切片機(jī)切割直至骨髓充分暴露，室溫放置片刻后取出骨組織，進(jìn)行免疫熒光染色。分別使用CD41-FITC與CD42-APC孵育標(biāo)記。染色完畢后，用高分辨率共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行成像，統(tǒng)計圖像中巨核細(xì)胞數(shù)量以及生成的血小板前體數(shù)量。CD41+CD42+標(biāo)記成熟巨核細(xì)胞，CD41+CD42-標(biāo)記未成熟巨核細(xì)胞。

6.流式細(xì)胞術(shù)：分離提取小鼠原代骨髓細(xì)胞，加入CD41-FITC (5微升/106個細(xì)胞)與CD42-APC(5微升/106個細(xì)胞)孵育30min后，洗去抗體。采用美國BD公司流式細(xì)胞儀檢測CD41+CD42+細(xì)胞與CD41+CD42-細(xì)胞數(shù)量，F(xiàn)lowjo軟件分析數(shù)據(jù)。

7.血小板計數(shù)：經(jīng)小鼠尾靜脈抽取50～70μl經(jīng)ETDA抗凝血，用全血細(xì)胞計數(shù)儀檢測血小板計數(shù)。

結(jié) 果

1.IL-33處理對MI小鼠循環(huán)血液中血小板計數(shù)的影響：心肌梗死造模1天和3天后，IL-33處理組小鼠的血小板計數(shù)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這提示IL-33對心肌梗死后血小板生成無顯著影響(圖1)。

圖1 IL-33處理對心肌梗死小鼠血小板計數(shù)的影響

2.IL-33處理對MI小鼠骨髓巨核細(xì)胞的影響：心肌梗死造模3天后，免疫熒光染色檢測IL-33處理組小鼠骨髓成熟巨核細(xì)胞(CD41+CD42+)與未成熟巨核細(xì)胞(CD41+CD42-)數(shù)量均高于對照組。同樣的，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測也發(fā)現(xiàn)IL-33處理組小鼠骨髓成熟巨核細(xì)胞與未成熟巨核細(xì)胞占全骨髓細(xì)胞的比例升高，這提示IL-33處理使心肌梗死后骨髓內(nèi)巨核細(xì)胞增多(圖2中A～F)。

3.IL-33處理對MI小鼠骨髓中血小板前體(proplatelet)的影響：心肌梗死造模3天后，采用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，IL-33處理組小鼠骨髓巨核細(xì)胞生成的血小板前體數(shù)量與對照組比較未見明顯變化。血小板前體為巨核細(xì)胞胞質(zhì)延長的偽足樣結(jié)構(gòu)，伸入血管竇，末端脫落形成血小板，因此可代表巨核細(xì)胞生成血小板能力。這一結(jié)果進(jìn)一步提示IL-33不影響心肌梗死后的血小板生成(圖2G)。

圖2 IL-33處理對心肌梗死小鼠成熟巨核細(xì)胞和未成熟巨核細(xì)胞的影響

4.IL-33處理對MI小鼠血清TPO水平的影響：TPO是目前已知最強(qiáng)效的促巨核系增殖與血小板生成的因子[8]。筆者采用ELISA檢測小鼠血清TPO水平，發(fā)現(xiàn)IL-33處理組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這提示IL-33不影響小鼠血清TPO水平(圖3)。

圖3 IL-33處理對心肌梗死小鼠血清TPO水平的影響

討 論

IL-33是一種介導(dǎo)免疫應(yīng)答的炎性細(xì)胞因子，在炎癥、感染等刺激下，IL-33作為一種內(nèi)源性危險信號，在細(xì)胞損傷或壞死后釋放，促進(jìn)免疫細(xì)胞的募集以及組織修復(fù)，在機(jī)體固有免疫與適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用[9～12]。除了誘導(dǎo)促炎性反應(yīng)外，IL-33還通過啟動Th2型免疫反應(yīng)在同種異體移植物存活期間發(fā)揮關(guān)鍵作用，以及促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集和吞噬以對抗嚴(yán)重膿毒癥[13]。IL-33的受體是ST2(suppression of tumorigenicity 2)。IL-33通過與ST2受體結(jié)合，進(jìn)而與IL-1受體輔助蛋白結(jié)合，激活包括MYD88、IRAK1、IRAK4、TRAF6在內(nèi)的信號蛋白復(fù)合物形成，從而激活NF-κB和有絲分裂原活化蛋白激酶(ERK、p38和JNK)等信號通路，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的增殖、存活、遷移，并促進(jìn)IL-4、IL-5和IL-13等炎性細(xì)胞因子以及一些趨化因子的釋放[14, 15]。心肌梗死后，一系列免疫細(xì)胞以及免疫因子被激活，其中包括IL-33，其在心肌梗死后表達(dá)升高[5]。關(guān)于IL-33對心肌梗死預(yù)后有利還是有害，目前尚有爭議。體外給予IL-33可延緩ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進(jìn)展，表明IL-33對心血管疾病有保護(hù)作用。但也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-33可致心肌梗死小鼠心臟功能惡化。

因血小板在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，本研究從另一個角度出發(fā)，探討IL-33對血小板生成的作用。血小板由巨核細(xì)胞產(chǎn)生。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL-33可以調(diào)控巨核細(xì)胞的免疫分化，使巨核細(xì)胞具有類似免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的表型[16]。然而尚無研究表明，IL-33是否可以影響巨核細(xì)胞增殖、分化與血小板生成。既往的研究結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)IL-33有直接促進(jìn)MK生成血小板的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-33使心肌梗死小鼠骨髓內(nèi)巨核細(xì)胞與巨核祖細(xì)胞的數(shù)量增多，但血小板計數(shù)無明顯變化，TPO水平也無改變。這提示IL-33可能通過不依賴TPO的途徑促進(jìn)心肌梗死后骨髓巨核細(xì)胞增殖，但不影響血小板生成。

因時間、材料有限，本研究暫未進(jìn)一步探討IL-33促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖的機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-33受體ST2表達(dá)于造血干、祖細(xì)胞表面[17,18]。ST2-/-小鼠與野生型小鼠比較，其骨髓中，粒系-巨噬系、紅系和多潛能祖細(xì)胞數(shù)量都有所減少，同時，這些細(xì)胞的增殖能力也有所降低，這提示IL-33/ST2有促進(jìn)骨髓造血干、祖細(xì)胞增殖的作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-33對心肌梗死小鼠巨核細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，與既往研究結(jié)果相符合。在哮喘患者中，IL-33可誘導(dǎo)骨髓來源的CD34+造血祖細(xì)胞向基質(zhì)衍生因子-1α(stromal derived factor-1α, SDF-1α)梯度遷移[19]。因此，IL-33也可能通過促進(jìn)造血干、祖細(xì)胞遷移至SDF-1α高濃度的血管龕周圍，從而促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖與分化，使巨核細(xì)胞數(shù)量增多。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-33可促進(jìn)心肌梗死后小鼠骨髓中巨核細(xì)胞增殖，但不影響其生成血小板，對于深入理解心肌梗死后IL-33對骨髓造血系統(tǒng)產(chǎn)生的影響具有一定意義。心肌梗死后血小板的過度生成是造成心肌梗死不良預(yù)后的重要原因之一[20]。因此，本研究結(jié)果提示，IL-33可能不通過干擾血小板生成來影響心肌梗死預(yù)后。