于海濤，劉 娜，李瑞環(huán)，徐石勇，黃鳳軍，趙 新

（1.天津市農業(yè)科學院 種質資源與生物技術研究所，天津 300381；2.天津市東麗區(qū)產品質量監(jiān)督檢驗所，天津 300300）

隨著消費者生活水平的提高以及日常飲食習慣的多樣化，食品安全問題日漸成為社會關注的焦點[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，在全球范圍內每年約6億人患食源性疾病，因其導致死亡的人數(shù)約42萬人[2]。研究表明，微生物也是我國食源性疾病的主要誘發(fā)因素，其潛在的食品安全隱患不容忽視[3-5]。

食源性致病菌在自然界分布廣泛，近幾年國內外已發(fā)生多起由食源性致病菌引起的生物安全事件[6-11]。例如，2016年美國因黃瓜暴發(fā)沙門氏菌疫情[12]，導致至少907人感染，其中6人死亡，204人住院。2000年日本金黃色葡萄球菌腸毒素導致的“血印乳品”事件[13]，14 000多人受感染，國內外金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒每年都有發(fā)生[14]。由此可見食源性致病菌是引起食物中毒的重要因素，因此調查即食生鮮果蔬中的病原微生物顯得尤為重要。

黃瓜作為北方居民餐桌上常見的蔬菜，多以生食為主，因其營養(yǎng)豐富，深得廣大消費者的喜愛。由于其表面不光滑，紋路較多，很容易寄生各種細菌，另外黃瓜生長期較短，成熟過程中需要的肥料、灌溉水和土壤也是黃瓜中的食源性致病菌的主要來源[15-19]。因此，加大對黃瓜及種植投入品中的食源性致病菌篩查也十分重要。

本研究通過采集天津地區(qū)生產環(huán)節(jié)和市場環(huán)節(jié)的黃瓜樣本，對其進行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7的測定，確定天津地區(qū)黃瓜的主要風險因子為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，由于國內外至今暫未發(fā)布沙門氏菌的定量檢測標準，本研究僅對有定量檢測標準的金黃色葡萄球菌進行監(jiān)測，通過應用IPMP 2014對金黃色葡萄球菌構建預測生長模型[20]，通過@Risk6風險評估軟件對其進行QMRA污染水平分析[21-22]，最終提出合理性建議，保證消費者的食用安全。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2017—2019年，在天津市西青區(qū)選擇2個黃瓜生產基地作為采樣點，按照無菌采樣原則采集60份黃瓜樣本及38份基質、井水、營養(yǎng)液等基地交叉污染樣本。并在天津市南開區(qū)、河西區(qū)、河北區(qū)、河東區(qū)、西青區(qū)和東麗區(qū)的大型農貿市場，按無菌采樣原則隨機采集黃瓜樣本98份。以上樣品均用無菌袋封閉，放于低溫樣品箱中保存，在6 h內運至實驗室，24 h內完成檢測。

1.2 培養(yǎng)基與儀器設備

緩沖蛋白胨水（BPW），四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液，亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液，亞硫酸鉍（BS）瓊脂，HE瓊脂，木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂，生化鑒定試劑盒；7.5%氯化鈉肉湯，血瓊脂平板，Baird-Parker瓊脂平板；李氏增菌肉體LB（LB1，LB2），1%鹽酸吖啶黃溶液，1%萘啶酮酸鈉鹽，PALCAM瓊脂，生化鑒定試劑盒；改良EC肉湯，改良山梨醇麥康凱瓊脂，大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂，生化鑒定試劑盒等均購自北京陸橋技術有限責任公司。

拍擊式均質器（上海之信儀器有限公司），全自動高壓滅菌鍋（日本YAMATO有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒有限公司），電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），電動移液器（Thermo有限公司），生物安全柜（ESCO公司），超凈工作臺（蘇州金燕凈化設備有限公司），OLYMPUS CX31顯微鏡（奧林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 致病菌篩查 黃瓜及基地交叉污染樣本中沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，單核細胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7的分離鑒定分別基于國家標準GB/T 4789.4—2016，GB/T 4789.10—2016，GB/T 4789.30—2016，GB/T 4789.36—2016[23-26]。

1.3.2 膳食問卷調查 針對天津地區(qū)的居民設計1份調查問卷，采用隨機發(fā)放的原則選取100人進行膳食調研，問題包括購買黃瓜后當天食用量、存放溫度、存放時間、家庭用餐人數(shù)、人均每餐食用量、人均每星期黃瓜食用次數(shù)、常去攤位日銷量，由此了解天津地區(qū)居民對黃瓜的消費情況。

1.3.3 預測模型構建 無菌環(huán)境下將黃瓜切成小丁，紫外滅菌30 min，稱取20 g于無菌均質袋中，再用無菌吸管吸取1 mL濃度為2×104CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌均勻的接種于均質袋中的黃瓜丁上，使黃瓜丁的帶菌量為1×103CFU·mL-1。將接種后的黃瓜丁分別放于10、15、20、25、30、35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照預定時間間隔取樣，進行菌落計數(shù)。應用IPMP 2014中的Huang Model對試驗數(shù)據(jù)進行生長曲線的擬合，建立一級預測模型，其中一級預測模型（Huang Model）的表達式為：

式中，t，時間(h)；Y(t)，t時的菌數(shù)(ln CFU·g-1)；Y0，初始菌數(shù)(ln CFU·g-1)；Ymax，最大菌數(shù)(ln CFU·g-1)；μmax，最大比生長速率(ln CFU·g-1·h-1)；λ，延滯期時間（h）；α，延滯期變異系數(shù)為4。

應用IPMP 2014中的Arrhenius-type對金黃色葡萄球菌的最大比生長速率與溫度進行生長曲線的擬合，建立二級預測模型，其中二級預測模型（Arrhenius-type）的表達式為：

式中，μmax，最大比生長速率(ln CFU·g-1·h-1)；T，特定生長溫度(℃)；R，氣體常數(shù)（8.134 J·mol-1）；△G’，與細菌生長有關的一種動能；a和n，模型的參數(shù)。

1.3.4 污染水平分析 為便于計算，當黃瓜試樣中金黃色葡萄球菌濃度低于最低檢出限時，假設金黃色葡萄球菌菌量為最低檢出限的50%(5 CFU·g-1)。定性陽性，而定量為陰性的黃瓜試樣，實際待菌量低于10 CFU·g-1時，假設金黃色葡萄球菌菌量為10 CFU·g-1。結合IPMP 2014構建的一級模型、二級模型及膳食調查結果，獲得不同溫度條件下金黃色葡萄球菌的最大比生長速率。應用@Risk 6風險評估軟件設置變量參數(shù)，進行黃瓜中金黃色葡萄球菌定量風險評估，結合現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析黃瓜中金黃色葡萄球菌污染水平。

2 結果與分析

2.1 篩查結果

對采集的黃瓜樣本及基地交叉樣本進行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7篩查，經檢驗僅市場環(huán)節(jié)的黃瓜中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有不同程度的檢出，金黃色葡萄球菌檢出比例為2/196，污染量分別為210、3 000 CFU·g-1；沙門氏菌檢出比例為1/196。致病菌篩查結果如表1所示。

表1 天津地區(qū)黃瓜中致病菌篩查結果

2.2 膳食調查結果

根據(jù)天津地區(qū)居民食用黃瓜的消費習慣，并結合@Risk 6軟件對風險因素的分析，設置7道問題，隨機抽取100人進行調研，具體匯總結果如表2。

表2 問卷調研結果匯總

2.3 預測模型構建

通過建立不同溫度條件下黃瓜中金黃色葡萄球菌的生長模型，每隔一定的時間進行沙門氏菌定量檢測，獲得其在10、l5、20、25、30、35℃下的生長數(shù)據(jù)，應用IPMP軟件進行擬合，以定量描述特定環(huán)境條件下對金黃色葡萄球菌在黃瓜上的生長、殘存和死亡動態(tài)，從而對金黃色葡萄球菌的存活情況做出較為科學的預測，為監(jiān)控即食黃瓜的食品安全和風險評估提供參考，為下一步的風險概率分析提供了技術支撐，具體模型見圖1、圖2。

圖1 黃瓜中金黃色葡萄球菌二級模型

圖2 黃瓜中金黃色葡萄球菌一級模型

2.4 污染水平分析

研究表明，食物中金黃色葡萄球菌的濃度大于105CFU·g-1時即可產生致病的腸毒素[27]，引發(fā)食物中毒，出現(xiàn)嘔吐、惡心、腹痛、腹瀉等癥狀。因此，把105CFU·g-1認為導致金黃色葡萄球菌食物中毒的最小濃度。

結合黃瓜中金黃色葡萄球菌的篩查結果、家庭食用黃瓜的膳食調研結果、金黃色葡萄球菌食物中毒診斷標準（105CFU·g-1）以及金黃色葡萄球菌預測模型參數(shù)，設置黃瓜中金黃色葡萄球菌QMRA污染水平分析，模型中的參數(shù)分布均以@Risk 6軟件的語法設立，具體見表3。經@Risk 6軟件10 000次迭代模擬天津地區(qū)黃瓜食用時金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布為86.0%在0.00～5.00 log CFU·g-1，超過中毒診斷標準5.00 log CFU·g-1的風險概率為14.0%，具體見圖3。

表3 污染水平QMRA模型

圖3 黃瓜中金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布

針對天津地區(qū)黃瓜的初始污染水平篩查結果，應用@Risk 6風險評估軟件，筆者發(fā)現(xiàn)，貯藏溫度、貯藏時間、最大生長量與污染比例/概率分布的相關系數(shù)依次為0.73、0.61、0.03，其中貯藏溫度/概率分布相關性最大，其次為貯藏時間，如圖4所示。

圖4 黃瓜中金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布相關系數(shù)

為了降低風險概率，參考最終污染量/概率分布相關系數(shù)，控制關鍵變量，如將貯藏時間嚴格控制在24 h食用完畢，經@Risk 6軟件10 000次迭代，模擬天津地區(qū)居民食用黃瓜時金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布為94.0 %在5.00 log CFU·g-1以下，超過中毒診斷標準5.00 log CFU·g-1的風險概率為6.0%，具體見圖5；如將貯藏溫度嚴格控制在冰箱6℃保存，金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布為99.0%在5.00 log CFU·g-1以下，具體見圖6。因此，控制相關性最大的貯藏溫度，可有效地保證天津地區(qū)的黃瓜在現(xiàn)有100份居民食用習慣調研數(shù)據(jù)下的食用安全性。

圖5 黃瓜24 h食用完畢黃瓜中金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布

圖6 黃瓜冰箱6℃貯藏方式下金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布

3 結論與討論

近年來，由食源性致病菌引起的食物中毒事件不斷增加，食源性疾病日漸成為威脅人們健康和生命安全的關鍵因素，國內外一些實驗室已對食源性致病菌的定量風險評估進行試驗[28-30]。本研究通過對天津市生產環(huán)節(jié)、市場環(huán)節(jié)的黃瓜進行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7的檢測，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有不同程度的檢出，檢出比例分別為2/158和1/158，其他2種菌均未檢出，確定天津地區(qū)黃瓜中的主要風險因子為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。雖檢出比例不高，但對天津地區(qū)即食生鮮果蔬的食品安全來說仍存在一定的風險隱患。

本研究通過對生產環(huán)節(jié)和市場環(huán)節(jié)的黃瓜進行食源性致病菌的篩查，并對主要風險因子進行污染水平分析，其試驗數(shù)據(jù)可為居民食用提供參考。但還缺少對種植、運輸過程中金黃色葡萄球菌的評估，不能對黃瓜“農田到餐桌”的全程進行定量風險評估，在未來的試驗中還需進一步完善。

通過應用@Risk6風險評估軟件，設置黃瓜中金黃色葡萄球菌QMRA污染水平分析，筆者發(fā)現(xiàn)，貯藏溫度與最終污染量/概率分布相關性最大，其次為貯藏時間。因此，建議居民最好在購買黃瓜后全部冰箱低溫保存，以降低微生物的生長速度，有效降低居民食用黃瓜感染金黃色葡萄球菌的風險概率；其次，如果不能滿足冰箱保存的條件，建議居民在購買后24 h內食用完畢，以保障居民的食用安全。